Name: בניית מיקרו-אלקטרוניקה פוטנציאלית לשדה מקומי עבור הקלטות in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: למדו לבנות מערכי מיקרו-אלקטרודות מותאמים אישית להקלטת פוטנציאלים שדה מקומיים in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית. השיטה מאפשרת הקלטות מדויקות בעומקים שונים ומספקת גמישות רבה יותר ממוצרים מסחריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (RO1 NS120945, R37NS119012 עד JK) ומכון המוח UVA.

העבודה הנוכחית מאושרת על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה. עכברי C57Bl/6 משני המינים (7-12 שבועות) שימשו לניסויים. בעלי החיים נשמרו על מחזור חשוך של 12 שעות/12 שעות והייתה להם גישה אד-ליביטום למזון ולמים.
1. בניית מיקרואלקטרודה
<ol><li>כדי לבנות את המיקרו-אלקטרוניקה, השתמש בחוט ניקל-כרום מצופה דיאמל באורך 50 מיקרומטר (קוטר) המצופה בדיאמל (ראו טבלת חומרים). הדביקו קצה אחד של החוט בחלק האחורי של הרציף ועטפו את החוט שלוש פעמים סביב הידית הקרובה ביותר על הרציף (איור 1A,C). הערה: פלטפורמה אקרילית עם שתי ידיות (2 x 5 אינץ ') שימשה כאן, אך ניתן להשתמש בכל פלטפורמה.<ol>
<li>מתחו את החוט סביב הידית השנייה הרחוקה ביותר כדי ליצור שתי לולאות בין הידיות. עטוף את החוט שלוש פעמים נוספות סביב הידית הראשונה כדי לתקן את החוט במקומו ולהדביק את הקצה שוב בחלק האחורי של הפלטפורמה. הערה: לאחר הפרדת החוטים (שלבים 1.2-1.3.1), חייבים להיות שני חוטים בכל צד (ארבעה חוטים בסך הכל, איור 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הניחו את פסי המתח מתחת לחוטים כשהסרט עטוף סביבם (צד דביק כלפי מעלה) (איור 1C). הערה: חתיכות אקריליות משולשות שימשו למוטות המתח, עם סרט עטוף סביבם (צד דביק בחוץ כדי לחבר את החוטים). הצד הדביק של הקלטת מחוץ למוטות המתח ישמור על החוטים במקומם כדי להתאים את המרחק ביניהם. מוטות המתח חייבים להיות במרחק של כ-2.5 ס"מ מהידיות, ואסור שהחוטים יהיו רופפים.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ ומלקחיים עדינים, יוצרים מרווח של 3 מ"מ או 4.5 מ"מ בין החוטים (מרווח של 3 מ"מ בין החוטים כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה של גרעין תלמי גחוני (Ctx) - גרעין תלמי גחוני (VL); מרווח של 4.5 מ"מ כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה סטריאלית (Str) - nigral (SNR) (איור 1B).<ol>
<li>אם נעשה שימוש בהגדלה במיקרוסקופ, הקפד לחשב ולהתאים את ההבדל בהגדלה ואת המרחק בפועל בין החוטים. הערה: אם מיקרו-אלקטרוניקה בנויה עבור מבנים אחרים מאלה המשמשים כאן, יש להתאים את המרחק בין החוטים למרחק הסטריאוטקסי בין המבנים. איור 2B מספק דוגמה לאופן שבו החוטים יתארגנו; לפיכך, הקואורדינטות הסטריאוטקסיות עבור מבנים אחרים חייבות להיות מותאמות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חותכים ארבע חתיכות פלסטיק קטנות (בעובי 0.5 מ"מ) כ-6 מ"מ (רוחב) x 3 מ"מ (גובה) (איור 1C). הערה: ניתן להשתמש בכל חתיכות הפלסטיק כל עוד הן בעובי של 0.5 מ"מ; כאן נעשה שימוש בצינורות מרובעים שבהם נמכרו הפינים (סיכות, ראו טבלת חומרים). אם נעשה שימוש בעובי שונה, אנא הוסף יותר או פחות חתיכות פלסטיק שיתאימו לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות.</li>
	<li>מרחו דבק (ראו טבלת חומרים) על הפלסטיק והניחו אותם על החוטים (איור 1C). מניחים חתיכות פלסטיק במרחק של כ-1.0 ס"מ מאמצע החוט, המרוחק 1.0 ס"מ ממוט המתח. הסר את עודף הסופרגלו עם צמר גפן.</li>
	<li>לאחר שהסופרגלו מתייבש, חותכים את החוטים באמצעות מספריים עדינים, לפי הסדר המצוין באיור 1C.</li>
	<li>חותכים ארבעה צינורות זכוכית בקוטר 7 מ"מ באמצעות ערכה זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים) ומחדירים את חוטי האלקטרודה לצינורות הזכוכית כפי שמצוין באיור 2A.<ol>
<li>הכנס זוגות אלקטרודות VL ו- SNR לצינורות הזכוכית. הערה: יש להחדיר רק את החוטים למבנים עמוקים לצינורות הזכוכית כדי לתמוך בהשתלה כירורגית. הקפידו לא להחדיר אלקטרודות קליפת המוח לצינור הזכוכית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שים את הדבק בבסיס צינורות הזכוכית כדי לחבר אותם לפלסטיק. יש להמתין זמן מה עד שהדבק יתייבש.</li>
	<li>חותכים את צינורות הזכוכית והחוטים באמצעות אזמל כפי שמצוין בטבלה 1; ודא שאורכי המיקרו-אלקטרוניקה נכונים. אם המיקרו-אלקטרוניקה מכוונת למבנים שונים, התאם את מרחק החיתוך בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig01.jpg"> איור 1: סכמטית של מבנה המיקרו-אלקטרוניקה. (ב) הפער בין החוטים. (C) ארבע חתיכות פלסטיק מודבקות לחוטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ctx</td>
			<td>סטר</td>
			<td>VL</td>
			<td>SNR</td>
		</tr>
<tr>
<td>AP (קדמי/אחורי)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>-1.3</td>
			<td>-3.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>ML (מדיאלי/לרוחב)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DV (גב/גחון)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך אלקטרודה</td>
			<td>4</td>
			<td>4.75</td>
			<td>5.25</td>
			<td>6</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: קואורדינטות וממדים של השתלה סטריאוטקסית של המיקרו-אלקטרוניקה.
2. הרכבה של מערך מיקרואלקטרודה
<ol><li>השתמשו בדבק כדי לחבר פלסטיק בסדר הרצוי של אזורי המטרה. דוגמה לאלקטרודות קליפת המוח, התלמיות, הסטריטאליות והניגרליות מוצגת באיור 2B,C.<ol>
<li>מניחים את זוג האלקטרודות Ctx-VL עם הפנים כלפי מטה (בצד עם חוטי האלקטרודה צריכים לפנות כלפי מטה) ומחברים שתי חתיכות פלסטיק ריקות בגודל 6 מ"מ על 3 מ"מ מלמעלה עם דבק.</li>
		<li>על גבי שלוש פיסות הפלסטיק, הניחו את זוג האלקטרודות השני Ctx-VL כאשר האלקטרודות פונות כלפי מעלה (השתמשו במיקרוסקופ וודאו שאלקטרודות ה-VL מיושרות). הערה: יישור של אלקטרודות דו-צדדיות (כאן, יישור אלקטרודות VL שמאל וימין) חיוני כדי להתמקד במבנים דו-צדדיים רצויים כראוי.</li>
		<li>השתמשו בדבק כדי לחבר את אלקטרודות ה-SNR למעלה עם אלקטרודות ה-SNR במרחק של 2.0 מ"מ מאלקטרודות ה-VL ובמרחק של כ-5.0 מ"מ מהאלקטרודות בקליפת המוח (חוטי האלקטרודה של SNR צריכים לפנות כלפי מעלה).</li>
