Name: בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למדו שיטת CRISPR/Cas9 ליצירת מוטנטים הומוזיגוטיים בארבה נודד, הכוללת מיקרו-הזרקה, סקרינג מוטציות וקירור-הקפאה. פרוטוקול זה מאיץ מחקר גנטיקה של חרקים ומאפשר שימור קווי מוטנטים לטווח ארוך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070502, 31601697, 32072419 והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M672205).

1. בחירת אתר יעד ועיצוב sgRNA
<ol><li>לאסוף כמה שיותר מידע על רצפים עבור הגן המעניין באמצעות מחקר ספרותי ו / או חיפוש mRNA או רצף DNA מקודד (CDS) של הגן ב NCBI ומסד נתונים ארבה24.</li>
	<li>השווה את רצף הגן המעוניין לרצף הדנ"א הגנומי שלו כדי להבחין בין אזורי האקסון והאינטרון.</li>
	<li>בחר אזור מועמד לעיצוב אתר היעד בהתבסס על מטרת המחקר. תכנן זוגות פריימר כדי להגביר את מקטע האזור המועמד ולאמת את הרצף הפרוע שלו על ידי ניתוח רצף של מוצר ה- PCR. הערה: ישנן אסטרטגיות שונות לבחירת אזור היעד של המועמד. לדוגמה, ברוב מחקרי תפקודי הגנים/חלבונים, השתמשו במקטע האקסון הקרוב לקודון ההתחלה שלו כאזור המועמד כדי להבטיח שכל פונקציית החלבון/רנ"א תאבד לאחר עריכת הגנום (כלומר, נוק-אאוט של גנים). בעוד עבור ניתוח פונקציות של תחום מסוים, בחר את האזור המועמד בתחילת (או שני הקצוות) של הדומיין.</li>
	<li>השתמש במשאבים מקוונים כגון E-CRISP Design25 כדי לחפש אתרי יעד פוטנציאליים באזור היעד המועמד.<ol><li>בחר "Drosophila melanogaster BDGP6" (או כל חרק אחר) ברשימה הנפתחת של גנומי הייחוס ובחר "קלט הוא רצף FSTA" ולאחר מכן הדבק את רצף אזור היעד בתיבת הטקסט (בפורמט FSTA).</li>
		<li>הפעל את היישום על ידי לחיצה על "התחל חיפוש sgRNA" עם "בינוני" ו "עיצוב יחיד" כדי לקבל את אתרי היעד האפשריים. בחר 1-3 מטרות פוטנציאליות מהתוצאות בהתבסס על הציונים החזויים שלהן ותכנן את ה- sgRNA המתאים בהתאם. הערה: ישנן פלטפורמות מקוונות רבות נוספות לעיצוב קריספר, כגון CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT וכן הלאה (ראה טבלת חומרים). לחלקם יש את הפונקציה של בדיקת ספציפיות עבור המינים שנתוני הרצף הגנומי שלהם נמצאים במאגרי המידע שלהם. עם זאת, הרצף הגנומי של הארבה לא נמצא בשום אתר אינטרנט. עדיף להשתמש ביותר מכלי מקוון אחד לעיצוב CRISPR בארבה. באופן מקיף, שקול את התוצאות מאתרים שונים ובחר את ה-sgRNA מהתוצאות על-פי העיקרון של הספציפיות הגבוהה ביותר, היעילות הגבוהה ביותר ושיעור אי-ההתאמה הנמוך ביותר (איור 1A,B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. סינתזה ואימות של sgRNA במבחנה
<ol><li>סנתז את ה-sgRNA באמצעות ערכות סינתזת sgRNA בהתאם למדריך היצרן (Table of Materials). הליך זה כולל בדרך כלל שלושה שלבים: הגברת תבנית DNA, שעתוק חוץ גופי וטיהור sgRNA21. דללו את ה-sgRNA המסונתז במים נטולי נוקלאז לריכוז אחסון של 300 ננוגרם/מיקרוליטר לשימוש נוסף.</li>
	<li>הגבירו וטיהרו את מקטע גן המטרה כדי שישמש כמצע לבדיקת המחשוף במבחנה של מערכת CRISPR/Cas9. בצע שלבים אלה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>דללו את חלבון Cas9 שנרכש ל-300 ננוגרם/מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. דגרו 1 μL של sgRNA (300 ng/μL) ו-1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 200 ng של מקטע מטרה מטוהר במאגר המחשוף ב-37°C למשך שעה אחת (10 μL מהנפח הכולל; ראו טבלה 1). העריכו את היעילות של מחשוף Cas9 המושרה על ידי sgRNA על-ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 1C). בחר את sgRNAs עם פעילות גבוהה עבור microinjection הבא. הערה: ניתן להמיר את התוצאות של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לתמונות בגווני אפור באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ויעילות המחשוף נאמדת על פי גווני האפור של הפסים בגדלים משוערים.</li>
</ol>3. מיקרו-הזרקה ותרבית של הביצים
<ol><li>מכינים את מחטי ההזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה (טבלה של חומרים). הגדר את הפרמטרים באופן הבא: חום ל- 588, משוך ל- 90, מהירות ל- 60 וזמן ל- 40. טוחנים את קצה מחט ההזרקה עם מטחנת מיקרו (טבלת חומרים). הערה: קצות המחטים האידיאליים פתוחים וחדים (איור 2A). מומלץ מאוד להכין מחטים נוספות לניסויים מכיוון שמחטים לעיתים חסומות או נשברות בטעות במהלך הזרקות.</li>
