Name: ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למדו שיטת הכלאה in situ עם אימונוהיסטוכימיה בחתכי קריו של עוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מקביל של mRNA וחלבון במערכת העצבים המרכזית ותומכת במחקר ביולוגיה התפתחותית ונוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (MS12019011), קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (JC2021058), והקרן למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (21KJB180009).

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ננטונג (מס 'S20191210-402).
1. אוסף עוברים של דגי זברה
<ol><li>הציבו זוג דגי זברה במכלי רבייה בלילה שלפני איסוף הביצים, האחד דג זברה מהונדס והשני דג זברה מסוג AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type או Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (ראו טבלת חומרים). השתמש במחיצת פלסטיק אלכסונית כדי להפריד בין הזכר לנקבה כדי למנוע גישה פיזית. למחרת, הכניסו את החלק העליון של מיכל הרבייה לחלק תחתון נקי מלא במים מתוקים, והסירו את המחיצה של מיכל הרבייה. אפשרו לדגים להזדווג במשך 10-20 דקות, ואספו את הביצים לאחר ששקעו לתחתית מיכל הרבייה.</li>
	<li>תרבית את העוברים בתווך עובר E3 (ראה טבלת חומרים) המכיל מתילן כחול (1 מ"ל של 0.05% מתילן כחול ב 1 ליטר של תווך עובר E3) ב 28.5 ° C.</li>
	<li>טפל בעוברים 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) עם phenylthiourea (PTU, ראה את טבלת החומרים) כדי למנוע היווצרות פיגמנט. הערה: בעלי חיים משני המינים משמשים בניסויים.</li>
</ol>2. הכלאה באתרו
הערה: המים המשמשים לשלבים 2.1-2.11 הם מים מטופלים דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>תקן ~ 10 עוברים עם 0.5-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA, ראה טבלת חומרים) בצינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ב 4 ° C למשך לילה במשך 12-14 שעות. הערה: הפרוטוקול להכלאה באתרו שונה מעט מספרות12 שפורסמה בעבר. PFA חייב להיות מוכן טרי ומאוחסן ב 4 ° C בתוך שבוע אחד של שימוש או במשך חודש אחד ב -20 ° C. כל השלבים הבאים בהכלאה באתרם בוצעו באמצעות צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל.</li>
	<li>השתמש פינצטה כדי להסיר את העור של עוברים בלבד מעל 48 hpf. הערה: העור מוסר כדי להקל על חדירת בדיקות RNA לאזור תא המטען של עוברים מעל 48 hpf.</li>
	<li>יש לייבש בהדרגה את העוברים על ידי שטיפה עם 25%, 50% ו-75% מתנול במי מלח חוצצי פוספט 1x המכילים 0.1% Tween-20 ברציפות (PBST, ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים במשך 5 דקות ב 100% מתנול בטמפרטורת החדר. לדגור על העוברים ב 100% מתנול ב -20 ° C לפחות לילה במשך 12-14 שעות. הערה: עוברים מיובשים ניתן לאחסן 100% מתנול ב -20 ° C במשך 6 חודשים.</li>
	<li>יש להחזיר בהדרגה לחות לעוברים על ידי שטיפה עם 75%, 50% ו-25% מתנול ב-PBST ברציפות למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לעכל את העוברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K (ראה טבלת חומרים) ב PBST בטמפרטורת החדר (ראה טבלה 1).</li>
	<li>שטפו את העוברים עם PBST במשך 5 דקות. בצעו את שלב השטיפה שלוש פעמים.</li>
	<li>יש לתקן את העוברים שטופים ב-4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: שלב זה עוצר את העיכול מכיוון ש- PFA משבית פרוטאינאז K. ודא שהדגימה מעורבבת בעדינות כדי לחשוף את כל העוברים ל- PFA; ניתן להניח את הצינורות על צידיהם כדי לפזר באופן שווה את העוברים בתמיסה. PFA זה לא חייב להיות טרי (זה יכול להיות בקירור עד 2 שבועות).</li>
	<li>יש לשטוף את העובר שלוש פעמים עם PBST, תוך דגירה במשך 5 דקות במהלך כל שטיפה.</li>
	<li>בצע קדם-הכלאה של העוברים על ידי דגירה עם תמיסת קדם-הכלאה (preHYB, ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות. החלף את preHYB בתמיסת הכלאה (HYB, ראה טבלת חומרים) וקדם הכלאה במשך 4 שעות לפחות ב- HYB. הערה: לפני שתמשיך עם prehybridization, לחמם מראש את התמיסות ל 65 ° C. פורממיד (ראו טבלת חומרים) משמש לשמירה על הצורה והמבנה של הרקמה. פורממיד גם מונע קשירה של שברים לא הומולוגיים בטמפרטורות נמוכות.</li>
