Name: יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד. השיטה מבטיחה שרידות גבוהה של התאים ומזעור זיהום מתאים אנדותליים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למר אוג'ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד"ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ'יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנושאים . כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.
1. בידוד של MSCs מרקמת כבל
<ol><li>בזמן הלידה, חותכים לפחות 5 ס"מ של חוט, רצוי קרוב יותר לשליה, ומעקרים את הכבל על ידי גלישת המשטח החיצוני עם 70% אתנול. העבר את פיסת רקמת החוט ברצף מצינור איסוף אחד של 50 מ"ל המכיל מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לצינור אחר המכיל את אותו הדבר. העבירו את צינור האיסוף הנושא את שם הנבדק על הקרח למעבדה תוך שעה אחת. הערה: עבור מחקר גדול יותר, ייתכן שיהיה זה שימושי לברקוד את הדגימות כדי לאפשר את המעקב אחריהן לאורך כל המחקר. חשוב לציין, יש להציע לכל אנשי הצוות המטפלים ברקמות אנושיות את המשטר המלא של החיסון נגד הפטיטיס B.</li>
	<li>במעבדה, הפעילו את ה-UV למשך 25 דקות במכסה המנוע BSL-2 כדי לעקר מכשירים אוטוקלבים ופיפטות לפני השימוש.</li>
	<li>העבר את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לתבשיל של 10 ס"משטופל בתרבית רקמה בגודל 10 ס"מ המכיל PBS מועשר ב-5 גרם/ל' גלוקוז, גנטמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (סכמטי באיור 1).</li>
	<li>באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך ציר האורך שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשל פיתול הכבל ומשטח הריריות, הצמד את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד השנייה.</li>
	<li>בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובווריד והסר את כלי הדם על ידי שימוש באזמל כדי לגרד אותם בכיוון אחד מפני השטח. יש לשטוף שוב את רקמת החוט ב-PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה. ודא שהגירוד עדין כדי לשמור על שלמות התאים ב- WJ המקיף את כלי השיט.</li>
	<li>טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 ס"מבגודל 3 והניחו את השברים כאשר המשטח הזוהר פונה כלפי מטה על המנה. דגירו את המנה לזמן קצר למשך 10 דקות בתא לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, הציפו את המנה המכילה את חלקי רקמת החוטים ב-20 מ"ל של מדיום המכיל MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו-דאוקסיריבונוקלאוזידים, 15% סרום בקר עוברי (לא מומת בחום) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ג'נטמיצין. מוסיפים את מדיום הגדילה בעדינות לאורך הצדדים כדי למנוע את ניתוק הרקמה מהכיוון שלהם. הוסיפו עודף מדיום כדי להסביר שבר שייקלט על ידי גולשי הרקמה במהלך הדגירה.</li>
	<li>לאחר 3 ימי דגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבויות. יש לוודא שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותנועתם של המוציאים תוך כדי טיפול בכלים.</li>
	<li>לאחר שבוע אחד, הסר את שברי הרקמה בנפרד באמצעות מלקחיים סטריליים והשלך באמצעות שקיות ביוהאזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הצמיחה כל 4 ימים עד שמושבות בודדות מגיעות למפגש של 70%. הערה: סביר להניח שהתאים לא יתפזרו באופן אחיד לאורך כל המנה, מכיוון שיהיו מושבות שגשוג בודדות שיש לעקוב אחריהן לצורך מפגש עם הזמן. בדרך כלל, תוך חודש, מנה של 10 ס"מ2 מייצרת מספיק תאים כדי להתפצל למנה נפרדת.</li>
	<li>קציר את התאים הדבקים באמצעות תמיסת טריפסין/EDTA (1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס [HBSS]). צנטריפוגה של תרחיף התא ב-470 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והחזירו את גלולת התא במדיום הגדילה.</li>
</ol>2. אימונופנוטיפינג והתפשטות של uMSCS
<ol><li>המשך לאימונופנוטיפ לאחר שהתאים הדבקים הגיעו למפגש של 50%-60% והם מתפשטים היטב. אל תבצע ניתוח סמני MSC על תרבויות מפגש מלאות, מכיוון שהדבר נוטה לגרום להפחתת ויסות של סמני MSC מרכזיים.</li>
	<li>לאחר טריפסיניזציה, הפיצו תרחיף תא של 1 × 106 תאים/מ"ל בצינורות FACS (1 × 105 תאים/צינור) וכתם עם נוגדנים מתאימים המקושרים לפלואורופור (כולם דילול 1:50) בשילוב: לא מוכתם; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (פלואורופור נפוץ); בקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור. רשום מספר כולל של אירועים של לפחות 10,000 על ציטומטר הזרימה לניתוח נוסף. הערה: מאחר שהתאים מנותחים עבור כל סמן פני שטח בנפרד, אין צורך בגימור על תת-קבוצות של תאים.</li>
	<li>בנוסף לסמנים לעיל, אשר את נוכחותם של סמני פני שטח חיוביים ושליליים בקווי uMSC שנוצרו מדגימות רקמת חוט בודדת (טבלה 1).</li>
	<li>נתח את התאים המסומנים לפי ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז תאי CD105+CD90+ ו-CD105+CD73+ . נתחו את תאי CD105+ ו-CD34−CD45− בנפרד.</li>
</ol>3. הבחנה של uMSCs לשרירי השלד
<ol><li>ציפו צלחות תרבית רקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS. מצפים צלחות אלה במשך 4 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>UMSCs של צלחת בצפיפות של 10,000 תאים/ס"מ2 במדיום גדילה.</li>
	<li>כאשר התאים נפגשים ב-70%, שאפו את מדיום הגדילה ושטפו את התרביות פי 2 עם PBS. הוסף את מדיום ההבחנה המיוגני (M1) המורכב מ- DMEM + 5% סרום סוסים + 0.1 μM דקסמתזון + 50 μM הידרוקורטיזון ל- uMSCs. לקביעת הקינטיקה של ההתקדמות המיוגנית, הוסיפו מדיום M1 אחת ליומיים לתרבויות.</li>
	<li>כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, נתח uMSCs עבור Pax7, MyoD, Myogenin ו- MyHC ביטוי לאחר יומיים, 4-5 ימים, 6-7 ימים ו- 10-14 ימים, בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

