Name: יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצוס קסילופילוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: למד שיטת השרייה ל-RNAi בנמטודת אורן Bursaphelenchus xylophilus לחקר תפקודי גנים. השיטה מאפשרת עיכוב ביטוי הגן ppm-1 וזיהוי שינויים פנוטיפיים בגודל הגוף, ומשמשת בסיס לבקרה ביולוגית של נמטודות מחוללות מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31870637, 31200487) ומומן במשותף על ידי תוכנית המחקר המרכזית של ג'ה-ג'יאנג (2019C02024, LGN22C160004).

המחקר אושר על ידי המועצה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לחקלאות וייעור. B. xylophilus מבודד NXY61 הופק במקור מפינוס מסוניאנה חולה באזור נינגבו במחוז ג'ה-ג'יאנג, סין11.
1. שיבוט גנים
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הפריימרים המשמשים בפרוטוקול זה.
<ol><li>לאסוף נמטודות.<ol><li>תרבית את זן B. xylophilus על התפטיר של Botrytis cinerea על צלחות דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים.</li>
		<li>אסוף את הנמטודות בשיטת משפך בלמן14.<ol><li>מניחים צינור גומי מהודק מתחת למשפך ומניחים שתי שכבות של נייר סינון בפתח המשפך. העבירו את תרביות הפטריות למשפך והוסיפו מים לטבילת מחצלת הפטריות. המתן שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את הנמטודות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>חלץ את סך הרנ"א מהנמטודות באמצעות מגיב מיצוי RNA כולל (ראה טבלת החומרים)11 בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>הוסף 500 μL של מגיב מיצוי ו 100 μL של חרוזים מגנטיים לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. שאפו 20 μL של הנמטודות והעבירו את הדגימה למטחנה לטחינה ב 9,000 × גרם במשך 30 שניות. דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 100 μL של כלורופורם, מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה במשך 3 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 250 μL של אלכוהול איזופרופיל ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות.</li>
		<li>השליכו את הסופר-נטנט. הוסף 500 μL של 75% אתנול כדי לשטוף את הרנ"א ולאחר מכן מערבל את הדגימה. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA במשך 5 דקות.</li>
		<li>יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.</li>
		<li>חישוב ריכוז הרנ"א באמצעות הנוסחה: A260 דילול × × 40 = מיקרוגרם RNA/mL. חשב את היחס A260/A280. הערה: יחס של ~2 נחשב טהור.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע שעתוק הפוך של RNA באיכות טובה כדי לקבל את תבנית cDNA.<ol><li>תכנן והשתמש בזוג פריימרים ספציפיים, ppm-1-F/R (ראה טבלת החומרים), כדי להגביר את רצף הקידוד החלקי של הגן Bx-ppm-1 ב- B. xylophilus (מספר ההצטרפות של GenBank QTZ96795). </li>
		<li>שכפלו את רצפי הגנים ppm-1 לווקטור pGEM-Teasy המכיל את מקדם T7 בעקבות פרוטוקול שיבוטסטנדרטי 11.<ol><li>הגדר את תגובות ה-PCR באופן הבא: 2 μL של cDNA, 25 μL של 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים לנפח סופי של 50 μL.</li>
			<li>בצע את הליך ההגברה כדלקמן: 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס; ואחריו 35 מחזורים של 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס; ושלב הארכה סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
			<li>שכפלו את המוצרים המוגברים לווקטור pGEM-T Easy לריצוף.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. סינתזה של dsRNA
<ol><li>הכן את תבנית הדנ"א לסינתזת dsRNA באמצעות PCR עם פריימרים שנועדו להוסיף אתרי מקדם T7 בשני הקצוות. הוסף את רצף מקדם T7 לסוף 5' של הפריימרים.</li>
	<li>השתמש בפלסמיד המכיל את מקטע הגן ppm-1 (894 bp) כתבנית עבור PCR ושחזר את השבר המכיל את מקדם T711. השתמש בהליך PCR ובמערכת שתוארו לעיל.</li>
	<li>השתמש בערכת שעתוק במבחנה כדי לסנתז dsRNA11.<ol><li>הפשירו את הריאגנטים הקפואים על הקרח.</li>
		<li>הוסף 2 μL של 10x מאגר תגובה, 2 μL של תערובת אנזימים, ו 1 מיקרוגרם של DNA לצינור צנטריפוגה. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי לייצר תגובה סטנדרטית של 4 μL. לאחר מכן, ערבבו נפחים שווים של ארבעת תמיסות הריבונוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP ו-UTP) יחד והוסיפו 8 μL של התערובת לצינור. מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.</li>
		<li>הוסיפו 1 μL של DNase, ערבבו היטב ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>עצרו את התגובה והוסיפו 30 μL של מים נטולי נוקלאז ו-30 μL של תמיסת משקעים LiCl כדי לזרז את ה-RNA. מערבבים היטב. דגירה ב-20°C- למשך הלילה.</li>