	<li>ערבבו 1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 1 μL של sgRNA מאומת (300 ng/μL) יחד כדי לקבל את ה-RNPs להזרקה. הוסף 8 μL של מים סטריליים ללא RNase כדי להפוך את הנפח הסופי של התערובת ל 10 μL. מערבבים היטב את התמיסה ושומרים אותה על קרח. הערה: ניתן למטב את הריכוזים הסופיים של חלבון Cas9 ו- sgRNA בהתאם לתוצאות העריכה. יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית של תמיסת ה-RNP המוכנה, ומומלץ להשתמש בה באופן מיידי.</li>
	<li>מגדלים את הארבה הבוגר הזכר והנקבה יחד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 16 (אור):8 (כהה) ומספקים להם מספיק שתילי חיטה טריים כמזון. התבוננו בארבה זה מדי יום והכניסו לכלוב הגידול עציץ אוביפוזישן (עציץ פלסטיק או מלאה בחול סטרילי רטוב) לכלוב הגידול לאחר שהארבה הזדווג. הערה: בדרך כלל, 100 זוגות של ארבה בוגר המגודל בכלוב גידול (40 ס"מ x 40 ס"מ x 40 ס"מ) מספיקים כדי לייצר ביצים כדי לדפוק גן יחיד. תרבו זוגות ארבה נוספים אם יש צורך בביצים נוספות.</li>
	<li>אספו את תרמילי הביצים הטריות מהסיר והמתינו כ-30 דקות לשיזוף ביצים. בודדו בעדינות את הביצים מתרמילי הביצים במים בעזרת מברשת עדינה ושטפו אותן במים סטריליים שלוש פעמים. שמרו את הביצים בצלוחית פטרי והוסיפו מים סטריליים כדי לשמור עליהן לחות. הערה: שיזוף הביצים שזה עתה הוטלו יכול לשפר באופן משמעותי את יעילות המוטציה21.</li>
	<li>ממלאים מחט הזרקה בתמיסת RNP מוכנה וטוענים אותה למיקרומניפולטור (טבלת חומרים).<ol><li>הגדר את פרמטרי המיקרו-הזרקה באופן הבא: 300 hPa של לחץ ההזרקה (pi), 0.5 שניות של זמן ההזרקה (ti) ו- 25 hPa של לחץ הפיצוי (pc).</li>
		<li>לחץ על הדוושה כדי להעריך את עוצמת הקול של התמיסה המוזרקת. התאם את לחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה כדי להבטיח שנפח ההזרקה הוא כ- 50-100 nL. הערה: יש למצות את שאריות האוויר במחט כדי להפוך את תמיסת ההזרקה לרציפה וניתנת לשליטה ככל האפשר. החיבור של המחט ואת micromanipulator צריך להיות הדוק.</li>
	</ol></li>
	<li>סדרו את הביציות הסטריליות באופן קבוע על משטח ההזרקה (איור 2B,C) והניחו את הפד על שולחן העצמים במיקרוסקופ (איור 3A). התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ עד לצפייה בביצים. התאימו את מחט המיקרו-הזרקה מתחת למיקרוסקופ עד שניתן יהיה לראות את קצה ההזרקה ומקמו אותה ליד הביצה להזרקה.</li>
	<li>התחל את ההזרקה בגובה מתאים ובזווית של 30-45 מעלות. הכניסו את הקצה לתוך הביצה בזהירות ליד המיקרופיילים של הביצה (איור 3B) ולחצו על הדוושה כדי להשלים את ההזרקה. משכו את המחט במהירות והזיזו את כרית ההזרקה להזרקת הביצית הבאה. הערה: יש להבחין בהתרחבות קלה של הביצית במהלך המיקרו-הזרקה. כמות קטנה של דליפה ציטופלזמית בחור הסיכה מקובלת. החלף את מחט ההזרקה בחדשה או התאם את זווית ההזרקה אם זרימת הנוזל היא יותר מדי.</li>
	<li>מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית (צלחת פטרי עם פיסת נייר פילטר לח), ומניחים אותן באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. הערה: יעברו כ-13-14 ימים עד שנימפות יבקעו מהביציות המוזרקות האלה (בתנאי שמוטציה בגן המטרה לא תשפיע על התפתחות העוברים) (איור 3C). הזריקו לפחות 100 ביצים כדי להבטיח כמות מספקת של בקיעה ואקלוסיה לחיסול גן מסוים.</li>
</ol>4. הערכת שיעור מוטציות וסינון מוטנטים
<ol><li>בדוק את התפתחות הביציות המוזרקות כל יום לאחר ההזרקה. מעבירים ביצים מוזרקות לצלחת תרבית חדשה כל 24 שעות ב-5 הימים הראשונים.</li>
	<li>ביוםהשישי (או מאוחר יותר) לאחר ההזרקה, יש לבחור ולהעביר באופן אקראי 10 ביצים לתוך צינור ולטחון כראוי את הביצים עם שני כדורי פלדה ב 60 הרץ במשך 6 דקות באמצעות מטחנה (ראה טבלת חומרים). להשעות מחדש את הפסולת עם 1 מ"ל של PBS. מעבירים 5 μL של התערובת לתוך 45 μL של 50 mM NaOH וליז ב 95 ° C במשך 5 דקות. הוסף 5 μL של 1 M Tris-HCl (pH=8.0) למערכת הליזה כדי לסיים את תגובת הליזה הבסיסית. הערה: ניתן לבחור ביציות לליזה בסיסית בכל יום לאחר ההחזרה האחרונה וניתן להשתמש בביציות מרובות כדגימה אחת בהתאם למצב התפתחותן (למשל, חמישה עוברים בני 6 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת, ושני עוברים בני 10 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת). לפעמים, זה לא ריאלי לקבל את הדנ"א הגנומי של ביצים באמצעות שיטת ליזה אלקליין. ערכות מיצוי DNA גנומי מסחריות יכולות לשמש כשיטה חלופית לבידוד הדנ"א הגנומי מהביציות.</li>
	<li>קח 1 μL של מוצר הליזיס כתבנית PCR כדי להגביר את מקטע גן המטרה (טבלה 2 וטבלה 3) ושלח את מוצרי ה- PCR לריצוף. השוו את תוצאות הריצוף עם הרצף הפראי כדי להעריך באופן ראשוני אם מערכת CRISPR/Cas9 חתכה את גן המטרה in vivo (איור 4A). לאפשר את שאר הביציות להתפתחות הבאה בתנאי indels מזוהים בשלב העוברי. הערה: בדרך זו, ניתן להעריך את שיעור המוטציות באופן ראשוני בשלב העובר. אם לא נמצאו אינדלים בשלב זה, הכינו כמה sgRNA חדשים לגן המטרה וחזרו על פרוטוקול הנוק-אאוט משלב 2.1.</li>