שלבים קריטיים שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב להגביל את הזמן בין איסוף הכבל לעיבוד הרקמה לבידוד uMSC. במקרה שיש צורך להעביר רקמות מאתר האיסוף למעבדה, יש להקפיד על תחזוקת הרקמה במאגרים המכילים אנטיביוטיקה ולאחסן אותה על קרח.
שינויים ופתר...

חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג'לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים - האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל. 
בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL 3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)5. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs6 שמקורם ברקמת כבל.
מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי6. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.

<table><tbody><tr><td>4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אנטיביוטיקה 100x נוזלית, אנדוטוקסין נבדק (10,000 U פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל ב-0.9% מי מלח רגילים)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד מיוגנין (Clone F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse אנטי-אנושי CD90 שיבוט 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II או FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך</td><td>10270106 GIBCO</td><td></td><td>ברזילאי לא להיות</td></tr><tr><td>FITC Mouse אנטי אנושי שיבוט CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD14 שיבוט M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD31 שיבוט WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD34 שיבוט 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD45 שיבוט HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD49D שיבוט 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD90 שיבוט 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי HLA-A,B,C שיבוט G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo תוכנה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו ודאוקסיריבונוקלאוזידים</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>מדיום בזאלי עבור uMSCs</td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי CD105 שיבוט 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי CD44 שיבוט 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי CD49E שיבוט llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 עכבר אנטי אנושי CD73 Clone AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH=7.4</td> תמיסת <td>טריפסין</td>/EDTA HiMedia <td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>(1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45−CD34−, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).

ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא &gt;95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34−CD45−CD105+CD90+. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34+CD45+CD105+ (~15%). בנוסף, CD105+CD90+ חיובי כפול הם פחות במספרם (~5%) (איור משלים S1). התוצאה היא רמות מופחתות של התמיינות מיוגני...