		<li>צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של 75% אתנול כדי לשטוף את ה- RNA. מערבלים את הדגימה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA למשך 3 דקות.</li>
		<li>יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.</li>
		<li>נתח את איכות ה- dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר. Pipette 1 μL של דגימת dsRNA על מעמד המדידה ולהגדיר את אורך הגל ל 340 ננומטר. דמיינו את המוצרים על ג'ל אגרוז 1.0%.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RNAi על ידי השרייה
<ol><li>יש לערבב 4 μL של מאגר השרייה 5x (0.05% ג'לטין, 5.5 mM KH 2 PO 4, 2.1 mM NaCl, 4.7 mM NH4 Cl, 3 mM זרעונידין) עם dsRNA ו-ddH2O כדי לייצר נפח כולל של 20 μLוריכוז RNA סופי של 0.8 מיקרוגרם למ"ל.</li>
	<li>לרכוש זחלי J2.<ol><li>אוספים את הנמטודות מתרביות הפטריות ומעבירים אותן לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 6 ס"מ. הוסיפו 10 מ"ל מים למנה כדי להבטיח שהנמטודות יוכלו לשחות בחופשיות. שומרים את הנמטודות בצלחת במשך 30 דקות ומחכים שהביצים יידבקו לתחתית.</li>
		<li>הסר את המים והנמטודות בזהירות, תוך הקפדה לא להפריע לביצים. חזור על השלבים עד שכל הזחלים והבוגרים יוסרו, וישאירו רק את הביצים בצלחת.</li>
		<li>בקעו את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להשיג זחלי J2. אספו את זחלי J2, הניחו אותם בצינור ושטפו אותם שלוש פעמים עם ddH2O לניסוי RNAi15.</li>
		<li>מעבירים את זחלי J2 לצינור 2 מ"ל המכיל את תמיסת ה-dsRNA ומוסיפים תמיסת רסורצינול (עטופה בפח ומומסת במים) כדי לייצר ריכוז סופי של 1.0%. דגרו את הזחלים עם צנטריפוגה ב-15 × גרם על שולחן רועד במשך 24 שעות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהזחלים יספגו ביעילות את ה-dsRNA.</li>
		<li>השרו את אותה כמות של נמטודות במאגר ההשריה ללא בדיקת dsRNA או עם בדיקת GFP dsRNA כבקרה. השתמש בגן GFP (gfp, M62653.1) כבקרה לא אנדוגנית וסנתז את ה- dsRNA של gfp באמצעות פריימרים ספציפיים לגן T7-GFP-F/R.</li>
	</ol></li>
</ol>4. זיהוי qPCR
<ol><li>נקו את זחלי J2 עם ddH2O, כולל אלה עם הפרעה לגני המטרה, הפרעות גנטיות GFP וקבוצת הביקורת ללא הפרעה. חלץ את סך הרנ"א מכל קבוצה בשיטה שתוארה לעיל.</li>
	<li>הפעל את ה- qPCR.<ol><li>תכנן את פריימרים q-ppm-1-F/R באמצעות התוכנה הרצויה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>הגדר את תגובת qPCR ב-12 μL המכילה 1 μL של cDNA, 6 μL של פרמיקס פלואורסצנטי, 0.4 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים.</li>
		<li>בצע qPCR באופן הבא: 2 דקות ב 95 °C; ואחריו 40 מחזורים של 10 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>השתמש בגן actb (מספר ההצטרפות של GenBank EU100952) ובגן tbb-2 (מספר ההצטרפות של GenBank MT769316), או בגנים אחרים, כגני ייחוס פנימיים כדי להעריך את השינויים ברמת ביטוי הגנים לאחר RNAi15.</li>
	</ol></li>
	<li>על פי ערך סף המחזור (Ct) ועקומת הפירוק, השתמש בשיטת 2-ΔΔCt כדי להעריך את רמת הביטוי היחסית של גן המטרה ולאמת את יעילות ההפרעה.<ol><li>הפחת את ערך ה- Ct של גן הייחוס הפנימי של כל דגימה מערך ה- Ct של גן המטרה כדי לקבל את ערך ה- ΔCt. לאחר מכן, הפחת את ערך ΔCt של קבוצת ההפרעות מערך ΔCt של קבוצת הביקורת כדי לקבל את הערך ΔΔCt. הערה: ערך ΔΔCt הגדול מ- 0 מציין שההפרעה יעילה.</li>
	</ol></li>
</ol>5. להעריך את אורך הגוף של מבוגרים נמטודה בעקבות RNAi
<ol><li>לאחר RNAi, תרבו את זחלי J2 עד לבגרותם על מדשאות B. cinerea בצלחות PDA במשך 60 שעות ב 25 מעלות צלזיוס15.</li>
	<li>אסוף את המבוגרים בשיטת משפך בלמן (ראה שלב 1.1.2.1)14.</li>
	<li>רכשו תמונות של הנמטודות הבוגרות תחת מיקרוסקופ והשתמשו בתוכנת ImageJ (או תוכנת מדידה אחרת) כדי למדוד את אורכי הגוף.<ol><li>מדוד את האורך באמצעות ImageJ על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה. אם המרחק ידוע, הזן את ערך האורך של הקו הישר המצויר. הזן את יחידת האורך.</li>
		<li>סמן את תיבת הסימון כללי (השתמש בתקן זה עבור כל התמונות) ולחץ על אישור כדי לבחור את האורך שיש למדוד באמצעות קו ישר בתמונה שיש למדוד.</li>
		<li>השתמש בפקודה Ctrl+M (מדידה) כדי להציג את התוצאות ולהקליט אותן בחלון התוצאות .</li>
	</ol></li>
	<li>קח מדידות של 50 נמטודות זכריות ו -50 נקבות לניתוח סטטיסטי12.</li>
	<li>נתח את הנתונים על-ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. השווה את האמצעים של הדגימות מהקבוצות השונות באמצעות מבחן t של סטודנט.</li>
</ol>

