Name: ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למדו שיטה לביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות מתאי ריאה ראשוניים והתמיינותם ליצירת דגם תלת-ממדי של אפיתל דרכי הנשימה. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגיה נשימתית ומחלות כגון COVID-19.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרכז למדעי PanorOmic וליחידת מיקרוסקופ אלקטרונים, הפקולטה לרפואה ע"ש לי קה שינג, אוניברסיטת הונג קונג, על הסיוע בהדמיה קונפוקלית ובציטומטריית זרימה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מקרן המחקר לבריאות ורפואה (HMRF, 17161272 ו-19180392) של לשכת המזון והבריאות; קרן המחקר הכללית (GRF, 17105420) של המועצה למענקי מחקר; Health@InnoHK, ועדת החדשנות והטכנולוגיה, ממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג.

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת הונג קונג / רשות בתי החולים של הונג קונג אשכול מערב הונג קונג (UW13-364 ו- UW21-695). הסכמה מדעת התקבלה מחולים לפני איסוף הרקמות.
1. גזירת אורגנואיד ריאה אנושית
<ol><li>הכנת חומרים ניסיוניים<ol>
<li>הכן מדיום בסיסי על ידי תוספת למדיום DMEM/F12 מתקדם עם 2 mM גלוטמין, 10 mM HEPES, 100 U /mL של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין.</li>
		<li>הכן את מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה האנושית על ידי השלמת מדיום בסיסי עם 10% R-spondin 1 בינוני מותנה, 10% בינוני מותנה נוג'ין, תוסף B27 1x, 1.25 mM N-אצטילציסטאין, 10 mM ניקוטינמיד, 5 מיקרומטר של Y-27632, 500 ננומטר של A-83-01, 1 μM של SB202190, 5 ng/mL של גורם גדילה פיברובליסטי (FGF)-7, 20 ננוגרם/מ"ל של FGF-10, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של פרימוצין (ראו טבלת חומרים). הערה: ניתן להחליף את המדיום המותנה R-spondin 1 ו-Noggin ב-R-spondin 1 (500 ng/mL) ונוג'ין (100 ng/mL) מסחריים מסוג R-spondin 1 (500 ng/mL) ו-Noggin (100 ng/mL).</li>
		<li>יש לחמם מראש צלחת תרבית של 24 בארות בחממת תרביות תאים. השתמש בחממת תרביות תאים סטנדרטית עם 5% CO2 ואטמוספרה לחה בטמפרטורה של 37 °C (76 °F). להפשיר מטריצת מרתף במקרר של 4 מעלות צלזיוס. שמור את מטריצת המרתף ואת מדיום התרבות על הקרח במהלך הניסויים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד תאים מרקמות ריאה אנושיות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית<ol>
<li>רכשו רקמות ריאה אנושיות שזה עתה נכרתו בגודל של כ-0.5 ס"מ מחולים שעברו כריתה כירורגית עקב מחלות שונות. להעביר את רקמות הריאה ב-30 מ"ל של מדיום בסיסי בטמפרטורת החדר ולעבד במהירות האפשרית בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית.</li>
		<li>רקמות ריאה טחונות לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ) עם אזמל סטרילי בצלחת תרבית תאים של 10 ס"מ. לשטוף חתיכות טישו עם 10 מ"ל של בינוני בסיסי קר בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (66 °F).</li>
		<li>יש להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור ל-8 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת קולגן בריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. לעכל את חתיכות הרקמה על ידי ניעור הצינור ב 120 סל"ד במשך 30-40 דקות ב 37 °C (64 °F).</li>
		<li>פיפט למעלה ולמטה במשך 20x כדי לגזוז את חתיכות הרקמות המעוכלות באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. יש לערום מסננת של 100 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ולסנן את המתלים.</li>
		<li>משחזרים פיסות רקמה על המסננת עם המדיום הבסיסי ומעבירים אותן לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ולאחר מכן לסיבוב שני של גזירה וסינון. ניתן לבצע סינון גזירה נוסף פי 1x-2 כדי לבודד תאים נוספים, במיוחד כאשר נרכשת פיסת רקמה קטנה (למשל, <0.5 ס"מ).</li>
		<li>הוסף FBS לזרימה-דרך עם ריכוז סופי של 2% כדי לסיים את העיכול, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (66 °F).</li>
		<li>בצעו החייאה של כדור התא ב-10 מ"ל של תווך בסיסי, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט.</li>
		<li>(אופציונלי) אם אריתרוציטים רבים נראים בכדור (מוערך על ידי צבע הכדור), החייאת כדור התא ב 2 מ"ל של חיץ תסיסה של תאי דם אדומים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של תווך בסיסי לצינור, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט.</li>
