Name: בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למדו פרוטוקול SiMPull לכימות זרחון חלבונים ברמת מולקולה בודדת. השיטה משפרת סימון נוגדנים ומצמצמת פלואורסצנית רקע לניתוח מדויק של חלבונים פוספורילטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35GM126934, R01AI153617, ו- R01CA248166 ל- DSL. EMB נתמך באמצעות תוכנית ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) ו- JAR על ידי תוכנית UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). אנו מודים על השימוש במשאב המשותף של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת ניו מקסיקו, הנתמך על ידי NIH P30CA118100. אנו רוצים להודות לד"ר אנקור ג'יין ולטאקיג'יפ הא, שהפיתוח המקורי שלהם של SiMPull היווה השראה לעבודה זו. כתובת נוכחית של ES-C: קבוצת אימונודינמיקה, המעבדה לאימונולוגיה אינטגרטיבית של סרטן, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, בת'סדה

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול שתואר כאן הותאם כדי לאפשר מדידות כמותיות של זרחון הקולטן ברמת החלבון הבודד. פותחו מספר שינויים פשוטים אך חשובים בפרוטוקול SiMPull ששיפרו את אמינות המדידה לזיהוי פוספו-טירוזין, כולל הפחתת האוטו-פלואורסצנציה באמצעות טיפול ב-NaBH4 ופרסום הדגימה כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים. שימוש במסכת התעלה הירוקה כדי לזהות מיקומי קולטנים לחישוב קולוקליזציה עם הנוגדן נגד PY גם משפר את דיוק המדידה על ידי הסרת ממצאים פוטנציאליים מהקשירה הלא ספציפית של הנוגדן לליסאט התא. ההדמיה הדו-צבעית שימשה לזיהוי חלקם של הקולטנים ש...

איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים 1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות לחקור זרחון חלבונים. ניתוח כתמים מערביים מצוין לתיאור מגמות של זרחון חלבונים, אך הוא כמותי למחצה8 ואינו מספק מידע על ההטרוגניות של המערכת מכיוון שאלפי עד מיליוני קולטנים ממוצעים יחד. בעוד שהכתמים המערביים מאפשרים לחקור דגימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו לטירוזינים ספציפיים, הם אינם יכולים לספק מידע על דפוסי זרחון מרובי אתרים בתוך אותו חלבון. פוספופרוטומיקה כמותית מדווחת על שפע פוספוטירוזין, אך ישנן מגבלות לאיתור זרחון מרובה אתרים, שכן שאריות העניין צריכות להיות ממוקמות בתוך אותו פפטיד (בדרך כלל 7-35 חומצות אמינו) שנוצר על ידי עיכול אנזימטי 9,10,11.
כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, בדיקת המשיכה של מולקולה אחת כלפי מטה (SiMPull) הותאמה לכימות מצבי הזרחון של קולטנים שלמים ברמת המולקולה הבודדת. SiMPull הוכח לראשונה ככלי רב עוצמה לחקירת קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי Jain et al.12,13. ב-SiMPull, קומפלקסים מקרומולקולריים עברו מיצוי חיסוני (IP) על כיסויי זכוכית פונקציונליים של נוגדנים ולאחר מכן נותחו באמצעות מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת עבור מספר תת-יחידה של חלבונים ו-CO-IP עם רכיבים מורכבים12. שינוי של Kim et al.14, המכונה SiMBlot, היה הראשון שהשתמש בווריאציה של SiMPull כדי לנתח פוספורילציה של חלבונים שעברו דנטורציה. פרוטוקול SiMBlot מסתמך על לכידת חלבוני פני השטח של התאים שעברו ביוטינילציה באמצעות כיסויים מצופים NeutrAvidin, אשר נבדקים לאחר מכן לזרחון עם תוויות נוגדנים ספציפיות לפוספו14. למרות ההתקדמות הזו, היה צורך בשיפורים כדי להפוך את הכימות של שינויים פוסט-טרנסלציוניים לחזק יותר וישים יותר למגוון רחב יותר של חלבונים.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישת SiMPull אופטימלית ששימשה לכימות דפוסי זרחון של קולטן גורם גדילה אפידרמלי שלם (EGFR) בתגובה למגוון מצבי ליגנד ומוטציות אונקוגניות15. בעוד שעבודה זו מתמקדת ב- EGFR, ניתן ליישם גישה זו על כל קולטן ממברנה וחלבונים ציטוזוליים בעלי עניין (POI), שעבורם קיימים נוגדנים איכותיים. הפרוטוקול כולל שלבים להפחתת הפלואורסצנציה אוטומטית של דגימה, תכנון מערך דגימות הדורש נפח דגימה מינימלי עם הכנה סימולטנית של עד 20 דגימות, ואופטימיזציה של תווי תיוג נוגדנים ותנאי קיבוע. אלגוריתמים לניתוח נתונים פותחו לזיהוי וכימות של מולקולות בודדות של חלבונים זרחניים.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ Tris-HCl pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0 / 50 מ"מ NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 מאגר</td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת תרבית רקמות</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>אחסון זכוכית/מערכים חרוטים פיראנה</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור</td><td></td><td></td><td></td>חרוטי</tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד מימי מדעי</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>תמיסה</td><td>15710</td></tr><tr>צינור <td></td><td></td><td>חרוטי מסוכן 50 מ"ל</td><td>אחסון זכוכית פונקציונלית/ שימוש חוזר KOH</td></tr><tr><td>50 מ"מ Tris-HCl pH 7.2/150 מ"מ רכיב</td><td>חיץ ליזה</td>NaCl <td></td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחת תרבית</td><td>רקמות קורנינג</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% גלוטראלדהיד תמיסה מימית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>אצטון מסוכן (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Dangerous</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS</td><td>Ester Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>ללא בעלי חיים רקומביננטי אנושי</td><td>EGF Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי EGFR (תחום חיצוני) &ndash; ביוטין</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין</td> <td>סרום בקרGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>רכיב החיץ של Tyrode</td></tr><tr><td>משפך בוכנר מבער</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>בונסן</td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק סינון חרוטי</td><td>פישר Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו פישר</td><td></td> כיסויי AMQAX1000 <td></td></tr><tr><td>מדעיים 24 x 60 #1.5</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>חום מושבת</td></tr><tr><td>היתוך 360 תוכנה</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfate</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>מסוכן</td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזכוכית מוט</td><td></td><td></td><td></td>ערבוב</tr><tr><td>זכוכית גלוקוז (D-(+)-גלוקוז)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>רכיב החיץ של טירוד</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספוטאז ופרוטאז (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>רכיב חיץ ליזה</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Tyrodeרכיב חיץ</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן מסוכנים (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>רכיב חיץ ליזה</td></tr><tr><td>ImmEdge מחסום הידרופובי עט</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F שמן טבילה</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr>קו <td></td><td></td><td></td><td>ואקום פנימי</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>מגנסיום כלוריד הקסהידראט (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>ארגז כלים להתאמת עקומה, ארגז כלים למחשוב מקבילי וארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה</td></tr><tr><td>מתנול (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td> מים <td></td></tr><tr><td></td><td>מסוכנים Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכות תיוג נוגדנים לצבע Mix-n-Stain</td><td>CF Biotium</td><td>92245</td><td>ערכת צימוד מוצעת</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Dangerous Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin חלבון מחייב</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>חנקן (גז דחוס)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA GPU עם CUDA</td><td></td><td></td><td>חפש תאימות ב-https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Olympus iX71 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפילם M סרט איטום</td><td>מחסן המעבדה</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 אנלוגי פלטה חמה</td><td>קורנינג</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>קולטן פוספו-EGF (Tyr1068) (1H12)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> mAb של עכבר <td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Millipore Sigma</td><td></td><td>529552 רכיב החיץ של Tyrode</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td> נימה PLA <td>פרימיום מסוכנת</td></tr><tr><td>, קוטר 1.75 מ"מ</td><td>להעלות PMS תלת מימדי</td><td>: 2035U / RAL: 3028</td><td>טווח טמפרטורות הדפסה: 205-235 & deg; מדפסת תלת</td></tr><tr><td>מימד C Pro2</td><td>להעלות תלת מימד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיירקס 1 ליטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 מ"ל בקבוקי אחסון</td><td>קורנינג</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O לשימוש חוזר</td></tr><tr><td>פיירקס 250 מ"ל כוסות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיירקס 4 ליטר תמונה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם ארבע תצוגות </td><td>פוטומטריה</td><td>מפצל דגם QV2</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount מוני תאים, שקופיות ספירת תאים EVE</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>מסנני פליטה של Semrock: כחול (445/45 ננומטר), ירוק (525/45 ננומטר), אדום (600/37 ננומטר), אדום רחוק (685/40 ננומטר)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>בקר פיפטה סרולוגי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות</td><td></td><td></td><td></td>סרולוגיות</tr><tr><td>מריחות חבילת</td><td></td><td></td> ניתוח מולקולה בודדת <td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד מסוכן (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s רכיב חיץ</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>מופעל על ידי מחזור חום ו-pH עוקב</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית מסוכנת (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>מסוכן</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>חרוזים רב-פלואורסצנטיים</td></tr><tr><td>בסיס Tris (Trizma) בסיס</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