<ol><li>Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicol%2C+JM+%22Genomics+and+Molecular+Genetics+of+Plant-Nematode+Interactions%22">Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions</a>. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).</li>
<li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).</li>
<li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li>
<li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+technology+extends+its+reach%3A+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li>
<li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).</li>
<li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode%2C+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bxy-fuca+encoding+%CE%B1-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li>
<li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forestry+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li>
<li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples%3A+Baermann+funnel+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li>
<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).</li>
<li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li>
<li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%2C+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%3A+GMR%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li>
<li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li>
<li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+Soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li>
<li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li>
<li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li>
<li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li>
<li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+%28+in+Chinese%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phytopathologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li>
<li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).</li>
<li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).</li>
<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

למרות שהיסטוריית החיים והסביבה הטפילית של B. xylophilus שונים מאלו של נמטודות אחרות, היה מחקר מוגבל על הפתוגנזה המולקולרית של פתוגן צמח זה. למרות ההתקדמות הרבה שהושגה ביישום טכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR/Cas9 ב-C. elegans ובנמטודות אחרות, רק טכנולוגיית RNAi המיושמת על B. xylophilus פורסמה עד כה17. RNAi הוא אחד הכלים החזקים ביותר הזמינים לחקר תפקוד הגן של נמטודות ונמצא בשימוש נרחב במחקר המבהיר את תפקוד הגן B. xylophilus, מסלולי התמרת אותות וטיפול גנטי<sup class="...

<a href="https://app.jove.com/t/6669">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/63645-v">10.3791/63645-v</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63645">Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus</a>. The Abstract and Protocol section was updated.

Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

נמטודות טפיליות-צמחיות (PPNs) מהוות איום מתמשך על ביטחון המזון ועל המערכות האקולוגיות של היערות. הם גורמים להפסדים כלכליים של כ-100 מיליארד דולר בכל שנה1, כאשר הבעייתיים שבהם הם בעיקר נמטודות שורשים, נמטודות ציסטות ונמטודות מעץ אורן. נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא נמטודה נודדת, אנדופרזיטית, שהיא הפתוגן הסיבתי של מחלת אורן נבול2. הוא גרם נזק רב ליערות אורנים ברחבי העולם3. אם נשתמש בטרמינולוגיה של Van Megen et al.4, B. xylophilus הוא חבר ב-Parasitaphelenchidae ושייך לקלייד 10, בעוד שרוב טפילי הצמחים הגדולים האחרים שייכים לקלייד 12.
כטפיל צמחי עצמאי שהתפתח לאחרונה, ב. קסילופילוס הוא מודל אטרקטיבי למחקרים השוואתיים. עד כה, היה מחקר משמעותי על נמטודות קשר שורש ונמטודות ציסטות השייכות לקלייד 12, שהן אנדופרזיטים מחייבים, בישיבה והן חלק מהנמטודות הנחקרות ביותר. עם זאת, ביצוע מחקר נוסף בתחום חשוב זה טומן בחובו אתגר גדול: תפקודם של גנים של טפילות הוא צוואר בקבוק מחקרי. מחקרים פונקציונליים כוללים בדרך כלל ביטוי חוץ רחמי וניסויי נוק-דאון/אאוט, אך מסתמכים על פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית יעילים עבור הנמטודה. כתוצאה מכך, גנטיקה הפוכה ב-PPNs מסתמכת כמעט אך ורק על השתקת גנים על ידי RNAi.
RNAi, מנגנון הקיים באופן נרחב בתאים אאוקריוטים, משתיק ביטוי גנים על ידי החדרת RNA דו-גדילי (dsRNA)5. עד כה, מנגנון השתקת הגנים שלאחר ההדבקה המושרה על ידי dsRNA נמצא בכל האאוקריוטים שנחקרו, וטכנולוגיית RNAi, ככלי למחקר גנומי פונקציונלי ויישומים אחרים, התפתחה במהירות באורגניזמים רבים. מאז גילוי מכונות ה- RNAi ב- Caenorhabditis elegans בשנת 19986, טכניקות RNAi הפכו לשיטות יעילות לזיהוי תפקוד הגן של נמטודות ומוצעות כדרך חדשה לשלוט ביעילות בנמטודות פתוגניות7.
מבחינה טכנית, ה-RNAi סופג את הצעירים ב-dsRNA; עם זאת, היעילות והשכפול של גישה זו משתנות מאוד עם מיני הנמטודות ועם גן המטרה8. השתקה של 20 גנים המעורבים במסלולי ה-RNAi של נמטודת קשר השורש, Meloidogyne incognita, נחקרה באמצעות dsRNAs ארוכים כטריגרים, וכתוצאה מכך תגובות מגוונות, כולל עלייה וללא שינוי בביטוי של גנים מסוימים9. תוצאות אלה מראות כי גני מטרה עשויים להגיב להפלת RNAi באופן שונה, מה שמחייב הערכה ממצה של התאמתם כמטרות לבקרת נמטודות באמצעות RNAi. עם זאת, יש כיום מיעוט של מחקר על הביולוגיה ההתפתחותית והרבייה של ב 'קסילופילוס.
כהמשך לעבודה קודמת10,11,12,13, אנו מתארים כאן פרוטוקול ליישום RNAi כדי לחקור את תפקוד הגן ppm-1 של B. xylophilus, כולל סינתזה של dsRNA, השריית נוירוסטימולנטים סינתטיים וזיהוי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR). הידע שיתקבל מגישה ניסיונית זו צפוי לתרום רבות להבנת מערכות ביולוגיות בסיסיות ולמניעת מחלת האורנים.