		<li>בצעו החייאה של הכדור במטריצת מרתף קרה והמשיכו על הקרח. הוסף 80-160 μL של מטריצת מרתף עבור תאים שהתאוששו מרקמת ריאה בגודל של כ -0.5 ס"מ; הכמות מספיקה כדי לזרוע 2-4 טיפות.</li>
		<li>מחלקים 40 μL של מתלים לכל באר של לוחית תרחיף המתלים המחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תן למטריצת המרתף להתמצק וליצור טיפה.</li>
		<li>מוסיפים 500 μL של אורגנואידים של אורגנואידים של ריאה אנושית למדיום הרחבה בתוספת 5 ננומטר של הרגלולין בטא-1 לכל באר ומדגרים את הצלחת בחממת תרביות תאים.</li>
		<li>רענן את המדיום כל 3 ימים. הסר את המדיום הישן תוך שמירה על שלמות הטיפות והוסף מדיום רענן בזהירות. מעבירים את האורגנואידים לאחר הדגירה במשך 10-14 יום. השתמש ב- Heregulin beta-1 רק בתרבות הראשונית לפני הקטע הראשון.</li>
		<li>התבונן באורגנואידים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהאורגנואידים אינם משובצים בצפיפות תאים גבוהה מאוד. אם טיפה מתפוררת עקב צפיפות תאים גבוהה מדי, שחזרו והטמיעו מחדש את האורגנואידים והתאים עם נפח גבוה יותר של מטריצת מרתף כדי ליצור יותר טיפות עם צפיפות תאים נמוכה ורצויה יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הרחבת האורגנואידים של הריאה האנושית
<ol><li>הכינו פיפטת פסטר על ידי שריפת קצה פיפטת פסטר על להבה, כגון מבער בונזן, כדי לצמצם את הפתח מ-1.5 מ"מ לכ-1.0 מ"מ קוטר. מקררים את הפיפטות, ואחריהם את האוטוקלבינג כדי לעקר. הרטיבו את הפיפטות עם המדיום הבסיסי כדי למנוע חיבור ואובדן של תאים במהלך גזירה מכנית.</li>
	<li>אורגנואידים של ריאות עוברים עם גזירה מכנית<ol>
<li>השתמש בקצה של 1 מ"ל ובצינור למעלה ולמטה כדי לשבור את הטיפות שהתקבלו לעיל. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים יחד עם המדיום לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והתאימו את הנפח ל-10 מ"ל עם תווך בסיסי קר. השליכו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>לשטוף את האורגנואידים עם 10 מ"ל של בינוני בסיסי קר שוב. החייאת האורגנואידים ב -2 מ"ל של תווך בסיסי קר. פיפט למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לחתיכות קטנות עם פיפטת פסטר.</li>
		<li>תוספת עם בינוני בסיסי לנפח כולל של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. החיזרו את שברי האורגנואידים עם מטריצת מרתף קרה מספיקה כדי לאפשר הרחבה של 1:3 עד 1:5. תמשיכו לקרח.</li>
		<li>הניחו 40 μL של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת מחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תנו למטריצת המרתף להתמצק.</li>
		<li>מוסיפים 500 μL של מדיום התפשטות אורגנואידי ריאה לכל באר ומדגרים בחממת תרביות תאים. רענן את המדיום כל 3 ימים. מעבירים את האורגנואידים כל שבועיים ביחס של 1:3 ל-1:5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אורגנואידים של ריאה עוברים עם טריפסיניזציה הערה: טריפסיניזציה עדיפה כאשר קשה לגזוז את האורגנואיד של הריאה לחתיכות קטנות באמצעות פיפטת פסטר, או שגודל האורגנואידים משתנה מאוד, או שהניסויים הבאים דורשים אורגנואידים בגודל אחיד יותר.<ol>
<li>קציר את האורגנואידים של הריאה כפי שמוצג בשלב 2.2.1. החייאת האורגנואיד ב-1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה ודגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור. גזירה את האורגנואידים באופן מכני על ידי צנרת האורגנואידים למעלה ולמטה לחתיכות קטנות באמצעות פיפטת פסטר. בדוק את גודלם של חתיכות אורגנואידיות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4. לאחר מכן, הוסף 40 μL של FBS כדי לסיים את העיכול. הערה: קבע את גודל השברים האורגנואידים מתחת למיקרוסקופ בהתאם לסידור הניסוי. אם ניסוי זקוק ליותר אורגנואידים או אורגנואידים בגודל אחיד יותר, גוזזים אורגנואידים לחתיכות קטנות יותר או אפילו לתאים בודדים. לאחר מכן, לוקח זמן רב יותר, כנראה 3 שבועות, עד שהאורגנואידים מוכנים לניסויים.</li>
		<li>מלא עם בינוני בסיסי לנפח סופי של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (74 °F). החייאת החלקים האורגנואידיים במטריצת מרתף קרה עם נפח מספיק כדי לעבור ביחס של 1:5-1:10. תמשיכו לקרח.</li>
		<li>הניחו 40 μL של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת מחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תנו למטריצת המרתף להתמצק.</li>