פוספורילציה היא שינוי פוסט-טרנסלציוני הכרחי המווסת את תפקוד החלבון ומכוון את תוצאות האיתות של התאים. השיטות הנוכחיות למדידת פוספורילציה של חלבונים אינן יכולות לשמר את ההטרוגניות בזרחון על פני חלבונים בודדים. הבדיקה של משיכה חד-מולקולה (SiMPull) פותחה כדי לחקור את ההרכב של קומפלקסים מקרומולקולריים באמצעות מיצוי חיסוני של חלבונים על מכסה זכוכית ולאחר מכן הדמיה של מולקולה אחת. הטכניקה הנוכחית היא התאמה של SiMPull המספקת כימות חזק של מצב הזרחון של קולטני ממברנה באורך מלא ברמת המולקולה הבודדת. הדמיה של אלפי קולטנים בודדים בדרך זו מאפשרת לכמת את דפוסי הזרחון של חלבונים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך SiMPull הממוטב, מהכנת דגימה ועד הדמיה. אופטימיזציה של הכנת זכוכית ופרוטוקולי קיבוע נוגדנים משפרת עוד יותר את איכות הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מספק קוד לניתוח נתונים של מולקולה בודדת המחשב את חלקם של הקולטנים הזרחניים בתוך דגימה. בעוד שעבודה זו מתמקדת בזרחון של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR), ניתן להכליל את הפרוטוקול לקולטני ממברנה אחרים ולמולקולות איתות ציטוזוליות.

קריקטורה המתארת את תהליך SiMPull מוצגת באיור 1A. הכיסויים מתפקדים תוך שימוש ב-NeutrAvidin כעוגן לנוגדנים נגד EGFR שעברו ביוטינילציה כדי ללכוד EGFR-GFP מתוך סך כל החלבון ליזאטים. לאחר שטיפת חלבון לא מאוגד, הקולטנים הזרחניים מסומנים בנוגדן אנטי-פוספוטירוזין (אנטי-PY)15. איור 1B מציג תמונה של המערך ההידרופובי, שבו ניתן להכין דגימות מרובות ולדמות אותן על אותו כיסוי. אחד היתרונות של מחזיק מדגם זה הוא שנדרשים נפחי דגימה מינימליים של ~ 10 μL. ני...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