	<li>העבירו את הנימפות שבקעו לכלוב גידול ותרבו אותן כמתואר בשלב 3.3. כאשר הנימפות התפתחו לשלב האינסטאר החמישי, הפרידו אותן בעזרת גביעי תרבית פלסטיים (נימפה / אחת). הערה: בדרך כלל לוקח לנימפות כ-25-35 ימים להתפתח לכוכב החמישי שלהן והפנוטיפ הבולט ביותר הוא שניצני הכנפיים מתרחבים למקטעי הבטן הרביעי או החמישי. יתר על כן, מומלץ להקליט את הפנוטיפים של נימפות מתות כדי לחזות את הקשר בין גן המטרה לבין פנוטיפים במחקר נוסף.</li>
	<li>חותכים כ-2 מ"מ אורך של האנטנות בעזרת מספריים מנתחים ומניחים אותו בשיטת הליזה הבסיסית (שלב 4.2). נתחו את רצף מקטעי גן המטרה של הנימפות האלה כפי שתואר לעיל (שלב 4.3) כדי לזהות את מוטציות G0 (איור 4B). הערה: חיתוך האנטנות עבור ליזיס יכול להיות מעט ארוך יותר ושחיקה או טחינה של האנטנות מועילה לליזה למרות שניתן לעכל את האנטנות ישירות. פרטים עם פסגות מרובות בקרבת אתר המטרה בתוצאת הריצוף מזוהים כמוטנטים חיוביים ומאפשרים התפתחות והזדווגות לאחר מכן.</li>
</ol>5. הקמה ומעבר של קווים מוטנטיים
<ol><li>בצעו הכלאה צולבת באמצעות מוטנטים מסוג G0 וארבה מסוג בר (איור 4B). אספו את הביציות ודגרו על הביציות בנפרד בטמפרטורה של 30°C. השתמשו ב-3-6 ביציות מפותחות בכל ביצית כדי לזהות מוטציות כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.3. שמור ביציות חיוביות למוטציה להתפתחות הבאה ונטוש את הביציות השליליות למוטציה. הערה: הערכת קצב מוטציות בשלב העוברי יכולה להאיץ מאוד את הסינון של מוטציות G1 . בדרך כלל, ניתן לערבב 3-6 ביצים מפותחות כדגימה אחת לגנוטיפ בתיווך PCR כמתואר לעיל.</li>
	<li>מאחור נימפות G1 כמתואר בשלב 4.4. חתכו כ-2 מ"מ אורך של האנטנות כדי לבצע גנוטיפ מבוסס PCR כמתואר בשלב 4.5 לאיתור הטרוזיגוטים G1 . ביצוע שיבוט TA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לזיהוי המוטציות שלו. בצע in-cross באמצעות G1 heterozygotes עם אותן מוטציות כדי לקבל נימפות G2 . הערה: ריצוף Sanger של מוצרי PCR יכול לספק רק מידע לגילוי הטרוזיגוטים, אך לא מספיק מידע לזיהוי המוטציות המדויקות. לפיכך, שיבוט TA באמצעות מוצרי PCR נדרש כדי לזהות בבירור את המוטציות ויכול לקדם הקמת קווים מוטנטיים יציבים.</li>
	<li>מאחור נימפות G2 עד הכוכב החמישי שלהם. השתמשו בגנוטיפ מבוסס PCR המתואר בשלב 5.2 כדי לזהות את ההומוזיגוטים ו/או ההטרוזיגוטים המתאימים למחקר נוסף ולמעבר יציב (איור 4B). הערה: שימו לב להימנע מערבוב של הומוזיגוטים והטרוזיגוטים. מומלץ לבצע גנוטיפ מבוסס PCR בכל דור כדי לאשר את ההומוזיגוטיות ו/או ההטרוזיגוטיות של כל אוכלוסייה. מספר הארבה המשמש לבדיקה זו תלוי בגודל האוכלוסייה. יתר על כן, ניתן להרחיב את אוכלוסיית הארבה על ידי אסטרטגיית ההצלבה.</li>
</ol>6. הקפאת ביצים והחייאה
<ol><li>לשטוף את הביצים כדי להיות cryopreserved עם מים סטריליים לדגור אותם בכלי תרבית כמתואר לעיל (שלב 3.8) במשך 5-6 ימים. אספו את הביצים יחד בצלחת התרבית וכסו אותן בשברי נייר פילטר. עוטפים את כל מנת התרבות בסרט פרפין.</li>
	<li>שמור את המנה ב 25 ° C במשך 2 ימים ואחריו עוד 2 ימים בטמפרטורה נמוכה יחסית (13-16 ° C). לאחר מכן, להעביר את המנה למקרר 6 מעלות צלזיוס. הוסיפו לתוכו מים כל שבועיים כדי לספק סביבה לחה לביצים (איור 5A). הערה: העוברים משערים להיות בשלב katatrepsis לאחר שפותחו במשך 5-6 ימים ב 30 ° C26. קירור הדרגתי מועיל לשימור בהקפאה של ביצים (טבלה 5).</li>
	<li>להחייאת הביצים בהקפאה, הוציאו את צלחת הפטרי מהמקרר ושמרו אותה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים. הניחו את הביצים האלה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות יבקעו (איור 5B). הערה: יש צורך לשים את הביצים cryopreserved ב 25 ° C לפני העברתם לאינקובטור 30 ° C. ניתן לשמר את העוברים בהקפאה למשך חמישה חודשים לפחות, אם כי קצב הבקיעה וקצב האקלוסיה יכולים לרדת בגלל ההקפאה (טבלה 5).</li>
</ol>

<ol><li>Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of therapeutic genome editing.</a> Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).</li>
<li>van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delivery+challenge%3A+fulfilling+the+promise+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).</li>