		<li>יש להשלים עם 500 μL של מדיום התפשטות אורגנואידים של ריאה לכל באר ודגירה בחממת תרביות תאים. רענן את מדיום ההרחבה כל 3 ימים. מעבירים את האורגנואידים לאחר 2-3 שבועות. הערה: כ-100 אורגנואידים מותקנים בתוך טיפה של 40 μL של מטריצת מרתף. האורגנואידים של הריאות גדלים בדרך כלל טוב יותר עם צפיפות תאים גבוהה יחסית. הטבעה מחדש של האורגנואידים עם צפיפות תאים נמוכה יותר אם הטיפות מתפרקות או שהאורגנואידים הגדלים מתחברים זה לזה בשל צפיפות התאים הגבוהה מדי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה
<ol><li>הכן מדיום התמיינות פרוקסימלית (מדיום PD) על ידי השלמת הממשק הנוזלי באוויר עם תוסף ממשק נוזלי אוויר 1x, תוסף תחזוקת ממשק נוזלי אוויר 1x, 4 מיקרוגרם/מ"ל של הפרין, 1 μM של הידרוקורטיזון, 10 μM של Y-27632, ו-10 μM של DAPT (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>אורגנואידים תלת-ממדיים של דרכי הנשימה<ol>
<li>הדגירה של אורגנואידים של הריאות במדיום ההתפשטות למשך 7-10 ימים לאחר המעבר באמצעות גזירה מכנית. החלף את מדיום ההרחבה במדיום PD. דגירה של האורגנואידים במדיום PD במשך 14 יום בחממת תרביות תאים.</li>
		<li>יש להשליך את מדיום ה-PD בכל באר. הוסיפו חיץ ליזאט תאי כדי לקצור את האורגנואיד המובחן של דרכי הנשימה לצורך מיצוי RNA וזיהוי ביטוי גנים תאיים על ידי בדיקת RT-qPCR.</li>
		<li>לחלופין, הדגירה של האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לאחר הוספת 10 mM EDTA כדי לנתק את האורגנואידים לתאים בודדים, ולאחר מכן ניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לבחון את אוכלוסיות התאים. האורגנואידים מוכנים למניפולציות ניסיוניות שונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אורגנואיד דו-ממדי של דרכי הנשימה<ol>
<li>הכינו מספיק אורגנואידים של ריאה תלת-ממדית לתרבית התמיינות דו-ממדית. בסך הכל נדרשים 1.3 x 105 ו- 4.5 x 105 תאים עבור תוספת תמיכה חדירה של 24 בארות ותוספת תמיכה חדירה של 12 בארות, בהתאמה.</li>
		<li>לאחר שהאורגנואידים של הריאה התלת-ממדית גדלים במדיום ההתפשטות במשך שבועיים, מעכלים את האורגנואידים לתאים בודדים וזורעים לתוך ה-24-בארות וה-12-בארות כדי ליצור אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה.</li>
		<li>קדם הדגירה של התוספות עם המדיום הבסיסי למשך הלילה בחממת תרביות תאים. הוסף 250 μL ו- 500 μL של תווך בסיסי בתא העליון והתחתון של לוח 24 בארות, בהתאמה. עבור צלחת של 12 בארות, הוסף 500 μL ו- 1,000 μL של תווך בסיסי בתא העליון והתחתון, בהתאמה.</li>
		<li>קציר אורגנואידים של ריאה תלת-ממדית כמתואר בשלב 2.2.1. החייאת האורגנואידים עם 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה ודגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור. פיפט למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לתאים בודדים עם צינור פסטר ולבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסף 40 μL של FBS כדי לסיים את העיכול.</li>
		<li>סנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. העבר את תרחיף התא המסונן לצינור של 15 מ"ל. השלם עם בינוני בסיסי לנפח כולל של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
		<li>החייאת הכדור, שנאסף מ-24 טיפות (40 μL), ב-1-2.5 מ"ל של מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה, בהתאם לצפיפות התאים בטיפות. ספרו את מספר התאים עם מונה תאים מתחת למיקרוסקופ. התאם את ריכוז התא ל- 1.3 x 106/מ"ל (עבור תוספות של 24 בארות) או 9 x 105/מ"ל (עבור תוספות של 12 בארות).</li>
		<li>הסר את המדיום הבסיסי מהתאים העליונים והתחתונים. הוסף 500 μL ו- 1,000 μL של מדיום הרחבה בתא התחתון של התוספת של 24 בארות ותוספת 12 בארות, בהתאמה. זרעים 100 μL ו-500 μL של תרחיף התא שהוכנו בשלב 3.3.7 על התא האפיקלי של התוספת של 24 בארות וההוספה של 12 בארות, בהתאמה.</li>
		<li>דגירה בחממת תרביות תאים למשך יומיים. החלף את מדיום ההרחבה במדיום PD הן בתא האפיקלי והן בתא התחתון של הלוחות. דגירה של האורגנואידים בחממת תרביות תאים למשך 14 יום ורענן את מדיום הפרקינסון כל 3 ימים. הערה: ניתן להבחין בריסונים ניידים באורגנואידים התלת-ממדיים והדו-ממדיים תחת מיקרוסקופ מהיום ה-7 לאחר הדגירה במדיום ה-PD. לאחר 14 יום של תרבית התמיינות במדיום PD, האורגנואידים של דרכי הנשימה בוגרים למניפולציות ניסיוניות שונות.</li>
		<li>מדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) אחת ביומיים באמצעות מערכת למדידת התנגדות חשמלית, בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי שתוארב-17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L., ו- M.C.C. רשומים כממציאים בפטנט של אורגנואידים של דרכי הנשימה (פרסום מס': US-2021-0207081-A1). המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

