ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה
26 ביולי 2022
ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.
פרוטוקול זה מספק טכניקת תפוקה גבוהה לחקר הקשירה הבין-מולקולרית בין דנ"א לליגנדים. טכניקה זו הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים ביומולקולריים. הוא עושה זאת על ידי המרת התכונות הכימיות המכניות של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים.
אני חושב שזה ניסוי מאוד צעד קדימה אבל יש כמה צעדים קריטיים. לדוגמה, יישור של מיקרוסקופ, הומוגנייזר, ואת צינור התגובה. שלושת הדברים האלה צריכים להיות מיושרים בצורה מושלמת על מנת לעקוב במדויק אחר השינוי בפלואורסצנציה.
מתחילים בהרכבת ההומוגנייזר והמיקרוסקופ על שולחן הרכבה. לאחר הרכבת משקפי מגן, הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן כוונן את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן האור העירור עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר. לאחר מכן הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו חמישה סנטימטרים ו-1.5 על 1.5 סנטימטרים רבועים בחתך רוחב, כדי להבטיח שחומר התא שנבחר לא יפחית את הרקע.
לאחר מכן, מהדקים את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן מתאימים את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר, כדי להבטיח שהקצה יהיה מעט מעל המשטח התחתון של תא התגובה. לאחר מכן, התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן התאם את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור למצב.
הפעל את ערוצי הפלואורסצנט, על פי הצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי. לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמשו במים שעברו דה-יוניזציה כדי לבחון את הגזירה במהירות גזירה נמוכה. ראשית, הכינו דנ"א טלומרי אנושי בעל מוטיב המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו בהתאמה במים שעברו דה-יוניזציה כפי שמתואר בכתב היד.
לאחר מכן, דללו את הדנ"א לחמישה מיקרומולרים במאגר MES של 30 מילימולאר ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H24OTD"בטווח ריכוזים של אפס עד 60 מיקרומולר וערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור. בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה.
לאחר מכן הגדר את הפרמטרים של מצלמת ה- CCD באמצעות התוכנה עם זמן חשיפה של 0.5 שניות, רגישות CCD של 1, 600 וזמן הקלטה השווה ל -20 דקות. באמצעות פיפטה ארוכה, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי ומכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן התחל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9, 724 לשנייה ל -97, 245 לשנייה למשך 20 דקות, כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.
לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה. הכן דנ"א i-motif ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, דגרו 10 דנ"א מיקרומולרי i-motif ו-300 מיקרוליטרים של 30 מילימולאר טריס בופר בתוספת 150 מיקרומולאר קופריק כלוריד ו-300 מיקרומולאר חומצה אסקורבית למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif.
הבא אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14, 300 פעמים G.לחדש את התמיסה לכ 500 microliters עם 30 מילימולר tris buffers בתוספת 300 micromolar חומצה אסקורבית לאחר כל סינון. לאחר איסוף התמיסה השיורית, צור נפח סופי של 300 מיקרוליטר על ידי הוספת 30 מיקרומולאר טריס בתוספת 300 מיקרומולר חומצה אסקורבית יחד עם 20 מיקרומולאר CalFluor 488 אזיד, 20 מיקרומולאר HPG ו-10 מיקרומולאר TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את הפתרון לחדר החושך.
לאחר מכן בדקו ומזערו את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת. לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה.
עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה עם הקצב העצום שנע בין 9, 724 לשנייה ל-97, 245 לשנייה במאגר pH 5.5 MES. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i נגזל בקצב של 63, 209 לשנייה, מכיוון שהוא אינו מתקפל ב- pH 7.4 במאגר MES. הליגנד נקשר למולקולות ה-i-motif של הדנ"א הנתון לזרימה העצומה הוערך אשר הראה כי תוספת עוצמת הפלואורסצנטיות נעשתה פחות ברורה עם העלייה בריכוז הליגנד.
קבוע הדיסוציאציה נקבע עבור האינטראקציה בין הליגנד לבין מוטיב ה-i ונמצא כ-34 מיקרומולים. מוטיב הנחושת של כלאט אחד נפרש בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה, והנחושת ששוחררה עוררה את תגובת הקליק הפלואורגנית, וכתוצאה מכך עוצמת הפלואורסצנטיות גדלה עם הזמן. ראשית, ודא כי אזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור לבין stater.
שנית, בדקו ומזערו את הרקע הפלואורסצנטי. ולבסוף, הקפד לסנן את התגובה לפני שתבצע תגובת לחיצה. שיטה זו פותחת שער לחקור את החוזק המכני, לקפל ולפתוח את כל סוגי הפולימרים.
זה יכול להיות מבנים אחרים של דנ"א, חלבונים או פולימרים אחרים, והאינטראקציה שלהם עם סוגים אחרים של מולקולות. כאמור, ניתן לחקור מספר מקרומולקולות אחרות באמצעות גישה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ספקטרוסקופיית כוח של מקבץ (EFS) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת לחקור קישור בין-מולקולרי בין DNA לליגנדים. היא מאפשרת פריסה מכנית וחישוש בזמן אמת של מבנים ביו-מולקולריים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביופיזיקה
- חיוש ביולוגי
- אינטראקציות ביו-מולקולריות
רקע
- שיטת EFS ממירה תכונות כימיות-מכניות של מולקולות בודדות לאלו של מקבצים מולקולריים.