	<li>חממו את הבדיקה (Insm1a או 5-HT2C) ב-HYB במשך 5 דקות ב-95°C לפני הוספתכם לעוברים. השתמש בבדיקה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל HYB. הסר כמה שיותר preHYB מבלי לתת לעוברים לבוא במגע עם האוויר, והוסף בדיקה שחוממה מראש ב- HYB לצינור המכיל את העוברים. הערה: ניתן להשתמש בבדיקת RNA מסומנת כדי לבצע הכלאה עם רצף mRNA מטרה בעוברים. לכן, הבדיקה יכולה לשמש כדי לזהות את הביטוי של גן של עניין ואת המיקום של mRNA.</li>
	<li>אפשרו לגשושית לבצע הכלאה במהלך הלילה (12-14 שעות) בטמפרטורה של 50-70 מעלות צלזיוס. הערה: טמפרטורת ההכלאה שונה עבור בדיקות שונות.</li>
	<li>למחרת, שאפו את תמיסת הבדיקה עם פיפטה ואחסנו אותה בצינור ב -20 מעלות צלזיוס, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר פעמים רבות.</li>
	<li>לשטוף את העוברים כדלקמן:<ol><li>שטפו את העוברים במשך 15 דקות עם 100% HYB ב-65°C.</li>
		<li>שטפו את העוברים ברצף עם 75%, 50% ו-25% HYB ב-2x ציטראט מי מלח סטנדרטיים המכילים 0.1% Tween-20 (SSCT, ראו טבלת חומרים) במשך 15 דקות כל אחד ב-65°C.</li>
		<li>שטפו את העוברים במשך 15 דקות ב-2x SSCT ב-65°C.</li>
		<li>שטפו את העוברים במשך 15 דקות ב-0.2x SSCT ב-65°C.</li>
	</ol></li>
	<li>שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות במאגר חומצה זכרית המכיל 0.02% Tween-20 (MABT, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חסום את העוברים ההיברידיים והשטופים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר עם 2% תמיסה חוסמת-1 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>החלף את תמיסת החסימה-1 באנטידיגוקסיגנין AP (דילול בקנ"מ 1:4,000, ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה טרייה של 2%-1 ונער למשך הלילה במשך 12-14 שעות בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>שטפו את העוברים ארבע פעמים במשך 30 דקות ב-MABT בטמפרטורת החדר. הערה: הוציאו את הסגול BM (ראו טבלת חומרים) מהמקרר במהלך הכביסה השלישית ונערו אותו מדי פעם במהלך השטיפות הבאות.</li>
	<li>שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות ב-NTMT (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1% Tween-20, ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש פיפטה כדי להסיר כמה שיותר NTMT מן העוברים. יש להחליף במצע AP סגול BM ולהכתים את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך. עקוב אחר שינויי הצבע כל 30 דקות כדי לשלוט במידת הצביעה. הערה: זמן הצביעה הספציפי שונה ויש להתאים אותו בהתאם לכל בדיקה. דגירה על העוברים ב 37 מעלות צלזיוס יכולה להאיץ את התגובה. דגירה על העוברים ב 4 מעלות צלזיוס יכולה להגדיל את זמן התגובה וניתן לעשות זאת בן לילה.</li>
	<li>ברגע שהוא מפותח במידה הרצויה, להפסיק את התגובה על ידי שטיפה קצרה עם NTMT פעמיים. לאחר הכלאה באתר , שטפו את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 20 דקות.</li>
</ol>3. הטבעה
<ol><li>לטבול את העוברים 5% סוכרוז ב 1x PBS (ראה את טבלת החומרים) למשך 12-14 שעות ב 4 ° C.</li>
	<li>שנה את התמיסה המכסה את העוברים ל 15% סוכרוז ב 1x PBS ודגור לילה במשך 12-16 שעות ב 4 ° C.</li>
	<li>שנה את התמיסה המכסה את העוברים ל -30% סוכרוז ב 1x PBS ודגור במשך 1-2 ימים ב 4 ° C. הערה: יש לדגור בתמיסה זו עד שהעוברים שוקעים לתחתית הצינור.</li>
	<li>מלאו קריומולד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינונית (ראו טבלת חומרים). מעבירים את העוברים ב-30% סוכרוז לקריומולד עם מדיום OCT. מערבבים אותם כדי להסיר את הסוכרוז מהעוברים.</li>
	<li>מעבירים את העוברים לקריאומולד חדש לרקמה וממלאים אותו בעדינות במדיום OCT, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.</li>