דרכי הנשימה האנושיות מרופדות באפיתל דרכי הנשימה, הידוע גם בשם אפיתל הציליאתי המדומה. סוגי התאים העיקריים של אפיתל דרכי הנשימה העליונות הם תאים מצומדים המאפשרים לתנועה מתואמת של הריסונים האפיקליים שלהם לגרש ריר וחלקיקים בשאיפה מדרכי הנשימה, תאי גביע המייצרים ומפרישים ריר, ותאי בסיס התוחמים את קרום המרתף ומעורבים בהתחדשות. בדרכי הנשימה הקטנות כמו ברונכיולס, אפיתל דרכי הנשימה הקובואידלי מכיל תאי מועדון מפרישים ופחות תאים מצומדים מאשר באזורי דרכי הנשימה העליונים. אנו מתארים פרוטוקול חזק להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי ...

אורגנואידים הפכו לכלי חזק ואוניברסלי למידול חוץ גופי של התפתחות איברים ולחקר ביולוגיה ומחלות. כאשר מתרבים בתרבית במדיום תרבית המוגדר על ידי גורם גדילה, תאי גזע בוגרים (ASC) ממגוון איברים ניתנים להרחבה בתלת-ממד (3D) ולהרכיב את עצמם לאשכולות תאיים דמויי איברים המורכבים מסוגי תאים מרובים, המכונים אורגנואידים. המעבדה של Clevers דיווחה על הנגזרת של האורגנואיד הראשון שמקורו ב-ASC, אורגנואיד מעיים אנושי, בשנת 2009 1,2. לאחר מכן, אורגנואידים שמקורם ב-ASC הוקמו עבור מגוון של איברים ורקמות אנושיות, כולל ערמונית 3,4, כבד 5,6, קיבה 7,8,9, לבלב10, בלוטת החלב11 וריאה 12,13 . אורגנואידים אלה שמקורם ב-ASC שמרו על התכונות התאית, המבנית והתפקודית הקריטיות של האיבר המקומי ושמרו על יציבות גנטית ופנוטיפית בתרבית ההתפשטות ארוכת הטווח14,15.
אורגנואידים יכולים גם להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC), כולל תאי גזע עובריים (ES) ותאי גזע פלוריפוטנטי מושרים (iPS)16. בעוד שאורגנואידים שמקורם ב-PSC מנצלים את מנגנוני התפתחות האיברים לצורך הקמתם, ניתן לכפות ASCs ליצור אורגנואידים על ידי בנייה מחדש של תנאים המחקים את נישת תאי הגזע במהלך חידוש עצמי של רקמות פיזיולוגיות או תיקון רקמות. אורגנואידים שמקורם ב-PSC הם מודלים נוחים לחקר ההתפתחות והאורגנוגנזה, אם כי אינם מסוגלים להגיע לרמת ההבשלה הדומה של אורגנואידים שמקורם ב-ASC. מצב ההבשלה דמוי העובר של אורגנואידים שמקורם ב-PSC, והמורכבות לביסוס אורגנואידים אלה מונעים באופן משמעותי את היישומים הרחבים שלהם לחקר ביולוגיה ופתולוגיה ברקמות בוגרות.
מערכת הנשימה האנושית, מהאף ועד הסימפונות הטרמינליים, מרופדת באפיתל דרכי הנשימה, המכונה גם אפיתל הציליאתי המדומה, המורכב מארבעה סוגי תאים עיקריים, כלומר תאים סיליים, תא גביע, תא בסיס ותא מועדון. הקמנו את אורגנואיד הריאה האנושית שמקורו ב-ASC מרקמות ריאה אנושיות בשיתוף עם המעבדה של Clevers12,13. אורגנואידים ריאה אלה מורחבים ברציפות במדיום ההתפשטות במשך למעלה משנה; משך הזמן המדויק משתנה בין קווים אורגנואידים שונים המתקבלים מתורמים שונים. עם זאת, בהשוואה לאפיתל הטבעי של דרכי הנשימה, אורגנואידי ריאה אלה הניתנים להרחבה ארוכת טווח אינם בוגרים מספיק מכיוון שתאים ציליאנטים, אוכלוסיית התאים העיקרית בדרכי הנשימה האנושיות, סובלים מתת-ייצוג באורגנואידים של ריאה אלה. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול התמיינות פרוקסימלית ויצרנו אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, אשר מבחינה מורפולוגית ותפקודית פנוסקופיה של אפיתל דרכי הנשימה לרמה כמעט פיזיולוגית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול וידאו להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות הריאה הראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים לתרבית אורגנואידים ריאתיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקדמים DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>תוסף 500nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, סוג 