מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

אנו משלבים מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר עם פרוטוקול חיפוש RNA של תא יחיד הנקרא CEL-Seq2 כדי ליצור ערכות נתונים תעתיקיות עבור דגימות רקמה בודדות קטנות. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור ביטוי גנים ברקמות או במינים שלא ניתן לחקור באמצעות שיטות מיון תאים מסורתיות. בנוסף, הוא מספק ספציפיות רבה יותר מאשר גישת RNA-seq בתפזורת.

כאן הדגמנו טכניקה זו עבור ארבעת קצות הזנב התאיים של C.elegans זכרי שלב הזחל הרביעי והרמפרודיטים. אבל היופי בגישה זו הוא שניתן ליישם אותה אפילו על מינים שאינם מודלים. מי שידגימו את ההליך יהיו גב' רעיה ג'לאד, דוקטורנטית מהמעבדה שלי וד"ר אנטוניו הררה, כיום מדען ביו-רפואי מוביל בבית הספר ביילור בצ'טנוגה, טנסי.

התחילו על ידי צנרת עדינה של מיליליטר אחד או שניים של חיץ M9 על דופן הצלחת מבלי להשפריץ. סובבו את הצלחת כדי לעקור את התולעים. מוציאים ומשליכים את כל הנוזלים והתולעים על ידי הנחת קצה הפיפטה על דופן הצלחת בקצה האגר כדי להימנע מנקב חורים.

סרטון זה מציג את הצלחת לפני הסרת האמהות והזחלים. יש להשאיר רק עוברים לאחר הסרת האמהות והזחלים. זחל L1 יתחיל להופיע לאחר הדגירה במשך כשעה.

לאחר מכן הניחו את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, הסר את הצלחת מהאינקובטור. יש לזרוק בזהירות מיליליטר אחד של חיץ M9 על האגר ולסובב את הצלחת כדי לעקור את ה-L1s אך לא את העוברים.

צנטריפוגה של הצינור ופיפט את ה-L1 ישירות על מדשאת החיידקים של צלחת שנזרעה. שמור על התולעים ב 25 מעלות צלזיוס. תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של 30 עד 50 X, התחילו לקטוף את הזכרים ואת ההרמפרודיטים מלוחות הסנכרון ללוחות נפרדים שלא נזרקו.

הזכרים נבדלים מהרמפרודיטים על ידי הצורה הבולטת והצבע הבהיר יותר של זנבות הזכרים בהשוואה לצורה המחודדת ולצבע הכהה יותר של זנבות ההרמפרודיטים. שטפו את התולעים מהצלחת עם מיליליטר אחד עד שניים של מאגר M9 באמצעות קצה פיפטה שנשטף מראש עם חיץ M9 המכיל 0.01% חומר ניקוי. מעבירים את התולעים לצינור צנטריפוגה של מיליליטר אחד, מסתובבים במשך דקה אחת ומוסיפים מיליליטר אחד של חיץ M9.

שוב, סובבו לרגע אחד. מוסיפים מיליליטר אחד של קר כקרח 70% מתנול ומערבבים היטב. חוזרים על הכביסה עם מתנול מיליליטר אחד, מערבבים היטב.

סובבו אותו במשך דקה אחת והוסיפו 500 מיקרוליטרים של 70% מתנול. מערבבים אותו ומאחסנים אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד לילה. פיפטה 20 מיקרוליטרים של התולעים הקבועות על הצד המצופה של פוליאתילן נפטלט או מגלשת זכוכית PEN-membrane.

חכו שהמתנול יתאדה. הסר את מגן הפלסטיק מעל הבמה ולחץ על כפתור הפריקה עם החץ כלפי מעלה לטעינת שקופיות הממברנה. ודא שהמגלשה יבשה לחלוטין, הפוך כך שהממברנה פונה כלפי מטה והכנס את המגלשה.

לחץ על המשך בחלון דגימת השינוי. מחזיק השקופיות יזוז. לאחר מכן החלף את מגן הפלסטיק, בתחתית המסך, בחר איזה מחזיק שקופיות מכיל את השקופית ולחץ על כפתור הפריקה עם החץ כלפי מטה כדי לטעון את הצינורות.

משוך את המגש החוצה ומסיר את בלוק הצינור. הכנס את מכסי הצינורות של ארבעה צינורות PCR 500 מיקרוליטר לתוך המחזיק ומקפל את הצינור מתחת. החזירו את הבלוק למגש והחליקו את המגש בחזרה לשלב המיקרוסקופ.