	<li>טבלו כל עובר, דחפו אותו לתחתית הקריומולד, והניחו כל עובר בכיוון הרצוי (גבי-גחוני או רוחבי). שמור את העוברים בקו ישר. הערה: מומלץ מאוד להניח עובר אחד בלבד בכל הקפאה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הניחו את העוברים המשובצים בקריומולדים באמבט אתנול קרח יבש.</li>
	<li>יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לפחות למשך הלילה למשך 12-14 שעות. הערה: ניתן לשמור את הקריומולדים בטמפרטורה של -80°C למשך חודש אחד לפחות.</li>
</ol>4. Cryosectioning
<ol><li>הגדר את ההקפאה באמצעות קריוסטט ל -20 ° C.</li>
	<li>הסר את בלוק הדגימה מהקריומולד והנח אותו בהקפאה. מניחים את מדיום OCT על בסיס הצ'אק המצונן ומניחים את הבלוק מלמעלה.</li>
	<li>ודא שגוש הדגימה מקביל לסכין הגילוח. יש לחתוך בזהירות עודפי OCT סביב הדגימה.</li>
	<li>חותכים למקטעים בעובי 12-20 מיקרומטר באמצעות הקפאה. העבר במהירות את המקטעים לשקופיות זכוכית כך שבכל שקופית יהיו 3-4 מקטעים. אפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורת החדר, ואחסנו את המקטעים בקופסת שקופיות אטומה בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>5. Immunostaining
הערה: צביעת GFP מבוצעת על הסעיפים.
<ol><li>שטפו את השקופיות המכילות את הקטעים עם PBS למשך 5 דקות.</li>
	<li>מחממים ציטראט לרתיחה במיקרוגל.</li>
	<li>מניחים את המגלשות במאגר וממשיכים לחמם כדי לשמור על התמיסה קרובה לרתיחה למשך כ-20 דקות. הערה: שלב זה מסייע בשליפת אנטיגן. הרקמה נשארת שלמה גם בטמפרטורות גבוהות, מה שמשפר את איכות הצביעה על ידי מניעת קיפול, נזק או ניתוק של הרקמות.</li>
	<li>תנו לדגימות להתקרר באיטיות לטמפרטורת החדר לפני השלב הבא. מסננים את התמיסה העודפת, מייבשים בזהירות את האזור סביב כל קטע עם פיסת רקמה, ומציירים עיגול סביב הקטע בעזרת עט דוחה מים (ראו טבלת חומרים) ליצירת מחסום הידרופובי. היזהרו לא לייבש את חלקי הרקמות.</li>
	<li>שטפו את המגלשות פעמיים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.</li>
	<li>חוסמים למשך שעתיים בתמיסת חסימה-2 (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תמיסת נוגדנים ראשונית פיפטה (עכבר חד-שבטי α-GFP, 1:250, ראה טבלת חומרים) לכל שקופית ודגרה על המגלשות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.</li>
	<li>שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.</li>
	<li>מסננים עודפי PBS. דגרו על השקפים עם הנוגדן המשני המתאים (1:400, ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב-PBS.</li>
	<li>שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.</li>
	<li>סננו את עודפי ה-PBS, העבירו את מצע ההרכבה למגלשה והרכיבו באמצעות כיסוי החלקה.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+research+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li>
<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018).</li>
<li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li>
<li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li>
<li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li>
<li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li>
<li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+5-HT%282C%29+receptors+regulate+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li>
<li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344(2019).</li>
<li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה מציע שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, צעד חשוב בניסויי הקולוקליזציה בעוברים של דגי זברה. שיטה זו משמשת דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בוצעו על עוברים של דגי זברה. בניגוד למספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר14,15,16, אימונופלואורסצנטיות ואימונוהיסטוכימיה שימשו לחקר ביטוי חלבונים. מעט נוגדנים ספציפיים לדגי זברה אומתו כראוי לשימוש בסעיפים1...

