Name: ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: למד ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל לחקר אינטראקציות DNA וליגנדים בביופיזיקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של מבנים ביומולקולריים ומכניקת פרישה מכנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודת מחקר זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע [CBET-1904921] והמכונים הלאומיים לבריאות [NIH R01CA236350] ל- H. M.

הערה: כל המאגרים והריאגנטים הכימיים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בחומרי הטבלה.
1. הכנת מיקרוסקופ כוח הגזירה
הערה: מיקרוסקופ כוח הגזירה מכיל שני חלקים, יחידת תגובה (הומוגנייזר) ויחידת גילוי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי). ההגדלה של העינית היא 10x, וההגדלה של העדשה האובייקטיבית (אוויר) היא 4x.
<ol><li>להרכיב את homogenizer ואת המיקרוסקופ על שולחן הרכבה. הרכיבו משקפי מגן והפעילו את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן אור העירור באורך גל מתאים (כאן נעשה שימוש ב-488 ננומטר) עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר.</li>
	<li>הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו 5 ס"מ ו-1.5 ס"מ 2X1.5 ס"מבחתך רוחב. כדי להקטין את הרקע, ודא שהחומר התא שנבחר אינו פלואורסצנטי, כגון משקפיים (לחלק מהפלסטיקים יש פלואורסצנציה).</li>
	<li>בחרו קצה פיזור הומוגנייזר מתאים שיכול לספק את כוח הגזירה הרצוי. הערה: קצב הגזירה תלוי במרחק בין הרוטור לסטטור במהירות סיבוב קבועה11 על פי המשוואה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;"> כאשר μ היא הצמיגות הדינמית של המים ב-20 מעלות צלזיוס; D הוא הקוטר הפנימי של הסטטור; d הוא הקוטר החיצוני של הרוטור, ו-V הוא מהירות הגזירה (סל"ד/שנייה).</li>
	<li>הדקו את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר (איור 1). ודא שקצה הפיזור נמצא מעט מעל (~ 1 מ"מ) המשטח התחתון של תא התגובה.</li>
	<li>התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן, התאימו את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הגילוי (שדה הראייה) מוגדר בין הרוטור לסטטור (איור 1).</li>
	<li>הפעל את תעלות הפלואורסצנציה בהתאם לצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי.</li>
	<li>לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמש במים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי לבדוק את הגזירה במהירות גזירה נמוכה (למשל, 2,000 סל"ד) כדי להבטיח שקצה הפיזור יכול לעבוד כראוי מבלי לגעת בתא התגובה.</li>
</ol>2. פתיחת i-מוטיבים עם ובלי ליגנדות
<ol><li>הכן דנ"א i-motif טלומרי אנושי (טבלת חומרים) המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו, בהתאמה, במי DI, כמתואר ב- Hu et al.11. הערה: i-מוטיב המכיל רצף: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>לדלל את הדנ"א ל-5 מיקרומטר במאגר MES של 30 mM ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H2-4OTD, שסונתז על פי אברהם פונוז ואחרים, בטווח ריכוזים של 0-60 מיקרומטר. ערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור.</li>
	<li>בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI. יש להפחית את ערך הפלואורסצנציה ברקע בניתוחי הנתונים מאוחר יותר. הערה: יש להימנע מאור תועה משלב זה ואילך.</li>
	<li>הגדר את הפרמטרים של מצלמת CCD באמצעות התוכנה. הפרמטרים המומלצים הם כדלקמן: זמן חשיפה = 0.5 שניות, רגישות CCD = 1600, וזמן הקלטה = 20 דקות.</li>
	<li>באמצעות פיפט ארוך, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי. מכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן, הפעל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9,724 s−1 ל- 97,245 s−1 (נבחר באמצעות התוכנה המשויכת להומוגנייזר) למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.</li>
	<li>לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.</li>
</ol>3. תגובת קליק המופעלת בכוח גזירה
<ol><li>הכינו דנ"א i-motif במי DI. דגירה של 10 μM i-motif DNA ב-300 μL של 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת 150 μM CuCl וחומצה אסקורבית של 300 μM למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif (כל הריכוזים הם הריכוזים הסופיים בתמיסה). הערה: CuCl הוא הזרז של תגובת הלחיצה. חומצה אסקורבית תמנע חמצון נחושת (I).</li>
	<li>אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14,300 x גרם. לחדש את התמיסה ל~500 μL עם 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית 300 μM לאחר כל סינון.</li>
	<li>חזור על הסינון 3x.</li>
	<li>אסוף את התמיסה השיורית וצור נפח סופי של 300 μL על ידי הוספת 30 mM Tris (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית של 300 μM יחד עם 20 μM Calfluor 488 אזיד, 20 μM HPG ו- 10 μM TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את התמיסה לחדר החושך. הערה: יש להימנע מאור לאחר שלב זה.</li>
	<li>בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI.</li>
	<li>הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63,209 s−1 למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת.</li>
	<li>לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר חקירה בזמן אמת של התגלגלות מערך של מבנים ביומולקולריים על ידי כוח גזירה. התוצאות המוצגות כאן מדגישות כי מבנים של מוטיב דנ"א ניתנים לפתיחה על ידי כוח גזירה. התגלגלותו של מוטיב ה-i הקשור לליגנד ותגובות הקליק המופעלות בכוח הגזירה היו יישומים של הוכחת היתכנות עבור שיטת ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל זו.
איור 1 מציג את מערך המכשירים. קצה מחולל ההומוגנייזר ותא התגובה אינם חייבים לבוא במגע זה עם זה, וזה קריטי כדי לאפשר זרימת גזירה יציבה בין הר...

בספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת1 (SMFS), התכונות המכניות של מבנים מולקולריים בודדים נחקרו על ידי מכשירים מתוחכמים כגון מיקרוסקופ הכוח האטומי, פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית 2,3,4. מוגבל על ידי אותה דרישת כיווניות של המולקולות במערך יצירת הכוח / גילוי או שדה הראייה הקטן בפינצטה מגנטית ובמיקרוסקופ כוח צנטריפוגה זעיר (MCF)5,6,7,8, רק מספר מוגבל של מולקולות ניתן לחקור בו זמנית באמצעות SMFS. התפוקה הנמוכה של SMFS מונעת את היישום הרחב שלה בתחום הזיהוי המולקולרי, הדורש מעורבות של קבוצה גדולה של מולקולות.
זרימת גזירה מספקת פתרון פוטנציאלי להפעלת כוחות על קבוצה מסיבית של מולקולות9. בזרימה נוזלית בתוך ערוץ, ככל שפני התעלה קרובים יותר לפני הערוץ, כך קצב הזרימהאיטי יותר 10. שיפוע מהירות זרימה כזה גורם ללחץ גזירה המקביל למשטח הגבול. כאשר מולקולה ממוקמת בזרימת גזירה זו, המולקולה מכוונת את עצמה מחדש כך שהציר הארוך שלה מתיישר עם כיוון הזרימה, כאשר כוח הגזירה מופעל על ציר11 הארוך. כתוצאה משינוי כיוון זה, כל המולקולות מאותו סוג (גודל ואורך הידיות) צפויות להתיישר באותו כיוון תוך שהן חוות את אותו כוח גזירה.
עבודה זו מתארת פרוטוקול לשימוש בזרימת גזירה כזו כדי להפעיל כוח גזירה על קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים, כפי שמודגם על ידי מוטיב ה- i של הדנ"א. בפרוטוקול זה נוצרת זרימת גזירה בין הרוטור לסטטור בקצה הומוגנייזר. המחקר הנוכחי מצא כי מבנה הדנ"א המקופל i-motif יכול להיפתח על ידי קצבי גזירה של 9724-97245 s−1. חוץ מזה, נמצא קבוע דיסוציאציה של 36 μM בין ליגנד L2H2-4OTD לבין מוטיב i. ערך זה עולה בקנה אחד עם זה של 31 μM שנמדד על ידי מבחן הסטת הג'ל12. יתר על כן, הטכניקה הנוכחית משמשת כדי לפתוח את מוטיב i, אשר יכול לחשוף את נחושת chelated (I) כדי לזרז תגובת קליק. פרוטוקול זה מאפשר אפוא לפתוח קבוצה גדולה של מבני i-motif עם מכשירים בעלות נמוכה בזמן סביר (קצר מ -30 דקות). בהתחשב בכך שטכניקת כוח הגזירה מגדילה באופן דרסטי את התפוקה של ספקטרוסקופיית הכוח, אנו מכנים טכניקה זו ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS). פרוטוקול זה נועד לספק הנחיות ניסיוניות כדי להקל על היישום של EFS מבוסס כוח גזירה זה.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 אזיד</td><td>קליק כימיה כלים</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACRO270525000 קצה פיזור</td><td>שוויץ</td><td>PT-DA07 / 2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבע</td><td>IDT</td> / <td>5Cy5 /</td><td></td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Janpan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>שוויץ</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>cs-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Quencher</td><td>IDT</td> <td>/ 3IAbRQSp /</td><td></td></tr> <tr><td>TBTA</td><td>טוקיו תעשייה כימית</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