		<li>חזור על שלב 2.1.3. עבור הצד השני (חוטי האלקטרודה SNR צריכים להתמודד מחוץ למערך המיקרו-אלקטרוניקה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מרחו שרף אפוקסי סביב הפלסטיק כדי לקשור את האלקטרודות זו לזו. הימנעו מהנחת שרף אפוקסי על האלקטרודות.</li>
	<li>קח חוט עבה ועשה לולאה בקצה אחד. טבלו את הלולאה בתמיסת האפוקסי והניחו אותה על הפלסטיק, כדי לוודא שהחוט העבה שוכב שטוח (איור 2D) כך שבשלבים הבאים, חוט זה יוכל לשמש כידית. המתן עד שהאלקטרודות יתייבשו במלואן.</li>
	<li>חתכו את החוטים ל-2 ס"מ, כפי שמוצג באיור 2E.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig02v2.jpg"> איור 2: בנייה וממדים של מיקרואלקטרודות. (A) ארבעה זוגות של אלקטרודות שנוצרו לאחר שהחוטים נחתכו במספריים, כפי שמצוין באיור 1C (2 זוגות של אלקטרודות Ctx-VL ו-2 זוגות של אלקטרודות Str-SNR). החדירו אלקטרודות מבנה עמוק (VL ו-SNR) לתוך צינורות הזכוכית והדביקו את בסיסיהם לפלסטיק (נקודות אדומות). (B) מבט עליון: זוגות האלקטרודות מ-(A) מודבקים בערימה כדי ליצור את ליבת המיקרו-אלקטרוניקה. קווים אדומים מציינים קווי דבק. (C) מבט מהצד הקדמי של (B). (ד) החוט העבה היה מחובר למיקרו-אלקטרוניקה. (E) החוטים מקובצים כמפורט, והקצוות המבודדים נשרטים וחותכים ל-2 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. חיבור מיקרואלקטרודה לאוזניות
<ol><li>קבץ את החוטים כפי שמצוין באיור 2E וגרד 1 מ"מ של הקצוות המבודדים עם אזמל.</li>
	<li>כופפו את האלקטרודות בקליפת המוח כפי שמוצג באיור 3A. הפרד את החוטים כפי שמוצג באיור 3B. באמצעות מלקחיים עדינים, צור לולאה בקצה של כל חוט (איור 3B).</li>
	<li>החזיקו אוזניות עם 10 פינים עם המוסטאט (ראו טבלת חומרים) והשתמשו בקצה העץ של צמר גפן כדי למרוח כמויות מינימליות של שטף על הפינים (איור 3C). הקפידו לא לשים שטף מחוץ לפינים כדי למנוע קצר חשמלי בין הפינים.</li>
	<li>באמצעות קצה העץ של ספוגית כותנה, להחיל שטף על לולאות החוט.</li>
	<li>הלחימו את לולאות החוטים לאוזניות בנות 10 הפינים, כפי שמוצג באיור 3C. לאחר ההלחמה, ייבשו את האוזניות כדי למנוע קצר חשמלי בין הפינים.</li>
	<li>קח חוט דק (0.005-0.008 אינץ ') עבור חוטי הייחוס וההארקה ופשט את הפלסטיק מקצה אחד. צור לולאה בקצה השני של החוט.</li>
	<li>הלחימו את הצד המופשט של חוטי הייחוס וההארקה לפינים המתאימים להם (איור 3A,C).</li>
	<li>כשהם אוחזים בחוט העבה (איור 2D), מורחים מלט קרניופלסטי סביב המיקרו-אלקטרוניקה, במיוחד במקום שבו החוטים מתחברים לפינים. הימנעו מלגעת בקצוות האלקטרודה הממשיים עם המלט.</li>
	<li>לאחר שהמלט מתייבש, שים שרף אפוקסי בבסיס צינורות הזכוכית, חוטי מיקרו-אלקטרוניקה סטריאליים וכל האלקטרודה. הימנעו מלגעת באלקטרודה הממשית המסתיימת בשרף אפוקסי. המתן עד שהאלקטרודות יתייבשו במלואן.</li>
	<li>האלקטרודות מוכנות. קודחים חורים בגולגולתו של העכבר (בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות) באמצעות מקדחה דנטלית ומשתילים את האוזניות כפי שמוצג באיור 3D על ידי הורדת האוזניות עם מיקרו-אלקטרוניקה עם מיקרו-אלקטרוניקה הפונה אל הגולגולת והחורים המתאימים. ניתן לחבר את האוזנייה לזרוע הסטריאוטקסית לתמיכה במהלך ההשתלה.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig03.jpg"> איור 3: השתלת מיקרואלקטרודה. (A) האלקטרודות בקליפת המוח כפופות כפי שצוין. (B) החוטים מופרדים כדי ליצור לולאות בקצוות. (C) השטף (בנקודות האדומות) והחוטים הלולאתיים מולחמים לאוזניות של 10 פינים, ומבטיחים שכל חוט יעבור לפין המתאים לו. (D) האוזניות מושתלות להקלטת LFPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
4. סימון מיקום האלקטרודה לאחר הקלטות
<ol><li>בסוף הקלטות ה- LFP, אשר את המיקום הנכון של האלקטרודות באזור המטרה על ידי הפעלת זרם בקצות האלקטרודה כדי ליצור נגע והמתנה של 30 דקות לפני ההדבקה של העכבר. הערה: הגדרות נגעים כדי לאשר את המיקום של קצות האלקטרודה: פרץ יחיד, 40 μA, 0.75 ms פולס גל מרובע מונופסי, 50 הרץ, 30 שניות.</li>
	<li>מרדימים את העכברים עם איזופלורן (עד שהעכבר נרדם) ומכניסים10 באופן טרנסקרדיאלי עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.1 M חיץ נתרן פוספט. חתכו את המוחות (בעובי של 40 מיקרומטר) על קריוסטאט (ראו טבלת חומרים) והכתימו ב-DAPI (0.02% ב-PBS). אשר את המיקום הנכון של האלקטרודות על ידי נוכחותם של נגעי קצה האלקטרודה כפי שמוצג באיור 4B,C. הערה: יש ליישם את אחוז האיזופלורן בהתאם להנחיות המוסד הבודד.</li>
</ol>5. מדידת התנגדות האלקטרודה
<ol><li>מדוד את ההתנגדות של האלקטרודות ובדוק את המעגל הקצר בין האלקטרודות באמצעות אומטר רב טווח (ראה טבלת חומרים). הגדר את סולם ההתנגדות ב- R x 10,000, וציין כי סטיית יחידה במצביע מתאימה להתנגדות של 1 kΩ. אלקטרודות באורך 2 ס"מ צריכות להיות בעלות התנגדות של 60-70 kΩ.</li>
	<li>התאם אישית את האוזניות על-ידי לקיחת עשרה סיכות בודדות (ראה טבלת חומרים). הלחמה כל סיכה עם חוט נחושת דק ורב גדילי בכבל.<ol>
<li>לחץ על פינים המולחמים עם זנבות הכבל המתאימים להם לתוך שקע הזיווג הכפול בעל 10 פינים (שקעים תואמים). לחץ על התאם את הפינים הפתוחים של שקע ההזדווגות לאוזניות LFP. בדרך זו, לכל אלקטרודה LFP יש חוט כבל ייעודי בהרכבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טבלו את הקצה של כל אלקטרודה LFP (שאת עמידותה יש למדוד) בתמיסת מלח NaCl של 0.9% (ריכוז NaCl בדם). חבר את קצה חוט הכבל המתאים לאלקטרודת LFP למסוף החיובי של האומטר.<ol>
<li>השתמש בחוט התנגדות נמוכה (̴100 Ω) עם צד אחד במים המלוחים ובצד השני כקצה הפתוח. חבר את הקצה הפתוח של החוט בעל ההתנגדות הנמוכה לקרקע של מצביע האומטר. הערה: סידור זה משלים את המעגל ומבקש סטייה של מצביע ה-ohmmeter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ודא שאין חיבור חשמלי בין שתי אלקטרודות כלשהן באוזניות. בדוק את הבידוד החשמלי של אלקטרודות LFP זוגיות (הארקה: כבל אחד מתאים לאלקטרודה אחת; חיובי: כבל אחר מתאים לאלקטרודה אחרת). השליכו את האלקטרודות אם נצפתה סטייה כלשהי במקרה זה.</li>
</ol>