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr> <tr><td>FGF-10</td><td>פפרוטק</td><td>100-26</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>פפרוטק</td><td>100-19</td><td>5 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>גלוטמקס (גלוטמין)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>35050061 1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>הרגולין ובטא;-1</td><td>פפרוטק</td><td>100-03</td><td>5 ננומטר</td></tr><tr><td>N-אצטילציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td>1.25 מ"מ</td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>נוגין (מדיום מותנה)</td> <td>תוצרת</td><td></td> <td>בית-10x</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Rspondin1 (בינוני מותנה)</td> <td>תוצרת</td><td></td> <td>בית-10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 ומיקרו; M</td></tr><tr><td><חזק>תווך התמיינות פרוקסימלי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Heparin Solution</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>7980</td><td>4 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>Hydrocortisone Stock Solution</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>7925</td><td>1 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X תוסף</td><td>ממשק נוזלי אוויר תוסף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI בזל בינוני</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>05001</td><td>ממשק נוזלי אוויר בינוני</td></tr><tr><td>בסיסי PneumaCult-ALI תוסף תחזוקה תוסף</td><td></td><td></td><td>תחזוקה ממשק נוזלי אוויר</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי</td><td>אופה</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 או 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>סטריאו-מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>פיפטור סרולוגי</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN שחור או ZEN כחול תוכנה</td><td>Zeiss</td><td></td><td>לניתוח</td></tr> <tr><td><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ טכנולוגיית Trans-well</td><td>StemCell</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 12 בארות</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 ו-50 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5 מ"מ טכנולוגיית תאי גזע טרנס-באר</td><td></td> <td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק רפואי, 0.22 ומיקרו; m</td><td>צינורות מיקרופוגה SLGPR33RB סיגמא-אולדריץ'</td><td></td> טיפים מיקרופיפטה אפנדורף תרמו פישר סיינטיפיק TFLR140-200-Q21190531 פסטר פיפטה זכוכית תרמו פישר סיינטיפיק 22-378893 פיפטות סרולוגיות (5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל) תרמו פישר סיינטיפיק BA08003, 08004, 08005 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עזים נגד עכבר Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד חולדה Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי ציטוקרטין 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד מוצין 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי &בטא;-טובולין 4</td><td>סיגמא</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>חולדה אנטי-אוטרוגלובין/CC-10</td><td>R& D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Other reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>דיסוציאציה אנזים</td></tr></tbody></table>

ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

היעדר מודל חוץ גופי חזק של אפיתל הנשימה האנושי מעכב את הבנת הביולוגיה והפתולוגיה של מערכת הנשימה. אנו מתארים פרוטוקול מוגדר להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי גזע בוגרים ברקמת הריאה ולגרום להתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה. האורגנואידים של הריאה מורחבים ברציפות במשך למעלה משנה עם יציבות גבוהה, בעוד שהאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה משמשים כדי לדמות באופן מורפולוגי ותפקודי אפיתל דרכי הנשימה האנושי לרמה כמעט פיזיולוגית. לפיכך, אנו יוצרים מודל אורגנואידי חזק של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. ההתרחבות ארוכת הטווח של אורגנואידים של ריאה ואורגנואידים מובחנות של דרכי הנשימה מייצרת מקור יציב ומתחדש, ומאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את תאי האפיתל של דרכי הנשימה האנושיות במנות תרבית. מערכת האורגנואידים של הריאה האנושית מספקת מודל ייחודי ופעיל מבחינה פיזיולוגית במבחנה עבור יישומים שונים, כולל חקר אינטראקציה בין נגיף למארח, בדיקות תרופות ומידול מחלות.

פרוטוקול זה מאפשר נגזרת של אורגנואידים של ריאה אנושית עם שיעור הצלחה גבוה. רקמת ריאה אנושית טרייה טחונה לחתיכות קטנות, ולאחר מכן מתפרקת עם קולגן. התאים הבודדים המתקבלים מוטמעים במטריצת המרתף ומודגרים במדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה בתוספת קוקטייל של גורמי נישה לצמיחת תאי גזע אפיתליאליים (שלב 1.1.2). איור 1 מראה את המיקרו-צילום של תאי ריאה שזה עתה בודדו, המוטמעים במטריצת ממברנת מרתף של גורם גדילה מופחת מסוג 2 (BME; איור 1A, משמאל). אורגנואידים ציסטיים מופיעי...

הפרוטוקול מציג שיטה להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות ריאה ראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המנצלים בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות.