פרוטוקול SiMPull זה מאפשר כימות של זרחון חלבונים על ידי שיפור התוויית הנוגדנים ותנאי הקיבוע, הפחתת האוטו-פלואורסצנציה המצויה בתעלה הירוקה ומתן אלגוריתמים חזקים לניתוח מולקולות בודדות. היתרון העיקרי של SiMPull הוא שהוא מאפשר לנו לחקור את מצב הזרחון של חלבונים שלמים בודדים. בעזרת שיטה זו, אנו יכולים להשיג מידע חדשני שאינו נגיש באמצעות טכניקות מסורתיות, כגון כתם מערבי וניתוח מפרט מסה.יש לנו צוות חוקרים שעוזר להדגים את הפרוטוקול. ראשית, ג'וליאן רוג'ו יראה כיצד לחרוט פיראנה את הכיסוי. לאחר מכן, רייצ'ל גרטן תציג את השלבים לציפוי זכוכית הכיסוי.ואליזבת ביילי תראה כיצד לצייר את דוגמאות המערך והתמונה. כדי להתחיל, פיראנה חורטת את הכיסוי מחליק על ידי תסיסה עדינה של התגובה כל חמש דקות במשך 30 דקות. נטרל את פתרון הפיראנה על ידי הוספת בסיס חלש בהדרגה.בעזרת מוט זכוכית, מעבירים את הכיסוי החרוט לתוך משפך בוכנר ושוטפים במשך חמש דקות במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן מניחים את הכיסוי מחליק בצנצנת קופלין מזכוכית ומכסים במתנול. אטמו את המכסה עם סרט איטום והתרחצו במשך 10 דקות.לאחר ההסתלקות, רוקנו את המתנול לתוך בקבוק אחסון זכוכית. חזור על שלב זה עם אצטון. יש לשטוף את הכיסוי שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים בצנצנת קופלין.מסננים את המים ממחליקי הכיסוי ומייבשים אותם על ידי נפנוף דרך הלהבה של מבער בונזן. מניחים את החלקות הכיסוי בצנצנת קופלין יבשה. לאחר מכן הוסיפו תמיסת אמינו סילאן לצנצנת קופלין כדי לבצע סילאניזציה של אמינו החלקה.מכסים ומורחים סרט איטום כדי להגן מפני אור. שוטפים את החלקות הכיסוי במתנול ומשליכים את התמיסה המשומשת. שוב, שטפו את הכיסוי מחליק שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות כל אחת.יש לטשטש את עודפי הלחות ולייבש את האוויר לחלוטין למשך 10 דקות. לאחר מכן, לצייר מערך רשת עם עט מחסום הידרופובי. סמן מזהה על לוח הכיסוי כדי לזהות את הכיוון הנכון.לאחר שהדיו מתייבש, מניחים את הכיסוי מחליק בתא לח. 153 מיליגרם של mPEG ו-3.9 מיליגרם של ביוטין-PEG ב-609 מיקרוליטרים של 10 מילימולאר נתרן ביקרבונט ומערבולת. צנטריפוגה ב 10, 000 x g מדקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות.החל 10 עד 15 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל ריבוע כדי לכסות לחלוטין את המערך מבלי לעלות על גדותיו. אחסנו את הכיסוי מחליק לתוך תא הלחות בחושך למשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את החלקות הכיסוי על ידי טבילתם במשך 10 שניות ברצף לתוך שלושה כוסות מלאות במים מזוקקים כפולים.הסר את כל הלחות מהחלקות הכיסוי באמצעות גז חנקן. אחסנו את הכיסויים גב אל גב בצינור חרוטי 50 מיליליטר מלא בחנקן ואטמו עם סרט איטום. עוטפים את הצינור בסרט איטום ומניחים אותו על מינוס 20 מעלות צלזיוס.הסר את המערכים הפונקציונליים של ביוטין-PEG מהמקפיא ושווי משקל אותם לטמפרטורת החדר. מניחים את החלקת הכיסוי כאשר המערך פונה כלפי מעלה לצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטרים מרופדת בסרט איטום. דגירה של כל ריבוע של המערך עם 10 מיליגרם למיליליטר של נתרן בורוהידריד ב- PBS במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הדגירה הבאה עם 0.2 מיליגרם למיליליטר של NeutrAvidin ב- T50 במשך חמש דקות, ואחריה שטיפה שלוש פעמים עם T50 BSA. חזור על הדגירה עם שני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן ספציפי ל- POI ביוטינילי ב- T50 BSA במשך 10 דקות ולאחר מכן שטיפה.