<table><tbody><tr><td>משפך ברמן</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>לבודד נמטודות</td></tr><tr><td>Beacon Designer 7.9</td><td>חברת טכנולוגיית המידע של שנחאי קאנגיושנג</td><td>לא זמין</td><td>לעיצוב פריימרים של qPCR</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>כמזון לנמטודות</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>מספרו היה NXY61 והוא הופק במקור מ-Pinus massoniana החולה בנינגבו, מחוז ג'ג'יאנג, סין.</td></tr><tr><td>חממת טמפרטורה קבועה</td><td>חברת הכלים המעבדתיים של שנגחאי ג'ינג הונג</td><td>H1703544</td><td>לנמטודות גידול</td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1704466</td><td>להשגת ניתוח אלקטרופורטי</td></tr><tr><td>אתנול, 75%</td><td>חברת סינופארם ריגנט כימיקלים</td><td>80176961</td><td>לחילוץ RNA</td></tr><tr><td>פרימיקס אקס טאק פולימראז</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR030A</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>פרימיקס אקס טאק פולימראז</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR390A</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>מדמת ג'ל</td><td>חברת LongGene Scientific Instruments</td><td>LG2020</td><td>כדי להפוך רצועות חומצות גרעין לגלויות</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>פריזמת GraphPad</td><td>לא זמין</td><td>לנתח את הנתונים וליצור דמויות</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מהירה</td><td>חברת הנגג'ואו אלשנג אינסטרומנטס</td><td>AS0813000</td><td>צנטריפוג</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות עם שטף גבוה</td><td>ברטין</td><td></td><td>לחילוץ RNA</td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>לא זמין</td><td>למדוד את אורכי הגוף</td></tr><tr><td>אלכוהול איזופרופיל</td><td>חברת שנגחאי אלאדין ביוכימית לטכנולוגיה</td><td>L1909022</td><td>לחילוץ RNA</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לייקה DM4B</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>לצפות בנמטודות</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים</td><td>חברת המדע והטכנולוגיה של אאורן.</td><td>150010C</td><td>לחילוץ RNA</td></tr><tr><td>ערכת תמלול MEGAscript T7 עם תפוקה גבוהה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.</td><td>AM1333</td><td>לסנתז dsRNA במבחנה</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-2000</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.</td><td>ננודרופ 2000/2000C</td><td>לנתח את איכות ה-dsRNA</td></tr><tr><td>מגבר PCR</td><td>חברת Bio-Rad Life Medical Products</td><td>1851148</td><td>להגברת רצף חומצות גרעין</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>לנמטודות גידול</td></tr><tr><td>וקטור קל pGEM-T</td><td>חברת פרומגה</td><td>A1360</td><td>לשיבוט</td></tr><tr><td>אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (בינוני)</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>to cultur Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>ערכת ריאגנט RT של Prime Script עם מחק gDNA</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR047B</td><td>ל-cDNA סינתטי</td></tr><tr><td>פריימר פרימייר 5.0</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>לא זמין</td><td>לעיצוב פריימרים של PCR</td></tr><tr><td>פריימרים:ppm-1-F/R</td><td>חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיה</td><td>לא זמין</td><td>חלוץ: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיה</td><td>לא זמין</td><td>חלוץ: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>מחזור תרמי בזמן אמת &nbsp; qTOWER 2.2</td><td>אנליטיק ג'נה אינסטרומנטס (בייג'ינג)</td><td></td><td>עבור qPCR</td></tr><tr><td>שולחן רועד</td><td>חברת שנגחאי ג'יצ'נג לייצור מכשירים אנליטיים</td><td></td><td>להשרות נמטודות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>חברת הכלים של צ'ונגצ'ינג אופטק.</td><td>1814120</td><td>לצפות בנמטודות</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיה</td><td>לא זמין</td><td>חלוץ: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; מקדם T7</td><td>חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיה</td><td>לא זמין</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>ערכת חילוץ DNA של ג'ל אגרוז Takara MiniBEST</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>9762</td><td>לשחזור DNA</td></tr><tr><td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR820A</td><td>עבור qPCR</td></tr><tr><td>טריכלורואתאן</td><td>חברת שנגחאי לינגפנג לחומרים כימיים</td><td></td><td>לחילוץ RNA</td></tr><tr><td>ריאגנט טריזול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.</td><td>15596026</td><td>תגובת הפקת RNA כוללת, לחילוץ RNA</td></tr></tbody></table>