<li>McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR+technologies+for+gene+editing+and+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation.</a> Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+systems+in+genome+editing%3A+Methodologies+and+tools+for+sgRNA+design%2C+off-target+evaluation%2C+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+iap+gene%2C+responsible+for+alkaline+phosphatase+isozyme+conversion+in+Escherichia+coli%2C+and+identification+of+the+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.</a> Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR%2FCas9+genome-edited+Helicoverpa+Armigera+%28Hubner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE1%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+knockout+of+the+abdominal-A+homeotic+gene+in+the+global+pest%2C+diamondback+moth+%28Plutella+xylostella%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+locusts%3A+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+%28Orco%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BmHpo+mutation+induces+smaller+body+size+and+late+stage+larval+lethality+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+tanning+improves+the+efficiency+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutant+locust+production+by+enhancing+defense+ability+after+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Vinylanisole+is+an+aggregation+pheromone+in+locusts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts.</a> Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).</li>
<li>Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locust+and+grasshopper+management%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Locust and grasshopper management.</a> Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).</li>
<li>Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.locustmine.org:8080/locustmine">http://www.locustmine.org:8080/locustmine</a> (2019).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.e-crisp.org/E-CRISP/">http://www.e-crisp.org/E-CRISP/</a> (2014).</li>
<li>Pétavy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+development+of+the+vitellophags+during+embryogenesis+of+the+migratory+locust%2C+Locusta+migratoria+L.+%28Orthoptera+%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Insect+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae).</a> International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus eggs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).</li>
<li>Du, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Laccase+2+severely+impairs+cuticle+tanning+and+pathogen+resistance+during+the+pupal+metamorphosis+of+Anopheles+sinensis+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae).</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).</li>
<li>Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanning+of+grasshopper+eggs+by+an+exocrine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion.</a> Science. 152 (3718), 95-97 (1966).</li>
<li>Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularization+in+locust+embryos+occurs+before+blastoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation.</a> Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effect+of+photoperiod+and+temperature+on+the+induction+and+termination+of+embryonic+diapause+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managment+Science%22%5BJournal%5D)">Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust.</a> Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).</li>
<li>Jarwar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+analysis+reveals+molecular+profiles+of+central+nervous+system+in+maternal+diapause+induction+of+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

ארבה היה בין המזיקים ההרסניים ביותר לחקלאות מאז הציוויליזציה של בני האדם23 . טכנולוגיית עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להקניית ידע טוב יותר על המנגנונים הביולוגיים בארבה, כמו גם אסטרטגיית הדברה מבטיחה. לפיכך, יש תועלת רבה בפיתוח שיטה יעילה וקלה לשימוש של בנייה בתיווך CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות. למרות שכמה עבודות נהדרות דווחו וסיפקו זרימת עבודה בסיסית לעריכת גנום בארבה 18,20,21,22,<sup cl...