<ol><li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents-EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptive+fields+of+single+neurones+in+the+cat%27s+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex.</a> The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).</li>
<li>O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+units+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Place units in the hippocampus of the freely moving rat.</a> Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).</li>
<li>Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+in+the+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial representation in the entorhinal cortex.</a> Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).</li>
<li>Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+intracellular+analysis+of+granule+cell+axon+reorganization+in+epileptic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats.</a> Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).</li>
<li>Driscoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+in+vivo+recording+using+transparent+graphene+microelectrodes+illuminates+spatiotemporal+seizure+dynamics+at+the+microscale%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale.</a> Communications Biology. 4, 1-14 (2021).</li>
<li>Roy, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+retrieval+by+activating+engram+cells+in+mouse+models+of+early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease.</a> Nature. 531, 508-512 (2016).</li>
<li>Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+entorhinal-hippocampal+ensemble+activity+during+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning.</a> Nature. 510, 143-147 (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+basal+ganglia+and+indirect+pathway+neurons+during+frontal+lobe+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures.</a> Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).</li>
<li>Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectivity+and+neuronal+synchrony+during+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Connectivity and neuronal synchrony during seizures.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).</li>
<li>Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+microdrive+arrays+for+chronic+neural+recordings+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50470(2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מבחינה היסטורית, מערכי מיקרו-אלקטרוניקה שימשו באופן נרחב לתיעוד פעילות עצבית מאזור מסוים במוח שמעניין 2,3,4,5,6,6,7,8,9,13. עם זאת, עיצוב המיקרו-אלקטרוניקה הקל שלנו מאפשר הקלטה ממספר מבנים בו זמנית11,12</...