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית ושיטה חזקה להבחנה ביניהם לשושלת שרירי השלד. טכניקה זו מאפשרת לנו לבודד תאי גזע מזנכימליים בעלי כדאיות וחום גבוהים, עם זיהום מועט עד אפסי של תאים שמקורם באנדותל ולגרום להתמיינות מיוגנית ביעילות במחלות אלה. פיתול כבל ועקביות רירית מקשים על הטיפול בכבל.אנו מראים כיצד לעבד את הכבל, לא לגרד את הג'לי של וורטון, ולהוציא תאי אנדותל מהאוכלוסייה. לאחר איסוף רקמת החוט בזמן הלידה, העבירו את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לצלחת שטופלה בתרבית רקמה בגודל 10 סנטימטרים רבועים, ושטפו את הרקמה ביסודיות עם PBS טרי. כדי לטפל בפיתול הכבל ובמשטח הרירי, הצמידו את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד אחת.באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך הגישה האורכית שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובוורידים. באמצעות אזמל, הסר את כלי הדם על ידי גירודם בכיוון אחד מפני השטח ושטפו את רקמת החוט ב- PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה.טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 סנטימטר מעוקב. מניחים את השברים עם המשטח הזוהר הפונה כלפי מטה על התבשיל ודוגרים את המנה לזמן קצר במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 20 מיליליטרים של מדיום המכיל שינוי MEM Alpha בעדינות לאורך דפנות המנה המכילה את רקמת החוט.יש לוודא שהמתפוצצים אינם מנותקים מהאוריינטציה שלהם ולהוסיף עודף מדיום כדי להסביר שבריר שהרקמות המתפוצצות יספגו במהלך הדגירה. לאחר מכן מניחים את המנה באינקובטור במשך שלושה ימים. לאחר סיום הדגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבות וודאו שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותזוזה של המוציאים תוך כדי טיפול במנות.לאחר שבוע, באמצעות מלקחיים סטריליים, מסירים את שברי הרקמה בנפרד ומשליכים אותם באמצעות שקיות ביו-האזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הגדילה כל ארבעה ימים עד שמושבות בודדות יגיעו למפגש של 70% לאחר צביעת התאים כמתואר בכתב היד, נתח את התאים המסומנים על ידי ציטומטריית זרימה, וקבע את אחוז התאים החיוביים CD105 CD90 ו- CD105 CD73 חיוביים.נתח את CD105 תאים חיוביים ו- CD34 CD45 שליליים בנפרד. מצפים את צלחת תרבית הרקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם למיליליטר למינין ב-PBS ומניחים אותה על הנדנדה למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להסיר את הקולגן ולשטוף את הצלחת עם PBS, ולאחר מכן צלחת uMSCs ב 10, 000 תאים לכל סנטימטר מרובע צפיפות במדיום הצמיחה.ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%, שואפים את מדיום הגדילה ושוטפים את צלחת התרבית פעמיים עם PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, הוסף מדיום M1 כל יומיים לתרביות ונתח uMSCs לביטוי של pax7, MyoD, מיוגנין ושרשרת כבדה של מיוזין ביומיים, ארבעה עד חמישה ימים, שישה עד שבעה ימים, ועשרה עד ארבעה עשר ימים בהתאמה. uMSCs מציגים את הביטוי של CD105 ו- CD90, ואינם מבטאים סמנים המטופוייטיים CD34 ו- CD45.ה- uMSCs היו חיוביים גם לביטוי של סמן uMSCs CD73, מה שמצביע על כך שה- uMSCs ביטאו סמני מפתח מרובים. uMSCs הראו ביטוי של pax7 ביומיים הראשונים להוספת M1, ואחריו ביטוי MyoD בארבעת הימים הראשונים להוספת M1. תאים מבטאים חלבון מיוגנין בשישה ימים של התמיינות, ולאחר מכן ביטוי של שרשרת כבדה של מיוזין בין 10 ימים ל -14 ימים של אינדוקציה של התמיינות.970 גנים הופעלו בתגובה לאינדוקציה של התמיינות מיוגנית בהשוואה ל-uMSCs הלא מובחנים. יותר גנים מיוגניים הוסתו ב-uMSCs שמקורם ברקמת כבל בהשוואה ל-uMSCs שמקורם בדם טבורי. הן רקמת חבל והן דם טבורי הראו ויסות של גנים הקשורים לחלבונים ציטוסקטליים, הקשורים לקשירת אקטין ולהרכבת סרקומורים, טרנספורטרים הקשורים לתפקוד התכווצות, תחזוקת מסת שריר, איתות סידן ותפקוד אנזימטי.לאסוף את הרקמה במצב אספטי ולשמור על תרבית סטרילית. הכבל צריך להיסחף חיצונית עם 70% אתנול ומעובד מהר ככל האפשר. טיפולים רגנרטיביים רבים דורשים מספר רב של תאים ממעברים מוקדמים.זה יכול לשמש גם כמודל כדי לחקות את כל הסביבה היבשה ולשקף את חילוף החומרים לאחר הלידה.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

בידוד גזע בוגרים תאים ברקמות הרכות השלד מבוסס על מהירות הדבקות של התא בקבוק.

בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

כאן, אנו מציעים פרוטוקול לבידול chondrogenic מ דם טבורי mononuclear תאים נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

חבל הטבור אנושי (UC) ניתן להשיג במהלך תקופת הלידה כתוצאה מונח לידה מוקדמת, ולאחר postterm משלוח. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-derived בתאי גזע mesenchymal (UC-MSCs) מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

בידוד ואפיון של האדם נגזר הטבור בתאי גזע Mesenchymal של לידה מוקדמת ותינוקות המונח

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

למד פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד. השיטה מבטיחה שרידות גבוהה של התאים ומזעור זיהום מתאים אנדותליים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

גלה סרטונים נוספים