טכנולוגיות עריכת גנים יכולות לשמש להחדרת החדרות או מחיקות למוקד גנום ספציפי כדי לשנות באופן מלאכותי את גן המטרה למטרה1. בשנים האחרונות, טכנולוגיית CRISPR/Cas9 התפתחה במהירות ויש לה היקף הולך וגדל של יישומים בתחומים שונים של מדעי החיים 2,3,4,5,6. מערכת CRISPR/Cas9 התגלתה עוד בשנת 19877, ונמצאה באופן נרחב בחיידקים ובארכאה. מחקר נוסף הצביע על כך שמדובר במערכת חיסון פרוקריוטית נרכשת התלויה בנוקלאז מונחה RNA Cas9 כדי להילחם בפאגים8. מערכת CRISPR/Cas9 שעברה שינוי מלאכותי מורכבת בעיקר משני מרכיבים, RNA מנחה יחיד (sgRNA) וחלבון Cas9. ה-sgRNA מורכב מ-CRISPR RNA (crRNA) המשלים את רצף המטרה ומ-crRNA טרנסאקטיבי עזר (tracrRNA), שנשמר יחסית. כאשר מערכת CRISPR/Cas9 מופעלת, ה-sgRNA יוצר ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) עם חלבון Cas9 ומנחה את Cas9 לאתר המטרה שלו באמצעות זיווג הבסיס של אינטראקציות RNA-DNA. לאחר מכן, הדנ"א הדו-גדילי יכול להיבקע על ידי חלבון Cas9 וכתוצאה מכך, שבר הגדיל הכפול (DSB) מופיע ליד מוטיב הפרוטוספייסר הסמוך (PAM) של אתר המטרה 9,10,11,12. כדי למתן את הנזק שנגרם על ידי DSBs, תאים יפעילו תגובות מקיפות של נזק לדנ"א כדי לזהות ביעילות את הנזקים הגנומיים וליזום את הליך התיקון. ישנם שני מנגנוני תיקון נפרדים בתא: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מסלול התיקון הנפוץ ביותר שיכול לתקן שברים דו-גדיליים של DNA במהירות ומונע אפופטוזיס של תאים. עם זאת, הוא מועד לטעויות בגלל השארת שברים קטנים של החדרות ומחיקות (indels) ליד DSBs, אשר בדרך כלל גורם לשינוי מסגרת קריאה פתוחה ולכן יכול להוביל להסתרת גנים. לעומת זאת, תיקון הומולוגי הוא אירוע נדיר למדי. בתנאי שיש תבנית תיקון עם רצפים הומולוגיים להקשר של DSB, תאים יתקנו מדי פעם את השבר הגנומי בהתאם לתבנית הסמוכה. התוצאה של HDR היא שה- DSB מתוקן במדויק. במיוחד, אם יש רצף נוסף בין הרצפים ההומולוגיים בתבנית, הם ישולבו בגנום באמצעות HDR, וכך ניתן יהיה לממש את החדרות הגנים הספציפיים13.
עם אופטימיזציה ופיתוח של מבני sgRNA וגרסאות חלבון Cas9, מערכת העריכה הגנטית מבוססת CRISPR/Cas9 יושמה בהצלחה גם במחקר של חרקים, כולל אך לא מוגבל Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella, ו Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. למיטב ידיעת המחברים, למרות ש-RNPs המורכבים מחלבון Cas9 ו-sgRNA משועתק במבחנה שימשו לעריכת גנום ארבה20,21,22, פרוטוקול שיטתי ומפורט לבנייה בתיווך ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עדיין חסר.
