ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו הפנימית לחדש סוגי רקמות רבים ושונים, כולל RPE. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי מסלולים מולקולריים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE. רב-תכליתיות היא יתרון עיקרי של מתודולוגיה זו.

בנוסף לחקר התחדשות RPE, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון תהליכים ניווניים של RPE ואת ההשפעות של נזקי RPE על רקמות סמוכות בעין. יונקים, כולל בני אדם, אינם מסוגלים לתקן פציעות RPE גדולות הנובעות מטראומה או ממחלות ניווניות. השימוש בדגי זברה ככלי לגילוי גורמים פרו-רגנרטיביים של RPE הוא צעד משמעותי לקראת קידום התחדשות RPE של יונקים.

כדי להכין תמיסת MTZ טרייה של 10 מילימולאר, חמישה ימים לאחר ההפריה, מוסיפים אבקת MTZ למי המערכת ללא PTU ומערבבים היטב על ידי רעידות נמרצות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. קירור תמיסת MTZ של 10 מילימולר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מסובב שולחן או שייקר. כדי לסנן זחלי דגי זברה מהטרנסגן rpe65a:nsfB-eGFP, הפרדת זחלים חיוביים של eGFP מהונדסים מזחלים חיוביים מ-eGFP לא מהונדסים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם לייזר עירור של 488 ננומטר.

הזחלים המוקרנים מתעוררים מיד על ידי צנרת ישירות לתוך צלחת פטרי עם PTU טרי 1.5X ללא טריקאין. עם סיום ההקרנה, יש להפריד עוד יותר את הזחלים החיוביים של eGFP לשתי קבוצות של צלחות פטרי, קבוצה אחת שתקבל טיפול MTZ וקבוצה אחת שתהיה השליטה הבלתי מעורערת. לאחר מכן יש לנטרל את אפיתל פיגמנט הרשתית על ידי הסרת 1.5X PTU מכלי הטיפול האבלציה ולהוסיף את תמיסת ה-MTZ הטרייה 10 מילימולר.

כמו כן, יש להסיר 1.5X PTU מכלי הבקרה ללא הפרעה ולהוסיף מי מערכת מתוקים ללא PTU. הסר את תמיסת 10 millimolar MTZ לאחר 24 שעות בדיוק והוסף מי מערכת מתוקים ללא PTU. החליפו את מי המערכת המתוקים ללא PTU על הכלים השליליים של MTZ.

מסך eGFP זחלים חיוביים בארבעה ימים לאחר ההפריה. ה-eGFP נראה ארבעה ימים לאחר ההפריה, אך נראה עמום יותר מעוצמת האות ביום החמישי. מניחים זחלים חיוביים של eGFP בצלחות של שש בארות במקום בצלחות פטרי בצפיפות של לא יותר מ-10 זחלים לכל באר לטיפול תרופתי.

ייעדו לוחות נפרדים בעלי שש בארות לזחלים מעוותים ובלתי מרוסנים. קבע את הנפח של 15 מיקרומולר IWR-1 או נפח תואם לנפח בקרת רכב DMSO טיפולים מקדימים הדרושים וחייב 1.5X PTU לצינורות חרוטיים בהתאם. הוסף את מלאי IWR-1 ל-PTU של 1.5X לקבלת ריכוז סופי של 15 מיקרומולר IWR-1.

הוסף נפח תואם של מלאי DMSO ל- 1.5X PTU. מערבבים היטב על ידי מערבולת ומאשרים חזותית את פירוק התרכובות. הסר 1.5X PTU מהזחלים החיוביים של eGFP בלוחות של שש בארות והוסף חמישה מיליליטרים לכל באר של טיפולי DMSO טריים של 0.06% DMSO או 15 מיקרומולר IWR-1.

בטל את ה- RPE למחרת. במשך חמישה ימים לאחר ההפריה, קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה של כלי הרכב הדרושים הן ללוחות ששת הקידוחים והן ללוחות שש הקידוחים והבלתי מרוסנים של שש הקידוחים, ונפחים מתאימים של מי מערכת מתוקים ללא PTU או תמיסת MTZ של 10 מילימולארים לצינורות חרוטיים. הוסף פתרונות מלאי IWR-1 ו- DMSO לצינורות החרוטיים המתאימים כפי שבוצעו בעבר.

מערבבים היטב על ידי מערבולת ומאשרים חזותית את פירוק התרכובות. הסר 0.06% DMSO ו-15 טיפולים מקדימים של IWR-1 מיקרומולרי ב-1.5X PTU מצלחות ייעודיות ללא ספיגה ו-15 קרם של שישה בארות. יש לחדש עם מי המערכת המתוקה המתאימה ללא טיפולי תמיסת PTU ו-MTZ.

הסר 0.06% DMSO ו-15 מיקרומולר IWR-1 טיפולים בתמיסת MTZ של 10 מילימולר לאחר 24 שעות בדיוק ומלא את חידוש הטיפולים במים מתוקים במערכת טרייה ללא PTU. מלאו 0.06% DMSO ו-15 טיפולים במיקרומולר IWR-1 במים מתוקים ללא PTU על צלחת שש הקידוחים הבלתי מעורערת. עקוב אחר ההצלחה וההיקף של אבלציה in vivo באמצעות תאורת אור מועברת במיקרוסקופ סטריאו לצורך תחזוקת זחלים לאחר אבלציה גנטית.

