ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

פרוטוקול זה משתמש בשילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, והוא משמש דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. פרוטוקול זה חל על עוברים בשלבים שונים, חלקי רקמות בעובי שונה ואיברים שונים. כדי להתחיל, לתקן כ -10 עוברים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 4% paraformaldehyde טרי בצינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות.

יש לייבש בהדרגה את העוברים על ידי שטיפה עם מתנול 25, 50 ו-75% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים ב 100% מתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לדגור על העוברים במתנול 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס לפחות למשך הלילה, למשך 12 עד 14 שעות.

יש להחזיר בהדרגה לחות לעוברים על ידי שטיפה עם מתנול 75, 50 ו-25% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לעכל את העוברים עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ב PBST בטמפרטורת החדר, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות.

לאחר מכן, תקן מחדש את העוברים שטופים ב 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST תוך דגירה במשך חמש דקות במהלך כל שטיפה. עבור טרום הכלאה של העוברים, לדגור אותם בתמיסת טרום הכלאה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

לאחר מכן, החליפו את פתרון טרום ההכלאה בפתרון ההיברידיזציה ובצעו טרום הכלאה למשך ארבע שעות לפחות. חממו את הבדיקה בתמיסת ההכלאה במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס לפני הוספתם לעוברים. הוציאו כמה שיותר תמיסת טרום הכלאה מבלי לתת לעוברים לבוא במגע עם האוויר.

לצינור המכיל את העוברים, הוסיפו בדיקה שחוממה מראש בתמיסת ההכלאה ואפשרו לגשושית לבצע הכלאה למשך לילה למשך 12 עד 14 שעות בטמפרטורה של 50 עד 70 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת הבדיקה עם פיפטה ואחסנו אותה בצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר פעמים רבות. שטפו את העוברים בתמיסת הכלאה של 100% ואחריה שטיפה רציפה בתמיסת הכלאה של 75, 50 ו-25% בריכוז כפול של SSCT למשך 15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, לשטוף את העוברים פי שניים ו 0.2 ריכוז של SSCT במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות ב-MABT בטמפרטורת החדר. חסמו את העוברים ההיברידיים והשטופים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר, עם תמיסה חוסמת של 2%-1.

החלף את התמיסה החוסמת-1 באנטידיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז בתמיסה חוסמת טרייה של 2%-1 ונער למשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את העוברים ארבע פעמים ב-MABT במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העוברים פעמיים ב-NTMT והוציאו כמה שיותר NTMT מהעוברים באמצעות פיפטה.

יש להחליף במצע אלקליין פוספטאז סגול BM ולהכתים את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שהכתם התפתח, יש להפסיק את התגובה על ידי שטיפה קצרה פעמיים עם NTMT. לאחר הכלאה באתר, שטפו את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 20 דקות.

טבלו את העוברים ב-5% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה למשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שנו את התמיסה המכסה את העוברים ל-15% סוכרוז ב-PBS ודגרו למשך הלילה למשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, לשנות את התמיסה המכסה את העוברים ל 30% סוכרוז ב PBS ולדגור במשך יום עד יומיים בארבע מעלות צלזיוס.

מעבירים את העוברים לקריאומולד חדש לרקמה וממלאים אותו בעדינות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית תוך הימנעות מהיווצרות בועות. לאחר מכן, חתכו את הדגימות למקטעים בעובי 12 עד 20 מיקרומטר באמצעות קריוסטט והעבירו במהירות את החלקים לשקופיות זכוכית. אפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורת החדר ואחסנו את המקטעים בקופסת שקופיות אטומה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן.

שטפו את השקופיות המכילות את הקטעים עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את המגלשות במאגר וחממו את התמיסה במשך כ-20 דקות כדי לשמור אותה קרובה לטמפרטורת הרתיחה. מסננים את התמיסה העודפת ומייבשים בזהירות את האזור סביב כל קטע עם חתיכת רקמה.

לאחר מכן, ציירו עיגול סביב הקטע עם עט דוחה מים כדי ליצור מחסום הידרופובי וחסמו את הקטע למשך שעתיים בתמיסה חוסמת -2 בטמפרטורת החדר. פיפטה תמיסת נוגדנים ראשונית לכל מגלשה ולדגור על המגלשות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ורוקנו את עודפי PBS.

לאחר מכן, לדגור על המגלשות עם הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב- PBS. שוב, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ונקזו את עודפי PBS. לאחר מכן, פיפטה את מדיום ההרכבה על המגלשה והרכבה עם כיסוי שקופיות.

הביטוי של קולטן 5-HT2C במערכת העצבים המרכזית זוהה בקו foxP2 egfp-caax מהונדס. הביטוי בו זמנית של 5-HT2C נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים foxP2, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. הביטוי של insm1a, גורם שעתוק אצבע אבץ בחוט השדרה ובנוירונים המוטוריים של דג הזברה, זוהה בקו המהונדס.

הביטוי הסימולטני של insm1a נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים hb9, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. דג זברה חייב להיות קבוע עם paraformaldehyde מוכן טרי.