פוטנציאל שדה מקומי (LFPs) הוא הפוטנציאלים החשמליים שנרשמו מהחלל החוץ-תאי במוח. הם נוצרים על ידי חוסר איזון בריכוזי יונים מחוץ לנוירונים ומייצגים את הפעילות של אוכלוסייה קטנה ומקומית של נוירונים, מה שמאפשר לנטר במדויק את הפעילות של אזור מוח מסוים בהשוואה לרישומי EEG בקנה מידה מאקרו1. כאומדן, המיקרו-אלקטרוניקה של LFP המופרדים על ידי 1 מ"מ תואמים לשתי אוכלוסיות שונות לחלוטין של נוירונים. בעוד שאות EEG מסונן על ידי רקמת מוח, נוזל מוחי, גולגולת, שריר ועור, אות LFP הוא סמן אמין לפעילות עצבית מקומית1.
לעתים קרובות חוקרים צריכים להקליט בו-זמנית LFPs מכמה מבנים מוחיים, אך מערכי מיקרו-אלקטרוניקה הזמינים באופן מסחרי לעתים קרובות אינם מציעים גמישות כזו. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-אלקטרוניקה הניתנת להתאמה אישית מלאה, הניתנת להתאמה אישית בקלות, כדי להקליט בו-זמנית LFPs מכל אזור מוח רצוי בעומקים שונים. למרות שנעשה שימוש נרחב ב-LFPs כדי לתעד את הפעילות העצבית של אזור מוח מסוים 2,3,4,5,5,6,7,8,9, העיצוב הנוכחי הניתן להתאמה אישית מאפשר הקלטת LFPs מכל אזורי מוח שטחיים או עמוקים מרובים 11,12 . ניתן גם לשנות את הפרוטוקול כדי לבנות כל מערך מיקרו-אלקטרוד רצוי על ידי קביעת קואורדינטות סטריאוטקסיות של אזורי המוח והרכבת המערך בהתאם. מיקרו-אלקטרוניקה אלה עם קצב דגימה של 10 קילוהרץ ועמידות של 60-70 kΩ (אורך 2 ס"מ) מאפשרים לנו להקליט LFPs בדיוק של אלפית השנייה. לאחר מכן ניתן להגביר את הנתונים על ידי מגבר בן 16 ערוצים, מסוננים (מעבר נמוך 1 הרץ, מעבר גבוה 5 קילוהרץ) ודיגיטציה.