בחלון הקופץ של התקן איסוף השינויים, בחר צינורות PCR ולחץ על אישור. לחץ על מיקום הצינור הריק בפינה השמאלית התחתונה של המסך מתחת למכסי שפופרת של התקן אספן ובלוח הבקרה של המיקרוסקופ בחר TLBF לתאורת שדה בהיר אור מועברת. באמצעות עדשת 2.5X, התאם את המיקוד עד שהתולעים ומבנה פני השטח של ממברנת PEN ייראו לעין.

עברו לעדשת 20X והזיזו את הבמה לאזור ללא תולעים. התאם את המיקוד כך שלמבנים דמויי הבועה בממברנה יהיה צבע צהבהב כדי למקד את הלייזר במישור המוקד הנכון ואז להגדיר את הפרמטרים של הלייזר. עבור קצות הזנב, התחל עם כוח 45 צמצם 30 במהירות 20.

בלוח הבקרה של הלייזר, בחר כיול ופעל לפי ההוראות. לאחר מכן, בחלק התחתון של המסך בפקקי שפופרת של מכשיר אספן לוחצים על מיקום A, בצד ימין של המסך בחר צורה אחת, ואחריה ציור וחיתוך. לאחר מכן בחר מנקודה לנקודה וצייר קו.

לחץ על התחל לחתוך כך שהלייזר חותך דרך הממברנה. מצא תולעת והעבור לזוז ולחתוך. השתמש בעכבר כדי לחתוך את הזנב.

כדי לאסוף את הדגימה, עבור להגדרת הציור והחתך עם פונקציית הנקודה לנקודה וצייר צורה כדי להשלים את החיתוך של קטע ממברנה. בחר את הצינור הבא בפקק צינור התקן האספן בתחתית המסך וחתוך את קצה הזנב הבא. לאחר חיתוך ארבעה זנבות, פרקו את מתלה הצינורות על ידי לחיצה על פריקה עם החץ כלפי מטה.

מצא את מקטעי הממברנה תחת מיקרוסקופ ניתוח והמשך בעיבוד הדגימה במורד הזרם. כאן ריצוף RNA עם CEL-Seq2. מיקרוליטרים של פיפטה 1.2 של מאסטר פריימר CEL-Seq2 מתערבבים ישירות על גבי הדגימה וסוגרים את הצינור.

סמן את מספר הפריימר והניח מיד את מכסה הצינור ישירות על פיסת קרח יבשה כדי להקפיא את הדגימה בהבזק ובכך למנוע פירוק RNA. יש לחזור על הפעולה עד לאיסוף כל הדגימות. לבסוף אחסנו את הצינורות במינוס 70 מעלות צלזיוס.

C.elegans L3 הרמפרודיטים וזכרים ב 21 עד 23 שעות לאחר הבקיעה ניתן להבחין תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי המורפולוגיה של זנבותיהם. סיפור ההרמפרודיט צר ואילו זה של הזכרים נפוח ונראה ברור. המראה של מבנה השקופית של PEN-membrane וזנב התולעת מוצג בתמונות אלה.

כאן המיקוד נכון לעדשות 20X ו-40X במיקרוסקופ. הזנב המנותח שנחתך ללא משוא פנים מתוך קרום PEN נראה כאן. לאחר סגירת הפער בחתך, חתיכת הממברנה תצנח לתוך מכסה הצינור שמתחת למגלשה.

מכסה צינור עם מקטע PEN-membrane המכיל קצה זנב מנותח מוצג כאן. התמונה הגרפית מייצגת את המזהה המולקולרי הייחודי שהומר ביומן הטבעי או את ספירות ה-UMI לכל קצה זנב בודד עבור נקודות זמן ומינים שונים. תוכנת powsimR משמשת כדי לקבוע כמה דגימות עצמאיות נדרשות כדי לזהות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי או DE ברמות ביטוי שונות.

התמונה הגרפית כאן מייצגת את הקצב החיובי האמיתי לזיהוי הגנים של DE בין שני תנאים עבור ארבע סימולציות שונות המשלבות גדלי דגימה שונים לכל תנאי. הקו המקווקו מציין שיעור חיובי אמיתי של 80%. שיעור הגילוי הכוזב ואותן ארבע סימולציות מוצגים כאן.

הקו המקווקו מציין שיעור גילוי כוזב של 10%. הגרפים הראו כי גודל מדגם של 70 קצות זנב לכל מצב מספיק לאיתור הגנים של DE למעט הגנים עם רמות ביטוי נמוכות מאוד. לסנכרון נכון, יש לוודא כי רק עוברים נמצאים על הצלחת.

כדי להבטיח מפני אובדן דגימה, פיפטו את תערובת הפריימר ישירות למקטע PEN-membrane בפקק והיו עדינים במיוחד בסגירת המכסה. מכיוון שמדובר במינים אגנוסטיים, אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור כיצד התפתחו רשתות ויסות גנים עבור מבנים הומולוגיים במינים שונים.