הארבה הנודד הוא מזיק חקלאי חשוב בעל תפוצה עולמית ומהווה איום ממשי על ייצור המזון, בהיותו מזיק במיוחד לצמחי גרמין כגון חיטה, תירס, אורז ודוחן23. ניתוח תפקודי גנים המבוסס על טכנולוגיות עריכת גנום יכול לספק מטרות חדשות ואסטרטגיות חדשות להדברת ארבה נודד. מחקר זה מציע שיטה מפורטת להשמדת גנים נודדים של ארבה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל בחירת אתרי מטרה ועיצוב sgRNAs, סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs, מיקרו-הזרקה ותרבית ביציות, הערכת שיעור המוטציות בשלב העוברי, איתור מוטנטים וכן מעבר ושימור של המוטציות. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת ייחוס בסיסית למניפולציה של הרוב המכריע של גני הארבה ויכול לספק הפניות יקרות ערך לעריכת גנום של חרקים אחרים.

<table><tbody><tr><td>10 פעמים; NEBuffer r3.1</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7030S</td><td>המאגר של &nbsp; in vitro מבחני מחשוף Cas9</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (צבע)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>להגברת גנים</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (צבע)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>להגברת גנים</td></tr><tr><td>אתר מקוון CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td></td> לעיצוב sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.</tr><tr>אתר <td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online לעיצוב sgRNAs, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>אתר CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>Online לעיצוב sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>ספק כוח אלקטרופורזה</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>הפרדה של מולקולות חומצות גרעין בגדלים שונים</td></tr> צינור <tr><td>אפנדורף Eppendorf</td><td></td><td>30125177</td><td>לאיסוף דגימות וכו '.</td></tr><tr><td>מברשות עדינות</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>לניקוי ובידוד ביצים. נרכש באינטרנט.</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td>להכנת מחטי המיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>שחזור וטיהור DNA</td></tr><tr><td>מערכת ניתוח הדמיית ג'ל</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>התבונן בתוצאות האלקטרופורזה</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>להגברת גנים</td></tr><tr><td>זכוכית נימי אלקטרודה</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>להכנה&nbsp; מחטי הזרקה עם&nbsp; א&nbsp; חממת חולץ מיקרופיפטה</td></tr><tr><td></td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>לתרבית עובר ארבה נודד</td></tr><tr><td>אמבט מתכת</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>לחימום הדגימה</td></tr><tr><td>מיקרו מזרק אוטומטי</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>מיקרו-הזרקה של עוברים בשלב מוקדם בפיתוח</td></tr><tr><td>מיקרו צנטריפוגה</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>משמש לערבוב ריאגנטים</td></tr><tr><td>מיקרו-מטחנה</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>להארקת קצה מחט ההזרקה</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>להעמסת תמיסות לתוך מחטי ההזרקה.</td></tr><tr><td>מערכת מיקרומניפולציה</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>מערכת מניפולציה אלטינטיבית למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>למניפולטור כונן מנוע מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>לשליטה במיקום המיקרופיפטה במהלך קדם המיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות מרובת דגימה</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>טוחנים והומוגניזציה של</td></tr><tr><td>סיר הביצים</td><td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>מלא בחול סטרילי רטוב להטלת ארבה בו. האוציסטים נאספים ממיכל זה. נרכש באינטרנט.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>לעטיפת צלחות הפטרי.</td></tr><tr><td>ערכת שיבוט pEASY-T3</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>לשיבוט ת"א</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>לתרבית ושימור הביצים.</td></tr><tr><td>פיפטור</td><td>אפנדורף</td><td>מחקר פלוס</td><td>לטעינת מדגם</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> תרבית פלסטיק <td>לגידול ארבה בנפרד וכל פלסטיק גדולה מספיק (לא פחות מ-1000 מ"ל בנפח) תתאים. נרכש באינטרנט.</td></tr><tr><td>ערכת סינתזת gRNA מדויקת</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>לסינתזת sgRNA</td></tr><tr><td>פריימר Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>לעיצוב פריימר</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Insightful Science</td><td>SnapGene&reg; 4.2.4</td><td>לניתוח &nbsp; רצפים כדורי</td></tr><tr><td>פלדה</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>לטחינת מדגם. נרכש באינטרנט.</td></tr><tr><td>טיפים</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>לטעינת דגימה</td></tr><tr><td>Trans DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>משמש לקביעת גודל הגן</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 חלבון v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9 חלבון</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>למיצוי DNA גנומי</td></tr><tr><td>VANNAS מספריים</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72932-01</td><td>לכריתת האנטנות</td></tr><tr><td>חיטה</td><td></td><td></td><td>ליצירת שתילי חיטה כמזון לארבה. נקנה מחקלאים מקומיים.</td></tr><tr>אתר <td>ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Online לעיצוב sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית crispr/cas9

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

הארבה הנודדת, Locusta migratoria, היא לא רק אחת מארבות המגפה העולמיים שגרמו הפסדים כלכליים עצומים לבני אדם, אלא גם מודל מחקרי חשוב למטמורפוזה של חרקים. מערכת CRISPR/Cas9 יכולה לאתר במדויק במיקום דנ"א ספציפי ולהיבקע בתוך אתר המטרה, ולהציג ביעילות הפסקות דו-גדיליות כדי לגרום לנוקאאוט של גן המטרה או לשלב מקטעי גנים חדשים בלוקוס הספציפי. עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להתמודדות עם שאלות בחקר הארבה, כמו גם טכנולוגיה מבטיחה להדברת ארבה. מחקר זה מספק פרוטוקול שיטתי לנוקאאוט גנים בתיווך CRISPR/Cas9 עם קומפלקס של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) בארבה נודד. בחירת אתרי המטרה והעיצוב של sgRNA מתוארים בפירוט, ולאחר מכן סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs. הליכים מאוחרים יותר כוללים איסוף רפסודות ביצים והפרדת ביצים שזופות כדי להשיג מיקרו-הזרקה מוצלחת עם שיעור תמותה נמוך, תרבית ביצים, הערכה ראשונית של שיעור המוטציות, רבייה של ארבה וכן גילוי, שימור ומעבר של המוטנטים כדי להבטיח את יציבות האוכלוסייה של הארבה הערוך. שיטה זו יכולה לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.

