יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית ושיטה חזקה להבחנה ביניהם לשושלת שרירי השלד. טכניקה זו מאפשרת לנו לבודד תאי גזע מזנכימליים בעלי כדאיות וחום גבוהים, עם זיהום מועט עד אפסי של תאים שמקורם באנדותל ולגרום להתמיינות מיוגנית ביעילות במחלות אלה. פיתול כבל ועקביות רירית מקשים על הטיפול בכבל.

אנו מראים כיצד לעבד את הכבל, לא לגרד את הג'לי של וורטון, ולהוציא תאי אנדותל מהאוכלוסייה. לאחר איסוף רקמת החוט בזמן הלידה, העבירו את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לצלחת שטופלה בתרבית רקמה בגודל 10 סנטימטרים רבועים, ושטפו את הרקמה ביסודיות עם PBS טרי. כדי לטפל בפיתול הכבל ובמשטח הרירי, הצמידו את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד אחת.

באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך הגישה האורכית שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובוורידים. באמצעות אזמל, הסר את כלי הדם על ידי גירודם בכיוון אחד מפני השטח ושטפו את רקמת החוט ב- PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה.

טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 סנטימטר מעוקב. מניחים את השברים עם המשטח הזוהר הפונה כלפי מטה על התבשיל ודוגרים את המנה לזמן קצר במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 20 מיליליטרים של מדיום המכיל שינוי MEM Alpha בעדינות לאורך דפנות המנה המכילה את רקמת החוט.

יש לוודא שהמתפוצצים אינם מנותקים מהאוריינטציה שלהם ולהוסיף עודף מדיום כדי להסביר שבריר שהרקמות המתפוצצות יספגו במהלך הדגירה. לאחר מכן מניחים את המנה באינקובטור במשך שלושה ימים. לאחר סיום הדגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבות וודאו שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותזוזה של המוציאים תוך כדי טיפול במנות.

לאחר שבוע, באמצעות מלקחיים סטריליים, מסירים את שברי הרקמה בנפרד ומשליכים אותם באמצעות שקיות ביו-האזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הגדילה כל ארבעה ימים עד שמושבות בודדות יגיעו למפגש של 70% לאחר צביעת התאים כמתואר בכתב היד, נתח את התאים המסומנים על ידי ציטומטריית זרימה, וקבע את אחוז התאים החיוביים CD105 CD90 ו- CD105 CD73 חיוביים.

נתח את CD105 תאים חיוביים ו- CD34 CD45 שליליים בנפרד. מצפים את צלחת תרבית הרקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם למיליליטר למינין ב-PBS ומניחים אותה על הנדנדה למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להסיר את הקולגן ולשטוף את הצלחת עם PBS, ולאחר מכן צלחת uMSCs ב 10, 000 תאים לכל סנטימטר מרובע צפיפות במדיום הצמיחה.

ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%, שואפים את מדיום הגדילה ושוטפים את צלחת התרבית פעמיים עם PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, הוסף מדיום M1 כל יומיים לתרביות ונתח uMSCs לביטוי של pax7, MyoD, מיוגנין ושרשרת כבדה של מיוזין ביומיים, ארבעה עד חמישה ימים, שישה עד שבעה ימים, ועשרה עד ארבעה עשר ימים בהתאמה. uMSCs מציגים את הביטוי של CD105 ו- CD90, ואינם מבטאים סמנים המטופוייטיים CD34 ו- CD45.

ה- uMSCs היו חיוביים גם לביטוי של סמן uMSCs CD73, מה שמצביע על כך שה- uMSCs ביטאו סמני מפתח מרובים. uMSCs הראו ביטוי של pax7 ביומיים הראשונים להוספת M1, ואחריו ביטוי MyoD בארבעת הימים הראשונים להוספת M1. תאים מבטאים חלבון מיוגנין בשישה ימים של התמיינות, ולאחר מכן ביטוי של שרשרת כבדה של מיוזין בין 10 ימים ל -14 ימים של אינדוקציה של התמיינות.

970 גנים הופעלו בתגובה לאינדוקציה של התמיינות מיוגנית בהשוואה ל-uMSCs הלא מובחנים. יותר גנים מיוגניים הוסתו ב-uMSCs שמקורם ברקמת כבל בהשוואה ל-uMSCs שמקורם בדם טבורי. הן רקמת חבל והן דם טבורי הראו ויסות של גנים הקשורים לחלבונים ציטוסקטליים, הקשורים לקשירת אקטין ולהרכבת סרקומורים, טרנספורטרים הקשורים לתפקוד התכווצות, תחזוקת מסת שריר, איתות סידן ותפקוד אנזימטי.

לאסוף את הרקמה במצב אספטי ולשמור על תרבית סטרילית. הכבל צריך להיסחף חיצונית עם 70% אתנול ומעובד מהר ככל האפשר. טיפולים רגנרטיביים רבים דורשים מספר רב של תאים ממעברים מוקדמים.

זה יכול לשמש גם כמודל כדי לחקות את כל הסביבה היבשה ולשקף את חילוף החומרים לאחר הלידה.