טכניקות של מולקולה בודדת המבוססות על עקרונות פלואורסצנטיים ומכנוכימיים מספקות רגישות מעולה בחישה ביולוגית. עם זאת, בשל היעדר יכולות תפוקה גבוהות, היישום של טכניקות אלה מוגבל בביופיזיקה. ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים על ידי המרת מחקרים מכניכימיים של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים. בפרוטוקול זה, המבנים המשניים של הדנ"א (i-motifs) נפרשו בזרימת הגזירה בין הרוטור לסטטור של קצה הומוגנייזר בקצבי גזירה של עד 77796/s. הודגמו ההשפעות של קצבי הזרימה והגדלים המולקולריים על כוחות הגזירה שחווה ה-i-motif. טכניקת EFS חשפה גם את הזיקה המחייבת בין מוטיבים של דנ"א לליגנדים. יתר על כן, הדגמנו תגובת כימיה של קליקים שיכולה להיות מופעלת על ידי כוח גזירה (כלומר, כימיה של מכניקה-קליק). תוצאות אלה מבססות את היעילות של שימוש בכוח גזירה כדי לשלוט על הקונפורמציה של מבנים מולקולריים.

איור 1 מתאר את ההתגלגלות המכנית והחישה בזמן אמת של מולקולות אנסמבל ב-EFS. באיור 1B, עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה כאשר קצב הגזירה נע בין 9,724 s−1 ל-97,245 s−1 במאגר pH 5.5 MES. כבקרה, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i הוזז בקצב של 63,209 s−1 במאגר pH 7.4 MES. הסיבה לכך היא שמיטיב ה-i אינו מתקפל ב-pH 7.414. בעבודה הקודמת מצאנו שככל שקצב הגזירה גבוה יות...