פרוטוקול זה מכיל את השלבים המפורטים ליצירת מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עם RNP המורכב מחלבון Cas9 ו- sgRNA מסונתז במבחנה . להלן כמה תוצאות מייצגות של נוקאאוט גן המטרה בתיווך CRISPR/Cas9 בארבה, כולל בחירת מטרה, סינתזה ואימות של sgRNA (איור 1A), איסוף והזרקת ביציות, סינון והעברה מוטנטיים, שימור בהקפאה והחייאה של הביציות ההומוזיגוטיות.
במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 נבחר על פי התוצאות של שלוש תוכניות מקוונות (E-CRISP, CRISPOR ו-ZiFit) וממוקם ...

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

הארבה הנודד הוא מבחן חקלאי חשוב. שיטה זו מספקת פרוטוקול יעיל וקל לתפוקה עבור שיטות לחץ הגן של זוהי שיטה שיטתית ומפורטת של בניית CRISPR/CAS9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כולל איסוף ביציות, סינון מוטנטי ושמירה הומוזיגוטית. כדי להתחיל, להכין את מחטי הזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מיקרו פיפטה.הגדר את הפרמטרים כמתואר בכתב היד של הטקסט, ולאחר מכן טחן את קצה מחט ההזרקה באמצעות מטחנת מיקרו. הכן חלבון ריבונוקלאו להזרקה על ידי ערבוב מיקרוליטר אחד של חלבון Cas9 עם מיקרוליטר אחד של RNA מדריך יחיד מאומת. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של המים הסטריליים החופשיים של RNA כדי ליצור את הנפח הסופי של התערובת, 10 מיקרוליטר.מערבבים היטב את התמיסה ומניחים אותה על קרח. לאחר מכן, אספו את תרמילי הביצים הטריים שהונחו מתרמיל מיקום הביציות, והמתינו לשיזוף ביצים. לאחר 30 דקות, השתמשו במברשת עדינה כדי לבודד את הביצים מתרמילי הביצים במים, ושטפו את הביצים שלוש פעמים במים סטריליים.לאחר מכן מניחים את הביצים בצלחת פטרי ומוסיפים מים סטריליים כדי לשמור עליהם לחים. מלא את מחט ההזרקה בתמיסת חלבון ריבונוקלאו מוכנה, וטען את ההזרקה למיקרו מניפולטור. הגדר את הפרמטרים של מיקרו-הזרקה כ-300 הקטופסקלים של לחץ הזרקה, 0.5 שניות של זמן הזרקה ו-25 הקטופסקלים של לחץ פיצוי.כאשר הפרמטרים מוגדרים, לחץ על הדוושה כדי להעריך את עוצמת הקול של התמיסה המוזרקת. התאם את לחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה כדי להבטיח שנפח ההזרקה הוא כ- 50 עד 100 ננוליטר. לאחר סידור הביצים הסטריליות באופן קבוע על כרית ההזרקה, הניחו את הפד על שולחן האובייקטים במיקרוסקופ והתאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ עד לצפייה בביצים.לאחר מכן התאימו את מחט המיקרו-הזרקה מתחת למיקרוסקופ עד שניתן יהיה לראות את קצה ההזרקה ולמקם את הקצה ליד הביצה להזרקה. התחל את ההזרקה בגובה מתאים ובזווית של 30 עד 45 מעלות. הכניסו את החוד לתוך הביצה ליד ערימות המיקרו של הביצה ולחצו על הדוושה כדי להשלים את ההזרקה.לאחר מכן, משכו את המחט במהירות והזיזו את כרית ההזרקה להזרקת הביצית הבאה. מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית בעזרת פיסת נייר פילטר לח. הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.לאחר ההזרקה, לבדוק את התפתחות הביצים המוזרקות כל יום. מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית חדשה כל 24 שעות בחמשת הימים הראשונים. ביום השישי לאחר ההזרקה, יש לקטוף ולהעביר באופן אקראי 10 ביצים לתוך צינור ולטחון כראוי את הביצים עם שני כדורי פלדה במהירות של 60 הרץ למשך שש דקות באמצעות מטחנה.לאחר השחזה, להשעות מחדש את הפסולת במיליליטר PBS אחד. לאחר מכן להעביר חמישה מיקרוליטרים של תערובת מרחף לתוך 45 מיקרוליטר של 50 מילימולר הידרוקסיד נתרן ליז ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. כדי לסיים את תגובת הליזה הבסיסית, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת למערכת הליזיס.