דג הזברה הוא מודל רב עוצמה של בעלי חוליות לחקר התפתחות וגנטיקה 1,2. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה (70% מהגנים משותפים עם הגנום האנושי), המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות3. בדגי זברה שכיח למדי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים ואת הקשר המרחבי ביניהם. אימונוהיסטוכימיה שימשה לראשונה בשנת 1941 לזיהוי פתוגנים ברקמות נגועות על ידי יישום נוגדנים המסומנים בתווית FITC4. חלבון המטרה באזור הרקמה מסומן תחילה בנוגדן ראשוני, ולאחר מכן החלק מסומן בנוגדן משני כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני, אימונוגלובולין. צביעת נוגדנים היא גישה חזקה לזיהוי לוקליזציה של חלבונים, המציעה רזולוציה אופטית גבוהה ברמה התוך תאית. עם זאת, מספר הנוגדנים הזמינים מוגבל מאוד בדגי זברה. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי כ -112,000 נוגדנים זמינים באופן מסחרי עבור עכברים; עם זאת, מעט מאוד נוגדנים הוכחו כאמינים בדגי זברה5.
במקום זאת, בדגי זברה, הכלאה באתרה יושמה באופן נרחב לניתוח דפוסי ביטוי גנים. שיטה זו שימשה לראשונה להערכת ביטוי גנים בעוברי דרוזופילה בשנות ה-80 6,7, ומאז טכנולוגיה זו פותחה ושוכללה ללא הרף. בתחילה, בדיקות DNA מסומנות רדיו שימשו כדי לזהות תעתיקי mRNA; עם זאת, הרזולוציה המרחבית הייתה נמוכה יחסית, והיו סיכונים בריאותיים פוטנציאליים שנגרמו על ידי הרדיואקטיביות. לאחר מכן, הכלאה באתרה מסתמכת על בדיקות RNA המסומנות עם digoxigenin (DIG) או fluorescein (Fluo), אשר מצומדות לפוספטאז אלקליין (AP) או מזוהות על ידי הגברת אות טירמיד פלואורסצנטי (TSA)8,9. למרות שנעשה שימוש ב-TSA כדי לזהות שניים או שלושה גנים, תיוג DIG של בדיקות RNA ונוגדנים מצומדים של antiDIG AP הם עדיין גישות רגישות מאוד, יציבות ובשימוש נרחב להכלאה באתר. לכן, נוגדנים ממוסחרים בשילוב עם בדיקות באתרן המסומנות ב-DIG שימושיים למתן תובנה לגבי לוקליזציה של חלבונים וביטוי של גן אחד.
עוברים שלמים אינם יכולים לחשוף את הקשר המרחבי בין גנים בשל הרזולוציה האופטית הנמוכה, למרות שעוברים של דגי זברה קטנים ושקופים10. לפיכך, חתך יש צורך לנתח את דפוסי הביטוי של גנים ברמה התאית. Cryosectioning כבר בשימוש נרחב בדגי זברה כפי שהוא קל לבצע יכול ביעילות לשמר את האנטיגן. לכן, הכלאה באתרו בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בקריוסקציות של דגי זברה מציעה דרך רבת עוצמה לניתוח דפוסי הביטוי של שני גנים. שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה יושם על דגי זברה11. עם זאת, טיפול בפרוטאינאז K שימש לשיפור חדירת הבדיקה על חשבון שלמות האנטיגן. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה משתמש בחימום כדי לגרום לשליפת אנטיגן. פרוטוקול זה חל לא רק על עוברים בשלבים שונים וחלקי רקמות בעוביים שונים (קטעי ראש של 14 מיקרומטר וחלקי חוט שדרה של 20 מיקרומטר), אלא הוא אומת גם באמצעות גנים המבוטאים בשני איברים, כולל הראש וחוט השדרה.