<table><tbody><tr><td>מגבר מערכות</td><td>A-M</td><td>16 ערוצים דגם 3600</td><td>מגבר</td></tr><tr><td>קרניופלסטיקה צמנט</td><td>קולטן</td><td>פרם רילין/תיקון שרף סוג II Class I צל - מלט שקוף</td><td>להחזקת מיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>Cryostat Microtome</td><td>Precisionary</td><td>CF-6100</td><td>לחיתוך מוח</td></tr><tr><td>מצופה דיאמל חוט ניקל-כרום</td><td>ג'ונסון מת'י בע"מ.</td><td>50 ומיקרו; m</td><td>חוט מיקרואלקטרודה</td></tr><tr><td>Dremel</td><td>Dremel</td><td>300 סדרה</td><td>לקידוח חורים בגולגולת עכבר</td></tr><tr><td>אפוקסי</td><td>CEC Corp</td><td>C-POXY 5</td><td>דבק להגדרה מהירה</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>כל</td><td></td><td>להחזיק את האוזניות</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כל</td><td></td><td>להחזיק מיקרואלקטרודות מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>אור</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10</td><td>כדי לראות יישור</td></tr><tr><td>Ohmmeter</td><td>כל</td><td></td><td>כדי למדוד</td></tr><tr><td>פיני התנגדות (פסי-פינים ושקעים תואמים)</td> חברורי <td>Mill-Max</td><td>, סדרת 833, 2 מ"מ רשת כנף שחף הרכבה על פני השטח ושקעים</td><td>לחיבור מיקרו-אלקטרודות</td></tr><tr><td>לערכת צינורות Polymicro</td><td>Neuralynx</td><td>ID 100 &plusmn; 04 &micro; m, OD 164 &plusmn; 06 ומיקרו; M, עובי ציפוי 12 ומיקרו; m</td><td>צינורות זכוכית</td></tr><tr><td>ממריץ דופק</td><td>A-M Systems</td><td>דגם 2100</td><td>לסימון מיקום המיקרואלקטרודה בסוף ההקלטות</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כל</td><td></td><td>לחיתוך מיקרואלקטרודות</td></tr> דבק <tr><td>סופר דבק</td><td>גורילה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוט עבה 0.008 אינץ' &ndash; 0.011 אינץ'.</td><td>A-M Systems</td><td>791900</td><td>חוט תקתוק להחזקת מערך המיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>חוט דק 0.005 אינץ' - 0.008 אינץ'.</td><td>A-M Systems</td><td>791400</td><td>חוט דק לעיון והארקה</td></tr></tbody></table>

בניית מיקרו-אלקטרוניקה פוטנציאלית לשדה מקומי עבור הקלטות in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית

Construction of Local Field Potential Microelectrodes for in vivo Recordings from Multiple Brain Structures Simultaneously

