המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע
15 בפברואר 2022
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.
זיהוי תנועתיות חיידקים חשוב מכיוון שתנועתיות חיונית לפתוגניות. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה אמינה לזיהוי תנועתיות חיידקים, מכיוון שהוא מבוסס על תגובת הצבע של TTC עם דהידרוגנאזות תוך-תאיות של חיידקים חיים. שיטת האגר המוצק למחצה TTC לאיתור תנועתיות חיידקים היא פשוטה, קלה לתפעול ואינה מערבת מכשירים גדולים ויקרים.
השיטה יכולה לשמש מיקרוביולוגים קליניים או חוקרים כדי לחקור חיידקים פתוגניים. מי שידגים את ההליך יהיה שי-יי ג'ואנג, ניסוי בכיר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו את המדיום המוצק למחצה המסורתי על ידי הוספת 10 גרם טריפטוז, 15 גרם נתרן כלורי וארבעה גרם אגר בנפח מספיק של מים מזוקקים.
התאם את ה- pH ל -7.2 והרכיב את הנפח הסופי ל -1,000 מיליליטר. חיטוי המדיום ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות והוציאו את המדיום למבחנות של 10 מיליליטר לגובה של שלושה סנטימטרים. כדי להכין את מדיום ה-TTC, יש לקרר את המדיום המסורתי האוטומטי ל-50 מעלות צלזיוס ואז להוסיף חמישה מיליליטר של תמיסת TTC סטרילית של 1% ל-100 מיליליטר של מדיום.
מערבבים ומחלקים את המדיום למבחנות של 10 מיליליטר לגובה של שלושה סנטימטרים. בחר מושבות בודדות של חיידקים מצלחות אגר וחסן אותן לשתי המדיה המוצקה למחצה על ידי ניקוב באמצעות מחטי חיסון. זכור לכלול זנים לא מודאליים כבקרות שליליות וזנים מודאליים כבקרות חיוביות.
כדי לבחון את השפעת ריכוז האגר על תנועתיות החיידקים, הכינו מדיה מוצקה למחצה המכילה ריכוזי אגר שונים וחסנו אותם על ידי ניקוב. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וצפו בתוצאות לאחר 24 עד 48 שעות דגירה. אם רק קו הניקוב אדום, אפיינו את החיידקים כלא מודאליים.
אם הצבע האדום מתפשט החוצה לאורך קו הניקוב, אפיינו את החיידקים כמודאלים. תנועתיות החיידקים הושוותה עבור זנים שונים על מדיה מוצקה למחצה מסורתית ו-TTC וסוכמה בטבלה זו. לאחר תרבית במשך 24 שעות על מדיום מוצק למחצה TTC, סטפילוקוקוס זהוב הראה צמיחה לאורך הקו המחוסן.
ואילו Escherichia coli הראה צמיחה לכל הכיוונים סביב הקו המחוסן. התנועתיות הגבוהה ביותר עבור Escherichia coli נצפתה במדיום חצי מוצק TTC שהוכן עם 0.3% אגר שבו המדיום הפך כמעט כולו לאדום. לעומת זאת, אזור הדיפוזיה האדומה ירד ב-0.5% אגר והדיפוזיה התארכה עם העלאת ריכוז האגר ל-0.8%חשוב להתאים את ה-pH ל-7.2 ולקרר את המדיום האוטוקלאב ל-50 מעלות צלזיוס לפני החיסון באמצעות המחטים.