מאמר זה יתאר כיצד לשלב הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בעוברים של דגי זברה בהקפאה. הרבגוניות של פרוטוקול זה מודגמת על ידי שימוש במספר שילובים של הכלאה באתרו-אימונוהיסטוכימיה, כולל בדיקות הכלאה באתרן עבור שני נוירונים שונים. שיטה זו מתאימה לאיתור mRNA וחלבון באזורים שונים ובעוברים בגילאים שונים, וכן לדפוסי ביטוי של שני גנים.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דיגוקסיגנין AP שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Millipore</td><td>MAB3580</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Blocking-1 תוצרת</td><td></td> מעבדה <td>N/A</td><td>ממיסים את המגיב החוסם ב-1X MAB לריכוז סופי של 10% (wt/vol). חיטוי וחנות ב-20 & #176; C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>תמיסת חסימה-2</td><td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>0.1% טריטון X-100, 3% BSA, 10% סרום עיזים ב-1x PBS</td></tr><tr><td>BM סגול</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Citrate buffer</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא חומצת לימון</td><td></td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold לרקמות, 15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ</td><td>ראש ביוטכנולוגיה</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td> מים <td>מטופלים סנגון ביוטק</td><td>B501005</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>E3 מדיום עוברי</td><td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>5 מ"מ NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 mM MgSO4</תת></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>J& K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td>מיוצר במעבדה</td><td>N/A</td><td>preHYB בתוספת 50 ומיקרו; גרם/מ"ל מלח נתרן הפרין, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל חומצה ריבונוקלאית מלח דיאתילאמינואתנול</td></tr><tr><td>קופסה רטובה אימונוהיסטוכימית</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>להבי לייקה בפרופיל נמוך</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td> <td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>0.1 M חומצה מאלית, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>J& K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>מקלין M859248</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td></tr><tr><td>OCT בינוני</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP עט</td><td>Enzo מדעי החיים</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 4%</td> <td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>מיוצר במעבדה ב-1x PBS</td></tr><tr><td>PBST (1x)</td> <td>מיוצר במעבדה</td><td>N/A</td><td>1x PBS בתוספת 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>50% פורממיד, 5x SSC, 9.2 מ"מ חומצת לימון (pH 6.0), 0.1% טווין-20</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ריבונוקלאית מלח דיאתילאמינואתנול מלח</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNase 1.5 מ"ל</td><td>אמביון</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0.2x)</td> <td>תוצרת מעבדה</td><td>N/A</td><td>0.2x SSC פלוס 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td> <td>מיוצר במעבדה</td><td>N/A</td><td>1x SSC בתוספת 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td></td><td>סוכרוז Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr>מעבדת<td>דג הזברה</td><td>המרכז לבעלי חיים של אוניברסיטת ננטונג</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ב situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה cryosectioned

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

כבעל חוליות, דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה, המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות. מחקר תפקוד גנים מבוסס על זיהוי דפוסי ביטוי גנים. למרות שאימונוהיסטוכימיה מציעה דרך רבת עוצמה להעריך ביטוי חלבונים, המספר המוגבל של נוגדנים זמינים מסחרית בדגי זברה מגביל את היישום של costaining. הכלאה באתרו נמצאת בשימוש נרחב בעוברים של דגי זברה כדי לזהות ביטוי mRNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה עבור קטעי עוברים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. אימונוהיסטוכימיה והדמיה של קריוסקציה יחידה בוצעו לאחר הכלאה באתר . הפרוטוקול עוזר לפענח את דפוס הביטוי של שני גנים, תחילה על ידי זיהוי תעתיק באתרו ולאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה כנגד חלבון באותו קטע.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון בו זמנית את דפוס הביטוי של mRNA אחד וחלבון אחד. איור 1 מראה את זרימת העבודה הניסיונית. קולטן 5-HT2C הוא תת-סוג של קולטן 5-HT הקשור על ידי המוליך העצבי סרוטונין (5-hydroxytryptamine, 5-HT). הוא מופץ באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויכול לווסת באופן משמעותי מגוון תפקודי מוח, כולל תיאבון, מצב רוח, חרדה והתנהגות רבייה13. הביטוי של 5-HT2C במערכת העצבים המרכזית זוהה על ידי הקו המהונדס Tg (foxp2:egfp-caax), שבו נוירונים fox...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