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

פרוטוקול זה מספק טכניקת תפוקה גבוהה לחקר הקשירה הבין-מולקולרית בין דנ"א לליגנדים. טכניקה זו הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים ביומולקולריים. הוא עושה זאת על ידי המרת התכונות הכימיות המכניות של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים.אני חושב שזה ניסוי מאוד צעד קדימה אבל יש כמה צעדים קריטיים. לדוגמה, יישור של מיקרוסקופ, הומוגנייזר, ואת צינור התגובה. שלושת הדברים האלה צריכים להיות מיושרים בצורה מושלמת על מנת לעקוב במדויק אחר השינוי בפלואורסצנציה.מתחילים בהרכבת ההומוגנייזר והמיקרוסקופ על שולחן הרכבה. לאחר הרכבת משקפי מגן, הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן כוונן את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן האור העירור עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר. לאחר מכן הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו חמישה סנטימטרים ו-1.5 על 1.5 סנטימטרים רבועים בחתך רוחב, כדי להבטיח שחומר התא שנבחר לא יפחית את הרקע.לאחר מכן, מהדקים את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן מתאימים את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר, כדי להבטיח שהקצה יהיה מעט מעל המשטח התחתון של תא התגובה. לאחר מכן, התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן התאם את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור למצב.הפעל את ערוצי הפלואורסצנט, על פי הצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי. לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמשו במים שעברו דה-יוניזציה כדי לבחון את הגזירה במהירות גזירה נמוכה. ראשית, הכינו דנ"א טלומרי אנושי בעל מוטיב המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו בהתאמה במים שעברו דה-יוניזציה כפי שמתואר בכתב היד.לאחר מכן, דללו את הדנ"א לחמישה מיקרומולרים במאגר MES של 30 מילימולאר ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H24OTD"בטווח ריכוזים של אפס עד 60 מיקרומולר וערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור. בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה.לאחר מכן הגדר את הפרמטרים של מצלמת ה- CCD באמצעות התוכנה עם זמן חשיפה של 0.5 שניות, רגישות CCD של 1, 600 וזמן הקלטה השווה ל -20 דקות. באמצעות פיפטה ארוכה, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי ומכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן התחל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9, 724 לשנייה ל -97, 245 לשנייה למשך 20 דקות, כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה. הכן דנ"א i-motif ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, דגרו 10 דנ"א מיקרומולרי i-motif ו-300 מיקרוליטרים של 30 מילימולאר טריס בופר בתוספת 150 מיקרומולאר קופריק כלוריד ו-300 מיקרומולאר חומצה אסקורבית למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif.הבא אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14, 300 פעמים G.לחדש את התמיסה לכ 500 microliters עם 30 מילימולר tris buffers בתוספת 300 micromolar חומצה אסקורבית לאחר כל סינון. לאחר איסוף התמיסה השיורית, צור נפח סופי של 300 מיקרוליטר על ידי הוספת 30 מיקרומולאר טריס בתוספת 300 מיקרומולר חומצה אסקורבית יחד עם 20 מיקרומולאר CalFluor 488 אזיד, 20 מיקרומולאר HPG ו-10 מיקרומולאר TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את הפתרון לחדר החושך.לאחר מכן בדקו ומזערו את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת. לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה.עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה עם הקצב העצום שנע בין 9, 724 לשנייה ל-97, 245 לשנייה במאגר pH 5.5 MES. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i נגזל בקצב של 63, 209 לשנייה, מכיוון שהוא אינו מתקפל ב- pH 7.4 במאגר MES. הליגנד נקשר למולקולות ה-i-motif של הדנ"א הנתון לזרימה העצומה הוערך אשר הראה כי תוספת עוצמת הפלואורסצנטיות נעשתה פחות ברורה עם העלייה בריכוז הליגנד.קבוע הדיסוציאציה נקבע עבור האינטראקציה בין הליגנד לבין מוטיב ה-i ונמצא כ-34 מיקרומולים. מוטיב הנחושת של כלאט אחד נפרש בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה, והנחושת ששוחררה עוררה את תגובת הקליק הפלואורגנית, וכתוצאה מכך עוצמת הפלואורסצנטיות גדלה עם הזמן. ראשית, ודא כי אזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור לבין stater.שנית, בדקו ומזערו את הרקע הפלואורסצנטי. ולבסוף, הקפד לסנן את התגובה לפני שתבצע תגובת לחיצה. שיטה זו פותחת שער לחקור את החוזק המכני, לקפל ולפתוח את כל סוגי הפולימרים.זה יכול להיות מבנים אחרים של דנ"א, חלבונים או פולימרים אחרים, והאינטראקציה שלהם עם סוגים אחרים של מולקולות. כאמור, ניתן לחקור מספר מקרומולקולות אחרות באמצעות גישה זו.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדוד את הכח של אינטראקציות בין משטח אורגני מוגדר היטב או פפטידים או חומצות אמינו על ידי מדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). המידע המתקבל מהמדידה חשוב להבין טוב יותר את שלבי חומר פפטיד-אורגנית.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

למד ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל לחקר אינטראקציות DNA וליגנדים בביופיזיקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של מבנים ביומולקולריים ומכניקת פרישה מכנית.

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

גלה סרטונים נוספים