יש לחסן חיידקים על ידי ניקוב לתוך המדיום המוצק למחצה המכיל TTC. זוהי שיטה ישירה לאיתור תנועתיות חיידקים. ניתן גם לזהות תנועתיות בעקיפין על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני ו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול מהימן לזיהוי ניידות חיידקית, שהיא חיונית להבנת הפתוגניות. השיטה מבוססת על תגובת צבע של TTC עם דהידרוגנזות תוך-תאיים של חיידקים חיים, ומספקת גישה פשוטה ומדויקת הדורשת ציוד מינימלי.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מחקר
- ניידות חיידקית וחשיבותה במפתוגניות
- מיקרוביולוגיה קלינית ומתודולוגיות מחקר
- בדיקות קולורימטריות לזיהוי מיקרוביאלי
רקע
- חשיבותה של ניידות חיידקית במחלה
- שיטות קיימות לזיהוי ניידות ומגבלותיהן
- הצורך בשיטה מהימנה ונגישה
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטת אגר חצי-מוצק TTC
- זני חיידקים שונים, כולל Staphylococcus aureus ו-Escherichia coli
- הערכה קולורימטרית של תנועתיות
תוצאות עיקריות
- Staphylococcus aureus מראה צמיחה לאורך קו הדקירה, מה שמעיד על ניידות מוגבלת
- Escherichia coli הראתה צמיחה נרחבת, המעידה על ניידות גבוהה יותר במדיום TTC
- השיטה מבדילה ביעילות בין חיידקים ניידים לבלתי ניידים
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה פשוטה להערכת ניידות חיידקית, שהיא קריטית במחקרי פתוגנים.
- הנגישות של הפרוטוקול הופכת אותו לבעל ערך הן במסגרות קליניות והן במסגרות מחקריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
זיהוי מהימן של ניידות חיידקית הוא חיוני להבנת מנגנוני פתוגניות, היווצרות ביופילם ועמידות לתרופות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות אנטי-אינפקטיביות. בדיקה קולורימטרית מבוססת TTC מאפשרת הערכה כמותית וסטנדרטית של פנוטיפים של ניידות, ובכך תומכת בביטחון חזוי באישור יעדים (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. שיטה זו מציעה תוצאות נגישות וניתנות לשחזור, המשמשות למיון תיק מוצרים ולקידום מותאם-סיכונים במחקר ופיתוח של מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה תפקודית של ניידות כגורם virulent (גורם virulent) בחיידקים פתוגניים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין זנים מודאליים לבלתי מודאליים תחת תנאים מוגדרים.
- מספק נתונים פנוטיפיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך תיקוף מטרות ומחקרי מנגנונים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקל על הכנת בדיקות ניידות (motility assays) מתוּקפות עבור תהליכי סריקת תרכובות.
- מספק פלטים קולורימטריים סטנדרטיים, הקלים לפירוש ולהשוואה בין ניסויים שונים.
- מאפשר פריסה ניתנת להרחבה של בדיקות עם תשתית מינימלית, להכנה לסריקה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פנוטיפ הניידות עם התנהגויות חיידקיות הרלוונטיות למחלה לצורך רצף תרגומי.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור בין ניידות in vitro לבין פתוגניות פוטנציאלית in vivo.
- מספקת פלטפורמה להערכת ההשפעה של משתנים סביבתיים על פנוטיפים של ניידות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
בדיקה זו של ניידות המבוססת על TTC משתלבת ברצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מוביל, ומאפשרת סריקה פנוטיפית חסונה ותיקוף מטרות עבור פורטפוליו של תרופות אנטי-זיהומיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על מנגנונים פתוגניים מונעי-ניידות ובבירור מסלולים.
- סריקה: מספקת פלטיים קולורימטריים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקה והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה ישירה של פנוטיפים של ניידות בין זנים ותנאים שונים באמצעות דפוסי דיפוזיה מדידים.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני ניידות in vitro להתנהגויות חיידקיות רלוונטיות למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי מודלים במדרג הבא.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה בעלת עלות נמוכה וניתנת לשימוש חוזר להערכת ניידות במגוון מיני חיידקים ותוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי חומרים אנטי-אינפקטיביים.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות ניידות (motility assays) סטנדרטיות, ניתנות לשחזור וניתנות להרחבה ללא צורך במכשור ייעודי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אפשרות להפחתת סיכונים פנוטיפית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים אנטי-אינפקטיביים בהתבסס על נתוני ניידות תפקודיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מיקרוביולוגית בסיסית להקמת הבדיקה ולפירוש תוצאותיה.
- דרישות מינימליות לציוד, המוגבלות לאינקובטורים סטנדרטיים וציוד מעבדה בסיסי.
- סטנדרטיזציה של ריכוז האגר, ה-pH ותנאי האינקובציה היא קריטית להשגת הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למגוון של מיני חיידקים ותנאים סביבתיים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות רגישות לתנאי גידול ודרישה לחיידקים חיים ופעילים מטבולית.