פרוטוקול זה משתמש בשילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, והוא משמש דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. פרוטוקול זה חל על עוברים בשלבים שונים, חלקי רקמות בעובי שונה ואיברים שונים. כדי להתחיל, לתקן כ -10 עוברים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 4% paraformaldehyde טרי בצינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות.יש לייבש בהדרגה את העוברים על ידי שטיפה עם מתנול 25, 50 ו-75% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים ב 100% מתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לדגור על העוברים במתנול 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס לפחות למשך הלילה, למשך 12 עד 14 שעות.יש להחזיר בהדרגה לחות לעוברים על ידי שטיפה עם מתנול 75, 50 ו-25% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לעכל את העוברים עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ב PBST בטמפרטורת החדר, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות.לאחר מכן, תקן מחדש את העוברים שטופים ב 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST תוך דגירה במשך חמש דקות במהלך כל שטיפה. עבור טרום הכלאה של העוברים, לדגור אותם בתמיסת טרום הכלאה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, החליפו את פתרון טרום ההכלאה בפתרון ההיברידיזציה ובצעו טרום הכלאה למשך ארבע שעות לפחות. חממו את הבדיקה בתמיסת ההכלאה במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס לפני הוספתם לעוברים. הוציאו כמה שיותר תמיסת טרום הכלאה מבלי לתת לעוברים לבוא במגע עם האוויר.לצינור המכיל את העוברים, הוסיפו בדיקה שחוממה מראש בתמיסת ההכלאה ואפשרו לגשושית לבצע הכלאה למשך לילה למשך 12 עד 14 שעות בטמפרטורה של 50 עד 70 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת הבדיקה עם פיפטה ואחסנו אותה בצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר פעמים רבות. שטפו את העוברים בתמיסת הכלאה של 100% ואחריה שטיפה רציפה בתמיסת הכלאה של 75, 50 ו-25% בריכוז כפול של SSCT למשך 15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לשטוף את העוברים פי שניים ו 0.2 ריכוז של SSCT במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות ב-MABT בטמפרטורת החדר. חסמו את העוברים ההיברידיים והשטופים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר, עם תמיסה חוסמת של 2%-1.החלף את התמיסה החוסמת-1 באנטידיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז בתמיסה חוסמת טרייה של 2%-1 ונער למשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את העוברים ארבע פעמים ב-MABT במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העוברים פעמיים ב-NTMT והוציאו כמה שיותר NTMT מהעוברים באמצעות פיפטה.יש להחליף במצע אלקליין פוספטאז סגול BM ולהכתים את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שהכתם התפתח, יש להפסיק את התגובה על ידי שטיפה קצרה פעמיים עם NTMT. לאחר הכלאה באתר, שטפו את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 20 דקות.טבלו את העוברים ב-5% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה למשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שנו את התמיסה המכסה את העוברים ל-15% סוכרוז ב-PBS ודגרו למשך הלילה למשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, לשנות את התמיסה המכסה את העוברים ל 30% סוכרוז ב PBS ולדגור במשך יום עד יומיים בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את העוברים לקריאומולד חדש לרקמה וממלאים אותו בעדינות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית תוך הימנעות מהיווצרות בועות. לאחר מכן, חתכו את הדגימות למקטעים בעובי 12 עד 20 מיקרומטר באמצעות קריוסטט והעבירו במהירות את החלקים לשקופיות זכוכית. אפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורת החדר ואחסנו את המקטעים בקופסת שקופיות אטומה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן.שטפו את השקופיות המכילות את הקטעים עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את המגלשות במאגר וחממו את התמיסה במשך כ-20 דקות כדי לשמור אותה קרובה לטמפרטורת הרתיחה. מסננים את התמיסה העודפת ומייבשים בזהירות את האזור סביב כל קטע עם חתיכת רקמה.לאחר מכן, ציירו עיגול סביב הקטע עם עט דוחה מים כדי ליצור מחסום הידרופובי וחסמו את הקטע למשך שעתיים בתמיסה חוסמת -2 בטמפרטורת החדר. פיפטה תמיסת נוגדנים ראשונית לכל מגלשה ולדגור על המגלשות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ורוקנו את עודפי PBS.לאחר מכן, לדגור על המגלשות עם הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב- PBS. שוב, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ונקזו את עודפי PBS. לאחר מכן, פיפטה את מדיום ההרכבה על המגלשה והרכבה עם כיסוי שקופיות.הביטוי של קולטן 5-HT2C במערכת העצבים המרכזית זוהה בקו foxP2 egfp-caax מהונדס. הביטוי בו זמנית של 5-HT2C נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים foxP2, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. הביטוי של insm1a, גורם שעתוק אצבע אבץ בחוט השדרה ובנוירונים המוטוריים של דג הזברה, זוהה בקו המהונדס.הביטוי הסימולטני של insm1a נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים hb9, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. דג זברה חייב להיות קבוע עם paraformaldehyde מוכן טרי.

in-situ-hybridization-combined-with-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

למדו שיטת הכלאה in situ עם אימונוהיסטוכימיה בחתכי קריו של עוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מקביל של mRNA וחלבון במערכת העצבים המרכזית ותומכת במחקר ביולוגיה התפתחותית ונוירומדע.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

גלה סרטונים נוספים