ראשית, הפשרה מערבבת את הליזאט על ידי צנרת. דיללו מיקרוליטר אחד של הליזאט ל-100 מיקרוליטרים של T50 BSA PPI קר כקרח. דגירה של הליזאט על המערך למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה.הכן את הנוגדן האנטי-פוספוטירוזין המצומד AF647 בקור קרח T50 BSA PPI ודגירה על המערך למשך שעה אחת. להפקיד טיפת שמן על המטרה. הניחו את הננו-גריד על הבמה להדמיה.באמצעות אור לבן המועבר, התמקדו בתבנית הרשת. רכשו סדרה של 20 תמונות של הרשת, ודאו שהפיקסלים אינם רוויים ושמרו את סדרת התמונות כ-fiducial. נטרלו את הננו-גריד כדי ליצור תבנית אוורירית, רכשו סדרה של 20 תמונות לכיול רווח ושמרו את התמונה כרווח.לאחר מכן השג סדרה של 20 תמונות להסטת המצלמה על ידי חסימת כל האור למצלמה ושמיר את רקע התמונות. כדי להשיג תמונות פשוטות, ראשית, לנקות את מטרת השמן ולהפקיד שמן נוסף על המטרה. אבטחו את מערך החלקת הכיסוי על במת המיקרוסקופ.קבל תמונות עבור כל דגימה, תחילה בערוץ האדום הרחוק, ואחריו פלואורופורים באורך גל נמוך יותר. בדקו את רמת המאגר כל 30 עד 45 דקות ומלאו את המלא לפי הצורך. באמצעות טכניקה זו, EGFR-GFP נלכד מתוך סך כל החלבון lysates.הפלואורסצנציה האוטומטית של הדיו ההידרופובי שימשה כמדריך למציאת מישור המוקד של הדגימה. תמונות נתונים גולמיות נרכשו עם ערוצים ספקטרליים המופרדים על שבב המצלמה. שכבת-על של הערוצים הירוקים והאדומים-רחוקים נבחנה עוד יותר לצורך רכישת נתונים.רישום הערוץ בוצע על תמונות שנרכשו מהננו-גריד. שכבה של תמונות פידוקיאליות הראתה רישום לא שלם. היישור נעשה על ידי החלת טרנספורמציה ממוצעת משוקללת מקומית על קואורדינטות הערוצים האדומות והירוקות הרחוקות, ששימשו לרישום נתוני SiMPull הבאים.פולטים בודדים מעל ספירת הפוטונים ברקע מערוצי ה-GFP וה-AF647 הוכנסו לאגרוף, ולוקליזציה של גאוס בוצעה כדי לזהות את המיקומים. קולוקליזציה של EGFR-GFP ב-F647 נעשתה כדי לזהות קולטנים זרחניים. ואחוז הקולוקליזציה שימש כדי לקבוע את החלק של קולטנים זרחניים.גילויי הרקע הופחתו כאשר זכוכית חרוטת פיראנה טופלה בנתרן בורוהידריד. קשירה חזקה של EGFR-GFP בליזאט נצפתה עם קשירה מינימלית לא ספציפית של PY99-AF647, מה שמראה שמירה על תפקוד פני השטח באמצעות טכניקה זו. SiMPull מספק מידע על זרחון חלבונים ויכול לענות על מגוון רחב של שאלות איתות עצמי.זה יכול לשפר את ההבנה שלנו של איתות במצבים נורמליים ומחלות כאחד.

an-optimized-single-molecule-pull-down-assay-for-quantification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

סרטון זה מדגים טכניקת כימות רגישה של זרחן חלבונים באמצעות בדיקה של מולקולה אחת הנפתחת כלפי מטה. הפונקציונליות של פוליאתילן גליקול-ביוטין והשימוש בנוגדנים מסומנים מגבירה את הזיהוי של טירוזין פוספורילציה עם ספציפיות.

בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

אנו מדווחים ומדגימים בדיקת קשירת ניטרוצלולוז אופטימלית שניתן להשתמש בה כדי לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. לשיטה שלנו מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות מבוססות SDS-PAGE, המספקות אלטרנטיבה חשובה לאפיון חלבונים חשובים אלה.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

למדו פרוטוקול SiMPull לכימות זרחון חלבונים ברמת מולקולה בודדת. השיטה משפרת סימון נוגדנים ומצמצמת פלואורסצנית רקע לניתוח מדויק של חלבונים פוספורילטים.

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

גלה סרטונים נוספים