פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

פרופיל מרחבי דיגיטלי, או DSP, מציע שיטה יעילה לכימות חלבונים מרובד מרחבית. יישומו מאפשר לנו לאפיין את ביטוי החלבון על פני אזורים שונים של הגידול והמיקרו-סביבה. תכונה מרכזית של DSP היא יכולת הריבוב שלו, המאפשרת עיבוד נתונים בתפוקה גבוהה.

היכולת להגדיר אזורי עניין מותאמים אישית מספקת בנוסף ממד מרחבי לניתוח נתונים. DSP יכול להיות מיושם על כל דגימה שבה כימות מרחבי חלבון, או ביטוי RNA עשוי לעזור להבהיר תהליך פתולוגי, או פיזיולוגי. זה רלוונטי במיוחד באונקולוגיה, שם השתנות היעד האזורית עשויה להיות מתואמת עם צמיחה ממאירה, או פלישה.

המדגימים את ההליך יהיו סקוט פליסול, היסטוטכנולוגית, ורייצ'ל בארני, טכנולוגית גנומית. כדי להכין שקופיות, התחל על ידי לקיחת כמה ליבות של שני מילימטרים מכל ביופסיה, והכנסתן לבלוק מיקרו-מערך רקמתי יחיד. חותכים חלקים של ארבעה מיקרון מהבלוק, ומרכיבים אותם על מגלשות זכוכית.

הניחו כל שקופית בתוך אטם מחזיק השקופיות, ודגרו אותו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במערכת IHC האוטומטית למחצה, מלא את המיכל במצב אחד עם 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל שקופית, בתוספת חמישה מיליליטר של נפח מת, והשאר את המכסה פתוח. מלא את אותה כמות של תמיסת חסימה במיכל במצב שתיים.

טען את מגש מיכל הריאגנטים על המכשיר. בחר את תהליך IHC, ולאחר מכן חסום את שם הפתרון בתיבה הנפתחת של השדה סמן. לאחר שתסיים עבור כל השקופיות, לחץ על סגור.

לאחר מכן לחץ על הדפס תוויות, סמן את כל תוויות השקופיות שעדיין לא הודפסו, ולחץ על הדפס. הדבק תוויות לחלק העליון של השקופיות. טען את השקופיות על מגש השקופיות, כדי להבטיח את פני הדגימה והתווית כלפי מעלה.

לחץ על לחצן ה-LED כדי להנמיך את המגש, ואפשר למכשיר להתחיל בסריקה ובזיהוי של שקופיות. לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל את הניסוי. בסיום הריצה, לחץ על לחצן ה-LED כאשר הוא מהבהב בירוק.

הסר את המגש מהמכשיר והרם בזהירות את אריחי הכיסוי מכל שקופית. מקמו את השקופיות במי מלח עם אגירת פוספט 1X. הסר את המאגר העודף, והתווה כל מקטע רקמה בעט הידרופובי כדי ליצור מחסום הידרופובי.

צור תמיסת אוליגו PC נוגדנים על ידי הוספת שמונה מיקרוליטרים מכל נוגדן לכל שקופית ושימוש ב- Buffer W כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן החל את תמיסת אוליגו PC נוגדנים על השקופיות ודגירה של המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הניחו את המגלשות במגש לח, ושטפו שלוש דקות במשך 10 דקות ב-1X TBST.

לאחר תיקון ב-4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן יש לשטוף פעמיים במשך חמש דקות ב-1X TBST. יש להוסיף כתם גרעיני SYTO 13 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 1X TBST. רחף עם העכבר מעל איסוף נתונים במרכז הבקרה ובחר חדש, או המשך הפעלה.

מקם את השקופית במחזיק השקופיות עם התווית לכיוון המשתמש. הנמיכו את מהדק מגש ההחלקות, וודאו שהרקמה נראית בחלון המוארך. הוסף שישה מיליליטר של Buffer S.בצע את ההנחיות במרכז הבקרה.

התקרב בין צירים שונים באמצעות המחוונים x ו- y כדי לתחום אזור לסריקה. בחרו 'סרוק', ואפשרו לסריקה להמשיך עד שכל אזור היעד שהוגדר צולם. צור תמונה של 20 פעמים.

הגדר את ה- ROIs על-ידי בחירת שלושה ROIs עגולים בגודל שווה בקוטר של 250 מיקרומטר עבור כל ליבת רקמה. אשר את ה- ROIs על-ידי לחיצה על לחצן יציאה מסביבת עבודה של סריקה. לאחר מכן המתן לאור ה- UV כדי לבקע את האוליגוס מהנוגדנים.