חוקרים צריכים לעתים קרובות לתעד פוטנציאל שדה מקומי (LFPs) בו-זמנית מכמה מבני מוח. הקלטה מאזורי מוח רצויים מרובים דורשת עיצובים שונים של מיקרו-אלקטרוניקה, אך מערכי מיקרו-אלקטרוניקה הזמינים מסחרית לעתים קרובות אינם מציעים גמישות כזו. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התכנון הפשוט של מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית כדי לתעד LFPs ממבנים מוחיים מרובים בו-זמנית בעומקים שונים. עבודה זו מתארת את הבנייה של המיקרו-אלקטרוניקה הדו-צדדית בקליפת המוח, הסטריאטלית, הגחונית והמיקרו-אלקטרוניקה הניגרלית כדוגמה. עקרון התכנון המתואר מציע גמישות, וניתן לשנות ולהתאים אישית את המיקרו-אלקטרוניקה כדי להקליט LFPs מכל מבנה על ידי חישוב קואורדינטות סטריאוטקסיות ושינוי מהיר של הבנייה בהתאם כדי להתמקד באזורי מוח שונים בעכברים הנעים בחופשיות או מרדימים. מכלול המיקרו-אלקטרוניקה דורש כלים ואספקה סטנדרטיים. מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית אלה מאפשרים לחוקרים לתכנן בקלות מערכי מיקרו-אלקטרודה בכל תצורה כדי לעקוב אחר הפעילות העצבית, ולספק הקלטות LFP ברזולוציה של אלפית השנייה.

בעבודה זו, המיקרו-אלקטרוניקה של LFP שימשו למיפוי התפיסה שהתפשטה דרך הגרעינים הבסיסיים11. הקלטות LFP סימולטניות בוצעו מקליפת המוח הקדם-מוטורית הימנית (שם היה מוקד ההתקף) ומה-VL, הסטריאטום וה-SNR השמאליים (איור 4). תחילת ההתקף זוהתה כסטייה של עקבות המתח לפחות פי שניים מקו הבסיס (איור 4A, חץ אדום). תרשים ספקטרום ההספק11 מציג התפלגויות תדרים עבור ה-LFPs שנרשמו (איור 4A). ניתן להשוות בין חר...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בנייתם של מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית לתיעוד פוטנציאל שדה מקומי in vivo ממבנים מוחיים מרובים בו-זמנית.

Researchers often need to record local field potentials (LFPs) simultaneously from several brain structures. Recording from multiple desired brain regions ...

