יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

RNAi הפך לשיטה יעילה לזיהוי תפקוד הגנים בנמטודות והם מוצעים כדרך חדשה לשלוט ביעילות בנמטודות פתוגניות. RNAi הוא השריית נמטודות ב- dsRNA יכול להספיק להליך. כדי להתחיל, לאסוף את הנמטודות בשיטת משפך Baermann.

לשם כך, מניחים צינור גומי מהודק מתחת למשפך ומניחים שתי שכבות של נייר סינון בפתח המשפך. מעבירים את תרביות הפטריות Botrytis cinerea למשפך ומוסיפים מים כדי לטבול את מחצלת הפטריות. כאשר נמטודות נאספות, הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ו -100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר.

שואפים 20 microliters של נמטודות לטחון את הדגימות ב 9, 000 x גרם במשך 30 שניות. דגירה במשך חמש דקות צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה טרי.

מוסיפים 100 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה במשך שלוש דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה טרי.

מוסיפים 250 מיקרוליטרים של אלכוהול איזופרופיל ומערבולות במרץ. צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות מערבולת. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 500 מיקרוליטרים של 75% אתנול כדי לשטוף את הרנ"א.

מערבולת המדגם ואחריו צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. האוויר מייבש את גלולת הרנ"א במשך חמש דקות ומשעה אותה ב-30 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase. חשב את ריכוז הרנ"א באמצעות נוסחה זו וחשב את היחס A260 ל- A280.

לאחר מכן, השתמש בזוג פריימרים כדי להגביר את רצף הקידוד החלקי של הגן BX ppm-1 מה-B.xylophilus. לאחר מכן שכפלו את רצפי הגנים ppm-1 לתוך וקטור pGEM-T Easy המכיל את מקדם T7. שחזר את שבר הגן הארוך ppm-1 של זוג הבסיסים 894 על ידי שימוש בפלסמיד המשובט כתבנית עבור pcr.

לאחר מכן, השתמש בערכת שעתוק חוץ גופית כדי לסנתז את ה- dsRNA. נתחו את איכות ה-dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר ודמיינו את המוצרים על ג'ל 1%agarose. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של חיץ השרייה פי 5 והרכיבו את הנפח ל-20 מיקרוליטרים עם מים מזוקקים כפולים כדי לקבל ריכוז RNA סופי של 0.8 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן מניחים את הנמטודות בצלחת במשך 30 דקות ומחכים שהביצים יידבקו לתחתית. מסירים בזהירות את המים והנמטודות מבלי להפריע לביצים עד שרק הביצים נשארות בצלחת. בקעו את הביצים שנאספו בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זחלי J2.

לאסוף את הזחלים בצינור ולשטוף אותם שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, העבר את הזחלים לתוך הצינור המכיל את תמיסת dsRNA. לשם כך, הוסף תמיסת רסורצינול כדי לקבל פתרון של 1%.

הניחו את הזחלים על שולחן רועד כדי להבטיח ספיגה מספקת של dsRNA לתוך הזחלים. עבור בקרות, השרו את אותה כמות של נמטודות במאגר ההשריה ללא בדיקת dsRNA או עם בדיקת GFP dsRNA. בצע qPCR תוך שימוש בגנים actB ו- tbb-2 כהפניות פנימיות כדי להעריך את השינויים ברמת ביטוי הגנים.

השתמש בשיטת הדלתא דלתא Ct כדי להעריך את רמת ביטוי הגנים היחסית מעקומת הפירוק וערך Ct. לאחר RNAi, תרבו את זחלי J2 עד לבגרותם על מדשאות בוטריטיס סינראה על צלחות PDA. אסוף את המבוגרים בשיטת משפך בארמן כפי שמוצג בחלק הראשון.

רכשו תמונות של הנמטודות הבוגרות תחת מיקרוסקופ והשתמשו בתוכנת ImageJ כדי למדוד את אורך הגוף של 50 נמטודות זכריות ו-50 נקבות. נתח את הנתונים על-ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. החל את מבחן t של התלמיד כדי להשוות את האמצעים של הדגימות מהקבוצות השונות.

ניתוח ביטוי גנים יחסי לאחר RNAi הצביע על כך ש- ppm-1 dsRNA יכול לעכב ביעילות את הביטוי של הגן ppm-1 של B.Xylophilus. ואילו ל-GFP dsRNA אקסוגני לא הייתה השפעה על ביטוי ppm-1. לאחר RNAi, גודל המבוגרים ירד במידה ניכרת למרות שהגיעו לבגרות מינית וכתוצאה מכך הפנוטיפ המוטנטי בגודל הגוף הקטן.

אורך הגוף הממוצע של הנקבות והזכרים המוטנטים היה 544 ו 526 מיקרומטר לעומת 971 ו 912 מיקרומטר עבור קבוצת הביקורת הדבר החשוב ביותר הוא להעביר את הנמטודות לתוך תמיסת RNA גדיל כפול ולהוסיף מגיב נוסף כדי לעורר את הנמטודות להאכיל. שיטה זו מתאימה לסריקת גנים בקנה מידה גדול ומשמשת בדרך כלל בחקר תאים. לחקר תפקוד הגן של B.Xylophilus בשיטה זו יש ערך מנחה להדברה ביולוגית של B.Xylophilus.