יישום של הפרעת rna בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

נמטודת עצי האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא אחד המינים הפולשים ההרסניים ביותר בעולם, וגורמת בסופו של דבר למותם של עצי אורן. למרות ההכרה בחשיבותם הכלכלית והסביבתית, עד כה לא ניתן היה לחקור את תפקודי הגנים המפורטים של נמטודות טפיליות צמחיות (PPNs) באמצעות גנטיקה קונבנציונלית קדימה ושיטות מהונדסות. עם זאת, כטכנולוגיה של גנטיקה הפוכה, הפרעות RNA (RNAi) מקלות על חקר הגנים הפונקציונליים של נמטודות, כולל B. xylophilus. 
מאמר זה מתווה פרוטוקול חדש ל-RNAi של הגן ppm-1 ב-B . xylophilus, אשר דווח כי הוא ממלא תפקידים מכריעים בהתפתחות וברבייה של נמטודות פתוגניות אחרות. עבור RNAi, מקדם T7 היה מקושר למסוף 5′ של מקטע המטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ורנ"א דו-גדילי (dsRNA) סונתז על ידי שעתוק במבחנה . לאחר מכן, אספקת dsRNA הושגה על ידי השריית הנמטודות בתמיסת dsRNA מעורבבת עם נוירוסטימולנטים סינתטיים. צעירים מסונכרנים של B. xylophilus (כ-20,000 פרטים) נשטפו והושרו ב-dsRNA (0.8 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר ההשריה במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
אותה כמות של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג ללא dsRNA כבקרה. בינתיים, כמות זהה נוספת של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג עם הגן dsRNA של חלבון פלואורסצנטי ירוק (gfp) כבקרה. לאחר ההשרייה, רמת הביטוי של תמלילי היעד נקבעה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. ההשפעות של RNAi אושרו לאחר מכן באמצעות תצפית מיקרוסקופית של הפנוטיפים והשוואה של גודל הגוף של המבוגרים בין הקבוצות. הפרוטוקול הנוכחי יכול לסייע בקידום המחקר כדי להבין טוב יותר את תפקודם של הגנים של B. xylophilus ונמטודות טפיליות אחרות לקראת פיתוח אסטרטגיות בקרה באמצעות הנדסה גנטית.

ניתוח של ביטוי ppm-1 של B. xylophilus לאחר RNAi רמת הביטוי היחסית של הגן ppm-1 של B. xylophilus ספוג ב-GFP dsRNA וספוג ב-dsRNA של גן המטרה הייתה 0.92 ו-0.52, בהתאמה (רמת הביטוי של הגן ppm-1 בקבוצת הביקורת שטופלה ב-ddH2O נקבעה ל-1) (איור 1). לפיכך, ל-dsRNA אקסוגני אין השפעה על הביטוי ppm-1 של B. xylophilus; עם זאת, ppm-1 ds...

