בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

הארבה הנודד הוא מבחן חקלאי חשוב. שיטה זו מספקת פרוטוקול יעיל וקל לתפוקה עבור שיטות לחץ הגן של זוהי שיטה שיטתית ומפורטת של בניית CRISPR/CAS9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כולל איסוף ביציות, סינון מוטנטי ושמירה הומוזיגוטית. כדי להתחיל, להכין את מחטי הזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מיקרו פיפטה.

הגדר את הפרמטרים כמתואר בכתב היד של הטקסט, ולאחר מכן טחן את קצה מחט ההזרקה באמצעות מטחנת מיקרו. הכן חלבון ריבונוקלאו להזרקה על ידי ערבוב מיקרוליטר אחד של חלבון Cas9 עם מיקרוליטר אחד של RNA מדריך יחיד מאומת. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של המים הסטריליים החופשיים של RNA כדי ליצור את הנפח הסופי של התערובת, 10 מיקרוליטר.

מערבבים היטב את התמיסה ומניחים אותה על קרח. לאחר מכן, אספו את תרמילי הביצים הטריים שהונחו מתרמיל מיקום הביציות, והמתינו לשיזוף ביצים. לאחר 30 דקות, השתמשו במברשת עדינה כדי לבודד את הביצים מתרמילי הביצים במים, ושטפו את הביצים שלוש פעמים במים סטריליים.

לאחר מכן מניחים את הביצים בצלחת פטרי ומוסיפים מים סטריליים כדי לשמור עליהם לחים. מלא את מחט ההזרקה בתמיסת חלבון ריבונוקלאו מוכנה, וטען את ההזרקה למיקרו מניפולטור. הגדר את הפרמטרים של מיקרו-הזרקה כ-300 הקטופסקלים של לחץ הזרקה, 0.5 שניות של זמן הזרקה ו-25 הקטופסקלים של לחץ פיצוי.

כאשר הפרמטרים מוגדרים, לחץ על הדוושה כדי להעריך את עוצמת הקול של התמיסה המוזרקת. התאם את לחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה כדי להבטיח שנפח ההזרקה הוא כ- 50 עד 100 ננוליטר. לאחר סידור הביצים הסטריליות באופן קבוע על כרית ההזרקה, הניחו את הפד על שולחן האובייקטים במיקרוסקופ והתאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ עד לצפייה בביצים.

לאחר מכן התאימו את מחט המיקרו-הזרקה מתחת למיקרוסקופ עד שניתן יהיה לראות את קצה ההזרקה ולמקם את הקצה ליד הביצה להזרקה. התחל את ההזרקה בגובה מתאים ובזווית של 30 עד 45 מעלות. הכניסו את החוד לתוך הביצה ליד ערימות המיקרו של הביצה ולחצו על הדוושה כדי להשלים את ההזרקה.

לאחר מכן, משכו את המחט במהירות והזיזו את כרית ההזרקה להזרקת הביצית הבאה. מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית בעזרת פיסת נייר פילטר לח. הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

לאחר ההזרקה, לבדוק את התפתחות הביצים המוזרקות כל יום. מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית חדשה כל 24 שעות בחמשת הימים הראשונים. ביום השישי לאחר ההזרקה, יש לקטוף ולהעביר באופן אקראי 10 ביצים לתוך צינור ולטחון כראוי את הביצים עם שני כדורי פלדה במהירות של 60 הרץ למשך שש דקות באמצעות מטחנה.

לאחר השחזה, להשעות מחדש את הפסולת במיליליטר PBS אחד. לאחר מכן להעביר חמישה מיקרוליטרים של תערובת מרחף לתוך 45 מיקרוליטר של 50 מילימולר הידרוקסיד נתרן ליז ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. כדי לסיים את תגובת הליזה הבסיסית, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת למערכת הליזיס.

קח מיקרוליטר אחד של מוצר הליזיס כתבנית PCR כדי להגביר את מקטע גן המטרה. לאחר ה-PCR והריצוף, השוו את תוצאות הריצוף עם רצף הסוג הפראי כדי להעריך אם מערכת CRISPR/Cas9 קרעה את גן המטרה in vivo. לאפשר את שאר הביציות להתפתחות הבאה כמו indels מזוהים בשלב העוברי.

לאחר פיתוח, העברה ותרבית הנימפות שבקעו לכלוב גידול כמתואר בכתב היד. כאשר הנימפות מתפתחות לשלב האינסטאר החמישי, הפרידו אותן בעזרת כוסות תרבית פלסטיק. בצע הכלאה צולבת באמצעות מוטנטים G0 וארבה מסוג בר.

לאחר איסוף נאות מדבר, השתמשו בשלוש עד שש ביציות מפותחות בכל או-אסיסט כדי לזהות מוטציות כפי שתואר קודם לכן. שמור על נאות מדבר חיוביים למוטציה להתפתחות הבאה ונטוש את נאות המדבר השליליים של המוטציה. לשימור בהקפאה, שוטפים את הביצים במים סטריליים ודגרים עליהן בכלי תרבית כפי שהוסבר קודם.

לאחר חמישה עד שישה ימים, אוספים את הביצים יחד בצלחת התרבית, ומכסים אותן בשברי נייר פילטר. לאחר מכן לעטוף את כל צלחת התרבות עם סרט פרפין. מניחים את המנה על 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים, ולאחר מכן עוד יומיים בטמפרטורה נמוכה יותר של 13 עד 16 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מעבירים את המנה למקרר של שש מעלות צלזיוס. מוסיפים מים לצלחת כל שבועיים כדי לספק סביבה לחה לביצים. לבסוף, להחייאת הביצים השמורות, מניחים את צלחת הפטרי על 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

מאוחר יותר, מניחים את הביצים באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות בוקעות. במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 היה ממוקם באקסון הראשון. בבדיקת המחשוף Cas9, חלבון הריבונוקלאו CRISPR/Cas9 יכול היה לעכל את מקטע ה-PCR המכיל את אתר המטרה בשיעור מחשוף של כ-55%תוצאות הריצוף להערכת שיעור מוטציות בשלב העוברי הצביעו על עריכת גנום יעילה באתר היעד.

יעילות העריכה הביאה לשיעור בקיעת נימפה של 52.73% ו-66.67% מהבוגרים של G0 היו מוטנטים של פסיפס. אסטרטגיית המעבר של הקווים המוטנטיים מוצגת כאן. עודפי הביצים ההומוזיגוטיות נשמרו בהקפאה כדי לשפר את קצב הניצול של ההומוזיגוטים.

אף על פי שקצב הבקיעה של הביצים המוקפאות הופחת עם הארכת זמן ההקפאה, הפעולות המתקנות כגון מריחת שברי נייר סינון ושחזור ביצים משומרות אלה עם שיפוע של עליית הטמפרטורה סייעו להחייאה. הדבר החשוב ביותר הוא לנסות להגביל את הנזק המכני שנגרם על ידי microinjection. הליך זה יכול לשמש כהתייחסות להשגת חרקים אחרים.

יש לשנות חלק מפרטים מסוימים כגון שיטות איסוף ביצים, הזרקה והיבול. טכניקה זו יכולה גם להיות מועילה לחקר מטמורפוזה והסתגלות סביבתית של חרקים ובניית מוטציות ארבה הומוזיגוטיות האיצו את המחקר בתחום זה.