לאחר השלמת תהליך מכשיר הניקוי, בחר איסוף נתונים חדשים כדי להמשיך עם השקופיות או הלוח הנוכחיים. פתח את חלון הלוח הסופי על ידי לחיצה כפולה על אזור סמל הלוחית. הזן את מספר הלוט של חבילת קוד ההיברידיות ולחץ על עדכן.

לאחר מכן לחץ על סיום. נתק את מחזיק השקופיות ואת לוח האיסוף על-ידי ביצוע ההנחיות. אחסן את השקופיות ב- TBST, או כסה אותן במדיום מימי והחלקת כיסוי לאחסון לטווח ארוך.

אטמו את הצלחות באמצעות חותם חדיר וייבשו את השואפות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במתקן תרמי כשהחלק העליון פתוח. מוסיפים שבעה מיקרוליטרים של מים מטופלים בדיתיל פירוקרבונט ומערבבים. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן הסתחררו במהירות.

הכן את תערובת מאגר הבדיקה על-ידי בחירת משוואות הבדיקה R ו- Probe U המתאימות המיישמות את המשוואה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 84 מיקרוליטרים של תערובת מאגר בדיקה לכל חבילת קוד היברידיזציה. בלוח הכלאה רענן של 96 בארות, הוסף שמונה מיקרוליטרים של כל תערובת מאסטר של קוד הכלאה לכל 12 הבארות של השורה המצוינת.

העבר שבעה מיקרוליטרים מצלחת האיסוף DSP לבאר המתאימה בלוח ההכלאה. אטמו את החום, סובבו את הצלחת ודגרו עליה למשך הלילה בחום של 67 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מקררים את הצלחת על קרח, ומבצעים סיבוב מהיר.

איחד את מוצרי ההכלאה מכל באר לתוך צינור רצועה, תוך ניפוח עדין של כל באר חמש פעמים. סובבו כלפי מטה, והעמיסו את צינורות הרצועה לתוך מערכת הניתוח. במכשיר DSP, שמור את קובץ ה- CDF בכונן USB והעבר את הנתונים למנתח הדיגיטלי.

על המסך, לחץ על התחל עיבוד. בחר רגישות גבוהה ואחריה הבא. לחץ על בחר הכל עבור מספר הבארות עם דוגמאות, לאחר מכן על סיום, ולאחר מכן על הבא בהודעת הדואר האלקטרוני.

לאחר מכן לחץ על התחל. לאחר סיום תחנת ההכנה, אטם את המחסנית והעבר אותה למנתח הדיגיטלי. לחץ על התחל לספור.

בחר מיקום במה. הקש על טען קובץ CDF קיים ובחר קובץ שהועלה בעבר. לחץ על סיום.

בחר/י שוב ״מיקום שלב״, לחץ/י על ״סיום״ ולאחר מכן על ״התחל״ כדי להפעיל את התוכנית. שמור את קובץ ה-ZIP של קובצי ההמרה של ספירת הכתבים ממערכת הניתוח לכונן USB. הכנס את הכונן למחשב DSP.

במרכז הבקרה של DSP, רחף מעל איסוף נתונים ולאחר מכן לחץ על העלה חשבונות. בחר את קובץ ה-ZIP הרלוונטי. לחץ על רשומות במרכז הבקרה של DSP.

כדי להציג סריקות בתור, בחר הוסף סריקות נבחרות לתור ולאחר מכן את תור הניתוח שלי. בחר מחקר חדש מהתור על-ידי ריחוף מעל האפשרות ניתוח נתונים במרכז הבקרה. ניסוי DSP בוצע על דגימות של גליובלסטומה, והתוצאות הודגמו כמפת חום.

שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. רמת הביטוי מתוארת על-ידי טווח צבעים המשתנה מכחול, המציג הבעה נמוכה, לאדום, המציין ביטוי גבוה. השתנות הצבע בשורה משקפת הטרוגניות של חלבונים אזוריים, ומציעה קשר מרחבי אפשרי עם ביטוי חלבון דיפרנציאלי.

בניסוי זה, S100 ו- CD-56 היו גבוהים באופן אוניברסלי, מכיוון שהם סמנים עצביים. סמנים עם השונות הרבה ביותר כוללים B7-H3, KI-67, CD-44 ופיברונקטין, אשר ידועים כקשורים להתפשטות גידולים, נדידה וגרורות. מתוך מגוון רחב של יעדים מועמדים, DSP יכול לזהות את אלה המציגים שונות אזורית משמעותית.

זה מניח את היסודות לחקר גורמים הקשורים לשונות והרלוונטיות שלהם למחלות.