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

אנו מציגים שיטה לביסוס תרבית האורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות בלוחות תרבית. אנו מפיקים אורגנואיד ריאה אנושי ישירות מרקמות ריאה ראשוניות ביעילות גבוהה. האורגנואידים של הריאה האנושית הנגזרת מורחבים ביציבות במשך למעלה משנה, ופרוטוקול התמיינות פרוקסימלית מאפשר יצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה שיכולים לדמות בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות לרמה כמעט פיזיולוגית.לכן, מערכת התרביות מאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות בלוחות תרבית. המדגימים את ההליך יהיו מאן צ'ון צ'יו ויפי יו, דוקטורנטים במעבדה שלנו כדי להתחיל את בידוד התאים מרקמות הריאה האנושיות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית, לטחון את רקמות הריאה לחתיכות קטנות של מילימטר אחד עם אזמל סטרילי ולשטוף את חלקי הרקמה עם 10 מיליליטרים של מדיום בסיסי קר. צנטריפוגה של הרקמות ב-400 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט לפני החייאה של הכדור בשמונה מיליליטרים של תווך בסיסי בתוספת קולגן בריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.לאחר מכן, לעכל את חלקי הרקמה על ידי ניעור הצינור ב 120 סל"ד במשך 30 עד 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לגזוז את חלקי הרקמה המעוכלים. לאחר מכן, סנן את ההשעיה עם מסננת של 100 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר.משחזרים ומעבירים את חלקי הרקמה מהמסננת לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר עם המדיום הבסיסי. כדי לסיים את העיכול, הוסיפו סרום בקר עוברי לזרימה-דרך לריכוז סופי של 2%לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור והחזירו את גלולת התא ב-10 מיליליטרים של התווך הבסיסי כפי שתואר קודם לכן. לאחר צנטריפוגה, החיזרו את הכדור ב-80 עד 160 מיקרוליטרים של מדיום מטריצת מרתף קר והניחו את הצינורות על קרח.לאחר מכן, הוציאו 40 מיקרוליטרים של המתלים לכל באר של לוחית תרחיף 24 בארות שחוממה מראש. הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. אפשרו למטריצת המרתף להתמצק וליצור טיפה.לאחר הדגירה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של אורגנואידים של אורגנואידים של ריאה אנושית עם תוספת של חמישה ננומולרים של הרגלולין-בטא 1 לכל באר ודגמו את הצלחת בחממת תרביות תאים. לאחר שלושה ימים, יש להסיר את המדיום הישן תוך שמירה על שלמות הטיפות ולהוסיף בזהירות מדיום רענן. לאחר 10 עד 14 ימים של מעבר, התבוננו באורגנואידים תחת מיקרוסקופ וודאו שהאורגנואידים אינם משובצים בצפיפות תאים גבוהה מאוד.כדי להעביר את האורגנואידים של הריאה עם גזירה, לשבור את הטיפות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה מיליליטר אחד. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים יחד עם המדיום לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר והתאימו את הנפח ל-10 מיליליטרים עם תווך בסיסי קר. צנטריפוגה של הצינור ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant, ולשטוף את האורגנואידים עם 10 מיליליטרים של תווך בסיסי קר.לאחר מכן, החיזרו את האורגנואידים בשני מיליליטרים של תווך בסיסי קר וגזרמו לחתיכות קטנות עם פיפטה של פסטר. לאחר מכן, הוסיפו את המדיום הבסיסי לנפח כולל של 10 מיליליטר וצנטריפוגה לפני שתחזירו את השברים האורגנואידים עם מטריצת מרתף קרה המספיקה כדי לאפשר הרחבה של 1:3 עד 1:5 ולהניח את הצינורות על קרח. מחלקים 40 מיקרוליטרים של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת 24 קידוח שחוממה מראש כדי לדגור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצת המרתף להתמצק למשך 10 עד 15 דקות.מאוחר יותר, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום הרחבת אורגנואידים של ריאה לכל באר ודגרו בחממת תרביות תאים. לרענן את המדיום כל שלושה ימים ולהעביר את האורגנואידים כל שבועיים. כדי להעביר אורגנואידים ריאה עם טריפסיניזציה, resuspend קטפו אורגנואידים ריאה במיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.דגירה של האורגנואיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לצינור וגוזזים את האורגנואידים באופן מכני על ידי צנרת למעלה ולמטה. בדוק את גודל החלקים האורגנואידים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 לפני סיום העיכול עם 40 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי.להרכיב את הנפח ל-10 מיליליטרים עם תווך בסיסי וצנטריפוגה לפני החייאה של החלקים האורגנואידים במטריצת מרתף קרה עם נפח מספיק כדי לעבור ביחס של 1:5 עד 1:10. מאוחר יותר, הוציאו 40 מיקרוליטרים של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת בעלת 24 בארות ותרבתו את הצלחת כפי שהודגם קודם לכן. כדי ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים של דרכי הנשימה, יש לדגום את האורגנואידים של הריאה במדיום ההתפשטות למשך שבעה עד 10 ימים לאחר המעבר באמצעות גזירה מכנית.