חוקרים צריכים לעתים קרובות לתעד פוטנציאל שדה מקומי ממבנים מרובים בו זמנית. תכנון המיקרו-אלקטרוניקה הקל שלנו מאפשר לנו להקליט LFPs מכמה מבני מוח בעומקים שונים בו זמנית. מיקרו-אלקטרוניקה הזמינים באופן מסחרי לעיתים קרובות חסרים גמישות ואינם מאפשרים להקליט ממבנים מוחיים מרובים.עיצוב המיקרו-אלקטרוניקה שלנו מאפשר לשנות בקלות את הבנייה כך שתתאים לכל מבנה רצוי. התחילו על ידי לקיחת חוט כרום ניקל מצופה דיאנה בקוטר 50 מיקרומטר. הדביקו קצה אחד של החוט לחלק האחורי של הרציף ועטפו את החוט שלוש פעמים סביב הידית הקרובה ביותר על הרציף.מתחו את החוט סביב הידית השנייה הרחוקה ביותר כדי ליצור שתי לולאות בין הידיות. עוטפים את החוט שלוש פעמים נוספות סביב הידית הראשונה כדי לתקן את החוט במקומו ולהדביק את הקצה בחלק האחורי של הפלטפורמה. הניחו את פסי המתח מתחת לחוטים כשהסרט עטוף סביבם.באמצעות מיקרוסקופ ומלקחיים עדינים, יוצרים מרווח של שלושה מילימטרים בין החוטים כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה של גרעין תלת-אלקטרודות קליפת המוח, הגחון-לרוחב, או מרווח של 4.5 מילימטרים כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה סטריאלית-נידרלית. אם נעשה שימוש בהגדלה במיקרוסקופ, הקפד לחשב ולהתאים את ההבדל בהגדלה ואת המרחק בפועל בין החוטים. חתכו ארבע חתיכות קטנות של פלסטיק בעובי 0.5 מילימטרים ברוחב של כשישה מילימטרים ובגובה של שלושה מילימטרים.יש למרוח דבק על הפלסטיק. מניחים את חתיכות הפלסטיק במרחק של כסנטימטר אחד מאמצע החוט, שנמצא במרחק של סנטימטר אחד ממוט המתח. מסירים עודפי דבק עם צמר גפן.לאחר שהדבק מתייבש, חותכים את החוט באמצעות מספריים עדינים. חותכים ארבעה צינורות זכוכית באורך שבעה מילימטרים באמצעות ערכה זמינה מסחרית ומחדירים את חוט האלקטרודה לצינורות הזכוכית. שים את הדבק בבסיס צינורות הזכוכית כדי לחבר אותם לפלסטיק.יש להמתין עד שהדבק יתייבש, ואז לחתוך את צינורות הזכוכית והחוטים באמצעות אזמל. השתמשו בדבק-על כדי לחבר פלסטיק בסדר הרצוי של אזורי המטרה. מרחו שרף אפוקסי סביב הפלסטיק כדי לקשור את האלקטרודות זו לזו.קחו חוט עבה ועשו לולאה בקצה אחד, טבלו את הלולאה בתמיסת האפוקסי והניחו אותה על הפלסטיק, תוך הבטחה שהחוט העבה שוכב שטוח כך שהחוט הזה יכול לשמש כידית. חותכים את החוט לשני סנטימטרים. קבץ את החוטים וגרד מילימטר אחד של הקצוות המבודדים עם אזמל.לכופף את האלקטרודות קליפת המוח ולהפריד את החוטים. באמצעות מלקחיים עדינים, צור לולאה בקצה כל חוט. החזיקו אוזניות עם 10 פינים עם המוסטאט והשתמשו בקצה העץ של ספוגית צמר גפן כדי למרוח כמויות מינימליות של שטף על הפינים.באמצעות קצה העץ של ספוגית הכותנה, יש למרוח שטף על לולאות החוטים. הלחימו את לולאות החוטים לאוזניות עם 10 פינים. ייבשו את האוזניות כדי למנוע קצר חשמלי בין הפינים.יש ליטול חוט דק של כ-0.05 עד 0.008 אינץ' עבור חוטי ייחוס וקרקע ולהפשיט את הפלסטיק מקצה אחד. צור לולאה בקצה השני של החוט. הלחימו את הצד המופשט של חוטי הייחוס וההארקה לפינים המתאימים להם.כשהוא אוחז בחוט העבה, מורחים מלט קרניופלסטי סביב המיקרו-אלקטרוניקה, במיוחד כאשר החוטים מתחברים לפינים. הימנעו מלגעת בקצוות האלקטרודה הממשיים עם המלט. לאחר שהמלט מתייבש, מניחים שרף אפוקסי בבסיס צינורות הזכוכית, חוטי מיקרו-אלקטרוניקה סטריאליים וסביב האלקטרודה כולה.הימנעו מלגעת באלקטרודה מסתיימת בשרף אפוקסי. הקלטות פוטנציאליות שדה מקומיות בוצעו מקליפת המוח הקדם-מוטורית הימנית, ה-VL השמאלי, הסטריאטום וה-SNR. תחילת ההתקף זוהתה כסטייה של עקבות המתח לפחות פי שניים מקו הבסיס.מתווה ספקטרום ההספק מציג את התפלגות התדרים עבור ההקלטות הפוטנציאליות המקומיות המוקלטות. ניתן להשוות בין איחורים בהתקף בין כל מבנה בדיוק של אלפית השנייה. דופק זרם הופעל בסוף ההקלטות כדי לסמן ולאשר את מיקום קצות האלקטרודות היוצרות את הנגע.אם המיקרו-אלקטרוניקה בנויה עבור מבנים מוחיים שונים, זכרו לשנות את המרווחים בין החוטים בהתאם לקואורדינטות הסטראוטקטיות של המבנה הרצוי. מניחים את אלקטרודות המבנה העמוק לתוך צינורות הזכוכית ומתאימים את אורכי המיקרו-אלקטרוניקה. לאחר מכן, חברו את הפלסטיק בהזמנה הנדרשת.

construction-local-field-potential-microelectrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נושא מהותי להבנת המעגלים קליפת המוח היא כיצד רשתות בשכבות קורטיקליים שונים לקודד מידע חושי. כאן אנו מתארים טכניקות אלקטרו ניצול רב מגע אלקטרודות למינרית להקליט יחיד יחידות הפוטנציאלים בשדה המקומי ומנתח הנוכחי לזהות שכבות בקליפת המוח.

בחינת עיבוד הרשת המקומית באמצעות מגע Multi-אלקטרודה למינרית הקלטה

סרטון זה מדגים את ההליך המפורט להכנת חולדה מורדמת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מוחית מאתרים מרובים. הקרקפת מנותחת כדי לגשת לגולגולת, וחורים נקדחים במקומות מדויקים כדי להתקין ולאבטח אלקטרודות. אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן מוכנסות לאחר מכן למיקום היעד כדי להקליט את הנתונים.