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi הפך לשיטה יעילה לזיהוי תפקוד הגנים בנמטודות והם מוצעים כדרך חדשה לשלוט ביעילות בנמטודות פתוגניות. RNAi הוא השריית נמטודות ב- dsRNA יכול להספיק להליך. כדי להתחיל, לאסוף את הנמטודות בשיטת משפך Baermann.לשם כך, מניחים צינור גומי מהודק מתחת למשפך ומניחים שתי שכבות של נייר סינון בפתח המשפך. מעבירים את תרביות הפטריות Botrytis cinerea למשפך ומוסיפים מים כדי לטבול את מחצלת הפטריות. כאשר נמטודות נאספות, הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ו -100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר.שואפים 20 microliters של נמטודות לטחון את הדגימות ב 9, 000 x גרם במשך 30 שניות. דגירה במשך חמש דקות צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה טרי.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה במשך שלוש דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה טרי.מוסיפים 250 מיקרוליטרים של אלכוהול איזופרופיל ומערבולות במרץ. צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 10 דקות מערבולת. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 500 מיקרוליטרים של 75% אתנול כדי לשטוף את הרנ"א.מערבולת המדגם ואחריו צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. האוויר מייבש את גלולת הרנ"א במשך חמש דקות ומשעה אותה ב-30 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase. חשב את ריכוז הרנ"א באמצעות נוסחה זו וחשב את היחס A260 ל- A280.לאחר מכן, השתמש בזוג פריימרים כדי להגביר את רצף הקידוד החלקי של הגן BX ppm-1 מה-B.xylophilus. לאחר מכן שכפלו את רצפי הגנים ppm-1 לתוך וקטור pGEM-T Easy המכיל את מקדם T7. שחזר את שבר הגן הארוך ppm-1 של זוג הבסיסים 894 על ידי שימוש בפלסמיד המשובט כתבנית עבור pcr.לאחר מכן, השתמש בערכת שעתוק חוץ גופית כדי לסנתז את ה- dsRNA. נתחו את איכות ה-dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר ודמיינו את המוצרים על ג'ל 1%agarose. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של חיץ השרייה פי 5 והרכיבו את הנפח ל-20 מיקרוליטרים עם מים מזוקקים כפולים כדי לקבל ריכוז RNA סופי של 0.8 מיקרוגרם למיליליטר.לאחר מכן מניחים את הנמטודות בצלחת במשך 30 דקות ומחכים שהביצים יידבקו לתחתית. מסירים בזהירות את המים והנמטודות מבלי להפריע לביצים עד שרק הביצים נשארות בצלחת. בקעו את הביצים שנאספו בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זחלי J2.לאסוף את הזחלים בצינור ולשטוף אותם שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, העבר את הזחלים לתוך הצינור המכיל את תמיסת dsRNA. לשם כך, הוסף תמיסת רסורצינול כדי לקבל פתרון של 1%.הניחו את הזחלים על שולחן רועד כדי להבטיח ספיגה מספקת של dsRNA לתוך הזחלים. עבור בקרות, השרו את אותה כמות של נמטודות במאגר ההשריה ללא בדיקת dsRNA או עם בדיקת GFP dsRNA. בצע qPCR תוך שימוש בגנים actB ו- tbb-2 כהפניות פנימיות כדי להעריך את השינויים ברמת ביטוי הגנים.השתמש בשיטת הדלתא דלתא Ct כדי להעריך את רמת ביטוי הגנים היחסית מעקומת הפירוק וערך Ct. לאחר RNAi, תרבו את זחלי J2 עד לבגרותם על מדשאות בוטריטיס סינראה על צלחות PDA. אסוף את המבוגרים בשיטת משפך בארמן כפי שמוצג בחלק הראשון.רכשו תמונות של הנמטודות הבוגרות תחת מיקרוסקופ והשתמשו בתוכנת ImageJ כדי למדוד את אורך הגוף של 50 נמטודות זכריות ו-50 נקבות. נתח את הנתונים על-ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. החל את מבחן t של התלמיד כדי להשוות את האמצעים של הדגימות מהקבוצות השונות.ניתוח ביטוי גנים יחסי לאחר RNAi הצביע על כך ש- ppm-1 dsRNA יכול לעכב ביעילות את הביטוי של הגן ppm-1 של B.Xylophilus. ואילו ל-GFP dsRNA אקסוגני לא הייתה השפעה על ביטוי ppm-1. לאחר RNAi, גודל המבוגרים ירד במידה ניכרת למרות שהגיעו לבגרות מינית וכתוצאה מכך הפנוטיפ המוטנטי בגודל הגוף הקטן.אורך הגוף הממוצע של הנקבות והזכרים המוטנטים היה 544 ו 526 מיקרומטר לעומת 971 ו 912 מיקרומטר עבור קבוצת הביקורת הדבר החשוב ביותר הוא להעביר את הנמטודות לתוך תמיסת RNA גדיל כפול ולהוסיף מגיב נוסף כדי לעורר את הנמטודות להאכיל. שיטה זו מתאימה לסריקת גנים בקנה מידה גדול ומשמשת בדרך כלל בחקר תאים. לחקר תפקוד הגן של B.Xylophilus בשיטה זו יש ערך מנחה להדברה ביולוגית של B.Xylophilus.

application-rna-interference-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף...

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

מוצג פרוטוקול לחקירת התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. מאפיינים התנהגותיים של B. xylophilus מתוארים בתהליך ההזדווגות.

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד, Bursaphelenchus xylophilus

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

הפרוטוקול מתאר את זיהום הנמטודות in vivo ו - in vitro pinewood של Pinus pinaster ואת הניתוח הנדיף שלהם באמצעות כרומטוגרפיית גז (GC) ו- GC המצומדים לספקטרומטריית מסה (GC-MS).

זיהום של In Vivo ו- In Vitro Pines עם נמטודת עץ האורן Bursaphelenchus xylophilus ובידוד של נדיפים מושרים

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

למד שיטת השרייה ל-RNAi בנמטודת אורן Bursaphelenchus xylophilus לחקר תפקודי גנים. השיטה מאפשרת עיכוב ביטוי הגן ppm-1 וזיהוי שינויים פנוטיפיים בגודל הגוף, ומשמשת בסיס לבקרה ביולוגית של נמטודות מחוללות מחלות.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

גלה סרטונים נוספים