קח מיקרוליטר אחד של מוצר הליזיס כתבנית PCR כדי להגביר את מקטע גן המטרה. לאחר ה-PCR והריצוף, השוו את תוצאות הריצוף עם רצף הסוג הפראי כדי להעריך אם מערכת CRISPR/Cas9 קרעה את גן המטרה in vivo. לאפשר את שאר הביציות להתפתחות הבאה כמו indels מזוהים בשלב העוברי.לאחר פיתוח, העברה ותרבית הנימפות שבקעו לכלוב גידול כמתואר בכתב היד. כאשר הנימפות מתפתחות לשלב האינסטאר החמישי, הפרידו אותן בעזרת כוסות תרבית פלסטיק. בצע הכלאה צולבת באמצעות מוטנטים G0 וארבה מסוג בר.לאחר איסוף נאות מדבר, השתמשו בשלוש עד שש ביציות מפותחות בכל או-אסיסט כדי לזהות מוטציות כפי שתואר קודם לכן. שמור על נאות מדבר חיוביים למוטציה להתפתחות הבאה ונטוש את נאות המדבר השליליים של המוטציה. לשימור בהקפאה, שוטפים את הביצים במים סטריליים ודגרים עליהן בכלי תרבית כפי שהוסבר קודם.לאחר חמישה עד שישה ימים, אוספים את הביצים יחד בצלחת התרבית, ומכסים אותן בשברי נייר פילטר. לאחר מכן לעטוף את כל צלחת התרבות עם סרט פרפין. מניחים את המנה על 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים, ולאחר מכן עוד יומיים בטמפרטורה נמוכה יותר של 13 עד 16 מעלות צלזיוס.לאחר מכן מעבירים את המנה למקרר של שש מעלות צלזיוס. מוסיפים מים לצלחת כל שבועיים כדי לספק סביבה לחה לביצים. לבסוף, להחייאת הביצים השמורות, מניחים את צלחת הפטרי על 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.מאוחר יותר, מניחים את הביצים באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות בוקעות. במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 היה ממוקם באקסון הראשון. בבדיקת המחשוף Cas9, חלבון הריבונוקלאו CRISPR/Cas9 יכול היה לעכל את מקטע ה-PCR המכיל את אתר המטרה בשיעור מחשוף של כ-55%תוצאות הריצוף להערכת שיעור מוטציות בשלב העוברי הצביעו על עריכת גנום יעילה באתר היעד.יעילות העריכה הביאה לשיעור בקיעת נימפה של 52.73% ו-66.67% מהבוגרים של G0 היו מוטנטים של פסיפס. אסטרטגיית המעבר של הקווים המוטנטיים מוצגת כאן. עודפי הביצים ההומוזיגוטיות נשמרו בהקפאה כדי לשפר את קצב הניצול של ההומוזיגוטים.אף על פי שקצב הבקיעה של הביצים המוקפאות הופחת עם הארכת זמן ההקפאה, הפעולות המתקנות כגון מריחת שברי נייר סינון ושחזור ביצים משומרות אלה עם שיפוע של עליית הטמפרטורה סייעו להחייאה. הדבר החשוב ביותר הוא לנסות להגביל את הנזק המכני שנגרם על ידי microinjection. הליך זה יכול לשמש כהתייחסות להשגת חרקים אחרים.יש לשנות חלק מפרטים מסוימים כגון שיטות איסוף ביצים, הזרקה והיבול. טכניקה זו יכולה גם להיות מועילה לחקר מטמורפוזה והסתגלות סביבתית של חרקים ובניית מוטציות ארבה הומוזיגוטיות האיצו את המחקר בתחום זה.

construction-homozygous-mutants-migratory-locust-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים שלב אחר שלב עבור מוטגנזה של CRISPR/Cas9 של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis. צעדים מפורטים המסופקים על ידי פרוטוקול סטנדרטי זה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטים למחקרי גנים פונקציונליים ב - B. dorsalis.

פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis

למדו שיטת CRISPR/Cas9 ליצירת מוטנטים הומוזיגוטיים בארבה נודד, הכוללת מיקרו-הזרקה, סקרינג מוטציות וקירור-הקפאה. פרוטוקול זה מאיץ מחקר גנטיקה של חרקים ומאפשר שימור קווי מוטנטים לטווח ארוך.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

גלה סרטונים נוספים