לאחר מכן, החליפו את מדיום ההתפשטות במדיום התמיינות פרוקסימלית והכניסו את האורגנואידים לחממת תרביות תאים. לאחר 14 יום, השליכו את המדיום בכל באר והוסיפו חיץ ליזאט של תאים כדי לקצור את האורגנואיד המובחן של דרכי הנשימה לצורך מיצוי RNA וזיהוי ביטוי גנים תאיים על ידי בדיקת RT-qPCR. קדם הדגירה של התוספות בחממת תרביות התאים עם 250 ו-500 מיקרוליטרים של המדיום הבסיסי בתא העליון והתחתון של צלחת בת 24 בארות, בהתאמה.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לצינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לתאים בודדים. שימו לב לתאים מתחת למיקרוסקופ לפני שתסיימו את העיכול עם 40 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי. מסננים את התאים דרך מסננת של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר ומעבירים את תרחיף התא המסונן לצינור של 15 מיליליטר.מלאו את המתלים במדיום בסיסי עד נפח כולל של 10 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, החייאת הכדור שנאסף מ-24 טיפות ב-1 עד 2.5 מיליליטר של מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה, בהתאם לצפיפות התא. ספרו את מספר התאים עם מונה התאים מתחת למיקרוסקופ, ואז התאימו את ריכוז התאים ל-1.3 פעמים 10 ל-6 למיליליטר עבור תוספות של 24 בארות.הסר את התווך הבסיסי מהתאים העליונים והתחתונים לפני הוספת 500 מיקרוליטרים של מדיום הרחבה בתא התחתון. זרע 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא שהוכנו מוקדם יותר על התא האפיקלי של 24 הקידוחים מוכנסים ודגירה. לאחר יומיים, החליפו את מדיום ההתפשטות במדיום דיפרנציאציה פרוקסימלי הן בתא האפי והן בתא התחתון של הצלחת.דגירה של האורגנואידים למשך 14 יום ורענן את המדיום כל שלושה ימים. מודדים את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית מדי יום באמצעות מערכת למדידת התנגדות חשמלית. במיקרופוטוגרף המייצג, ניתן לראות את תאי הריאה המבודדים הטריים מוטבעים במטריצת ממברנת מרתף של גורם גדילה מופחת סוג 2.האורגנואידים הציסטיים הופיעו וגדלו עם הזמן. האורגנואידים הריאתיים לאחר המעבר הרביעי מודגמים כאן. תוך שעתיים מרגע הגזירה המכנית, השברים האורגנואידים המוטמעים בתמצית קרום המרתף יצרו את התחומים הציסטיים.המיקרו-צילום של אותו שדה ביום החמישי אישר את צמיחת האורגנואידים לאורך זמן. האורגנואידים המתרחבים הכילו את כל ארבעת סוגי תאי האפיתל העיקריים של דרכי הנשימה, כולל תא ציליאלי חיובי ל-ACCTUB או FOXJ1 חיובי, תא בסיס חיובי ל-P63, תא מועדון חיובי ל-CC10 ותא גביע חיובי ל-MUC5AC במצב מוקדם מדי. האורגנואידים שהודגמו במדיום ההתפשטות וההתמיינות הפרוקסימלי פיתחו מורפולוגיה מובחנת לאורך זמן.לאחר שבועיים של התמיינות במדיום ההתמיינות הפרוקסימלית, ניתן היה להבחין בריסונים תנועתיים בכל אורגנואיד. נצפה כי סיליה המכה באופן סינכרוני הניעה את פסולת התאים בתוך לומן האורגנואידי וסובבה אותם באופן חד כיווני כדי להסיר את החלקיקים השאפויים. יתר על כן, ניתוח הציטומטריה של הזרימה הראה כי האורגנואידים המובחנים התאימו לארבעה סוגי תאי אפיתל של דרכי הנשימה במדיום התמיינות והתפשטות פרוקסימליים.לאחר שבועיים של התמיינות, אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה פיתחו מחסום אפיתל שלם. בדיקת חסימה של דקסטרן בוצעה כדי להעריך את שלמות מחסום האפיתל שנוצר באורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה. האורגנואידים הדו-ממדיים הכילו שפע של תאים מצויסים.האורגנואידים של הריאה הניתנים להרחבה ארוכת טווח והאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה מספקים מערכת מודלים פעילה מבחינה פיזיולוגית ואוניברסלית לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של הנשימה, כולל COVID-19.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מפנה ביעילות עכבר גזע עוברי תא נגזרות האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל. טכניקת בידול זה משתמשת 3 ממדי פיגומי ריאות decellularized לכוון מפרט שושלת ריאות, באווירת התרבות מוגדרת, סרום ללא.

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

מאמר זה מתאר את היצירה של מודל מחסום דרכי נשימה מורכב ורב-תאי המורכב מאפיתל ריאות שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), מזנכימה, תאי אנדותל ומקרופאגים בתרבית ממשק אוויר-נוזל.

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

למדו שיטה לביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות מתאי ריאה ראשוניים והתמיינותם ליצירת דגם תלת-ממדי של אפיתל דרכי הנשימה. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגיה נשימתית ומחלות כגון COVID-19.

ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה

גלה סרטונים נוספים