כדי ליצור את אזור העניין של RPE או ROI באמצעות פיג'י, פתח תמונת TIFF של שמונה סיביות, כיוון מחדש את התמונה כך שהצד הגבי יהיה למעלה והדיסטלי יישאר על ידי בחירת תמונה, שינוי צורה והפיכה אופקית. עבור הפקודה האחרונה, בחר את האפשרות המתאימה ביותר לכיווניות הדרושה עבור תמונה זו. התחל את מנהל ההחזר על ההשקעה על ידי בחירת ניתוח, כלים, מנהל החזר על ההשקעה.

השתמש בתמונה, בזום ובמעבר בין ערוצי DAPI ו- Brightfield. השתמש בקיצורי מקשים ליעילות. זהה את הנקודה שבה הצד האפיקלי של ה-RPE צמוד מקצה הממברנה המגבילה החיצונית והשתמש בנקודת ציון אנטומית זו כנקודת ההתחלה של ההחזר על ההשקעה.

צור את החזר ההשקעה של RPE עם כלי בחירת המצולעים בסרגל הכלים של פיג'י באמצעות ערוצי התמונה DAPI ו- Brightfield ופונקציית זום התמונה כדי לזהות גבולות RPE אפיים ובסיסיים. הביאו את הקצוות הגביים והגחוניים של ההחזר על ההשקעה לנקודה חדה במקום להקהות או לעגל. הוסף את ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף במנהל ההחזר על ההשקעה.

שמור את קובץ ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה נוספת ושמור בתוך מנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ פעמיים על ה- rpegen. קובץ m לפתיחה בחלונית העורך.

תחת מקטע המשתנה המוגדר על ידי המשתמש של rpegen. m קובץ, הזן את מיקומי הספריות עבור תיקיות המכילות את קבצי ההחזר על ההשקעה, את קבצי התמונה tiff והיכן יש לשמור קבצי פלט. הזן את שם הקבוצה עבור קובץ ה- mat לייצוא ואת המיקום של ערוץ Brightfield במחסנית התמונות של TIFF.

הפעל את הסקריפט על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB. לאחר שמירת קובץ ה- MAT, תופיע דמות של שלושה פאנלים וגם תישמר כקובץ PDF בספריית הפלט עבור כל הפעלת תמונה. המתן עד שמסמכי PDF אלה של בקרת האיכות יישמרו בתיקיית הפלט והנתון האחרון ייעלם.

פתחו את מסמכי ה-PDF הבודדים וודאו שכל ה-ROIs תואמים לתמונות של ברייטפילד. לחץ פעמיים על rpegen_permplot. m קובץ לפתיחה בכרטיסיית עורך חדשה.

תחת מקטע משתנים המוגדרים על-ידי משתמש אחד, הזן את מיקום הספרייה עבור תיקיית הפלט המכילה את קבצי MAT מהפעלת rpegen. m סקריפט. הזן כל שם קובץ MAT לטעינה.

הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך. בחלק השני, הזן את שמות שתי הקבוצות להשוואה סטטיסטית בנתונים A ובמשתני נתונים B וציין את מספר החזרות של סימולציית התמורות במשתנה החזרות. רק 2, 000 חזרות שימשו עבור הדגמה זו כדי להפחית את זמן העיבוד.

הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך. הפעל איור מפת חום ותוצאות קבוצתיות ומקטעי ערך P באופן עצמאי באמצעות לחצן מקטע ההפעלה. נזק שלם של זחל לאחר ההפריה במשך חמישה ימים הראה ביטוי טרנסגני בהיר ב-RPE בזמן הסינון לאבלציה גנטית.

קריוזציה רוחבית של זחלים ללא הפרעה שנמשכו שישה ימים לאחר ההפריה הראתה שהביטוי הטרנסגני מוגבל לתאי RPE בוגרים, כאשר הביטוי הבהיר ביותר מוגבל ל-2/3 המרכזי של ה-RPE. ראשי חץ מצביעים על מיקרוווילי אפיקלי. קריוזציה רוחבית של זחל בעל אבלציה של יום אחד לאחר הפציעה גילתה שיבוש במורפולוגיה החיובית של תאי eGFP.

חצים מצביעים על גרעינים פיקנוטיים. נזקי הר שלמים של זחלים ללא הפרעה במשך שבעה ימים לאחר ההפריה הראו פיגמנטציה של RPE בכל העין וזחלים עם אבלציה של יומיים לאחר הפציעה הראו אזור אבלציה ללא פיגמנט במרכז RPE. עלילה שנוצרה באמצעות RpEGEN הראתה דמיון בין קבוצות DMSO ו-IWR-1 שנותרו ללא הפרעה במשך תשעה ימים לאחר ההפריה, לכל אורך ה-RPE.

העלילה הראתה את עוצמת הפיקסלים הקלה יותר באופן כללי בקבוצות ה-DMSO וה-IWR-1 של ארבעת הימים שלאחר הפציעה, שנראו קלות ביותר ב-IWR-1 עם אבלציה בהשוואה לכל קבוצת טיפול אחרת. ההבדלים בפיגמנטציה המרכזית של RPE היו משמעותיים כאשר השוו את הזחלים שטופלו ב-IWR-1 לאבלציה של זחלים שטופלו ב-IWR-1 לבין בקרות שטופלו ב-DMSO. באמצעות פרדיגמת אבלציה זו של דג זברה, הצלחנו לזהות מספר מסלולי איתות מולקולריים, כגון איתות רוח שהראינו כאן, שהם מווסתים קריטיים של התחדשות RPE.