In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות

סרטון זה מדגים הקלטה in vivo של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) מאזורי M2 דו-צדדיים במוח העכבר. עכבר מורדם מאובטח ומוכן להליך. כדי להקליט LFPs, הכנס מיקרואלקטרודות לקואורדינטות המטרה של אזורי M2 הדו-צדדיים, האחראים על תנועות מוטוריות מורכבות.

רישום פוטנציאל שדה מקומי משתי ההמיספרות של מוח העכבר

הסרטון מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית סימולטנית מאזורי מוח מרובים בחולדה באמצעות מערך מיקרו-כונן אינטגרטיבי. אלקטרודות הקלטה ממוקמות בנורת הריח, אלקטרודות ייחוס בקליפת המוח המצחית, ואלקטרודות מערך מיקרו-כונן בהיפוקמפוס. החולדה מורשית לחפש מזון באופן חופשי, והקלטה סימולטנית מכל האלקטרודות המושתלות נרשמת באמצעות המערך.

שיטת מערך מיקרו-כוננים להקלטה אלקטרופיזיולוגית מאזורי מוח מרובים

סרטון זה מדגים את ההליך להקלטות בו-זמניות של אלקטרואנצפלוגרפיה מקומית (EEG) ופוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) בחולדה מורדמת. התהליך כולל הכנת החולדה והצמדת אלקטרודות מעוררות לכריות השפם שלה. אלקטרודת עכביש EEG ממוקמת על גולגולת החולדה לצורך מדידות EEG על פני השטח. במקביל, מיקרואלקטרודה רב-ערוצית מוחדרת לאזור מסוים במוח דרך חור בגולגולת כדי לרשום פעילות עצבית מאזור מקומי במוח.

הקלטות פוטנציאליות אלקטרואנצפלוגרפיות ומקומיות בו-זמנית בחולדה מורדמת

במחקר זה, מתודולוגיה מוצג על איך לבצע באתר מרובה in vivo הקלטות אלקטרו מכיון hyperdirect תחת הרדמה urethane.

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ו- multi-למינריות שדה מקומי פוטנציאל עכברוש anesthetized. חור burr בתלמידים הגולגולת עבור הכניסה של microelectrode מוצג לייצר עיוות זניח של האות EEG.

הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם ופוטנציאל שדה מקומי במכרסם

מחקר זה מציג שיטה עבור ההקלטה סימולטני של שדה מקומי פוטנציאל המוח, electrocardiograms, electromyograms, ונשימה אותות של חולדה נעה בחופשיות. טכניקה זו, אשר מפחית את עלויות ניסיוני ומפשטת את ניתוח הנתונים, יתרום להבנה של אינטראקציות בין המוח לבין איברים היקפיים בגוף.

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של רישום חוץ-תאי בקליפת המוח המוטורית (MC) כדי לחשוף תכונות אלקטרופיזיולוגיות חוץ-תאיות בעכברים מודעים הנעים בחופשיות, כמו גם ניתוח נתונים של פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) וקוצים, אשר שימושי להערכת הפעילות העצבית ברשת העומדת בבסיס התנהגויות מעניינות.

הקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית בעכברים הנעים בחופשיות

כאן, אנו מציגים שתל ייחודי הניתן להדפסה בתלת-ממד עבור חולדות, בשם TD Drive, המסוגל להקליט אלקטרודות תיל סימטריות דו-צדדיות, כיום בעד עשרה אזורי מוח מבוזרים בו זמנית.

כונן TD: שתל פרמטרי בקוד פתוח לרישומים אלקטרופיזיולוגיים רב-אזוריים בחולדות מתנהגים וישנים

פיתחנו גישה פשוטה וחסכונית לייצור אלקטרודות וערכנו הקלטות של אותות באזורים מרובים בעכברים הנעים בחופשיות. שימוש באופטוגנטיקה, לצד אלקטרופיזיולוגיה רב-אזורית ורישום אותות סידן, איפשר גילוי של פעילויות עצביות באזורים שונים במודל הצתת ההתקפים.

שיטה משולבת ליצירת אופטרודים אלקטרופיזיולוגיים גמישים ונוחים להקלטה רב-אזורית in vivo

למדו לבנות מערכי מיקרו-אלקטרודות מותאמים אישית להקלטת פוטנציאלים שדה מקומיים in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית. השיטה מאפשרת הקלטות מדויקות בעומקים שונים ומספקת גמישות רבה יותר ממוצרים מסחריים.

בניית מיקרו-אלקטרוניקה פוטנציאלית לשדה מקומי עבור הקלטות in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית

גלה סרטונים נוספים