- טכניקה זו הראתה תפוקה גבוהה בחקירת קבוצות גדולות של מבנים ביו-מולקולריים.
- כיול מדויק של הציוד הוא קריטי להצלחת הניסויים.
- מעקב פלואורסצנציה הוא חיוני לניטור שינויים במהלך המחקר.
מטרת המחקר
- לבחינת אינטראקציות הקישור בין DNA לליגנדים שונים.
- לשיפור ההבנה של מבנים ביו-מולקולריים באמצעות פריסה מכנית.
- לספק שיטה חזקה לחשיפה בזמן אמת במחקרים ביו-פיזיקליים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- טכניקת EFS בעלת תפוקה גבוהה.
- יישור של המיקרוסקופ, ההומוגניזטור ומבחנת התגובה.
- מעקב פלואורסצנציה לניטור אינטראקציות קישור.
- חישוש בזמן אמת של מבנים ביו-מולקולריים.
תוצאות עיקריות
- הדגמה מוצלחת של תפוקה גבוהה (high throughput) בחקר אינטראקציות ביו-מולקולריות.
- מעקב יעיל אחר שינויים בפלואורסצנציה במהלך הניסויים.
- תיקוף של חשיבות היישור להשגת תוצאות מדויקות.
- תובנות לגבי התכונות המכניות של אינטראקציות בין DNA לליגנדים.
מסקנות
- EFS מהווה התקדמות משמעותית בחקר מבנים ביומולקולריים.
- יישור נכון של הציוד הוא קריטי להצלחת הניסוי.
- טכניקה זו פותחת נתיבים חדשים למחקר בביופיזיקה ובחשישן ביולוגי (biosensing).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספקטרוסקופיית כוח של מאסם (EFS) באמצעות כוחות גזירה מאפשרת חקירה כמותית ובספיקת-על של שינויים קונפורמציוניים בביומולקולות וקישור ליגנדים תחת מאמץ מכני. גישה זו פותרת את פער הסקליביליות במחקרים מכנו-כימיים של מולקולה בודדת, ותומכת בתיקוף יעדים חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. EFS מספקת תובנות מעשיות למיון פורטפוליו על ידי חשיפת יציבות מולקולרית, זיקת קישור וקינטיקה של תגובה במערכות ביומולקולריות מגוונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה בקיבולת גבוהה של קיפול מולקולרי, פריסה וקישור ליגנדים תחת כוחות גזירה רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות היציבות ועוצמת האינטראקציה של מטרות וליגנדים מועמדים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזויי בבחירת המטרה על ידי אספקת נתונים ברמת האנסמבל על דינמיקה קונפורמציונית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות וניתנות לשחזור עבור תהליכי סינון (screening) המשכיים, וזאת באמצעות סטנדרטיזציה של הפרעות מכניות ומדדי פלואורסצנציה.
- מספק פלטים כמותיים וניתנים להרחבה (scalable), המתאימים לניתוח השוואתי של השפעות תרכובות על קונפורמציה מולקולרית וקישור.
- מאפשר הערכה מהימנה של זיקת ליגנדים ותגובה מכנו-כימית, ובכך תומך באופטימיזציה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק תובנות מכניסטיות לגבי יציבות ביו-מולקולרית ואינטראקציות של ליגנדים הרלוונטיות למודלים של מחלות ולפיתוח תרופתי.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים קוונטיביים של אנסמבל.
- מעניק ערך של הפחתת סיכונים חיזויית עבור מולקולות מועמדות, על ידי חשיפת הרגישות למאמץ מכני ולמודיפיקציה כימית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
EFS משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים דרך זיהוי מובילים (lead identification) והערכה פרה-קלינית, ובכך מאפשר קבלת החלטות מבוססת נתונים בנקודות מפנה מרכזיות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת שינויים במבנה מולקולרי ובקישור המונעים מהשערה תחת כוחות גזירה מבוקרים.
- סריקה: מספקת מדידות פלואורסצנציה הניתנות לשחזור ובסביבה של תפוקה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של השפעות ליגנדים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות כגון עוצמת פלואורסצנציה וקבועי דיסוציאציה לתמיכה בהשוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר טרנסלציונלי: מתאימה ממצאים מכנו-כימיים להתנהגויות מולקולריות הרלוונטיות למחלה כאשר הדבר נתמך על ידי מערכות מודל.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה לחקר ביו-מולקולות ואינטראקציות מגוונות לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בהערכת מטרה וליגנד.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות מכנו-כימיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת הרחבה (scalable) לאימוץ בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתוני אנסמבל חסונים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מועמדים המותאמים לסיכון, בהתבסס על תובנות מכניסטיות כמותיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בהקמת מערך לבדיקה מכנו-כימית ובניתוח נתונים כמותי.
- דורש כיול מדויק של ההומוגנייזר, המיקרוסקופ ותא התגובה למעקב פלואורסצנטי מדויק.
- נחוצים מכשור סטנדרטי ותשתית אנליטית להבטחת שחזוריות בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למערכות ביו-מולקולריות שונות, כולל DNA, חלבונים ופולימרים, באמצעות התאמות מתאימות בפרוטוקול.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לפלואורסצנציית רקע וצורך בהכנת דגימות קפדנית ובניקוי יסודי של התא.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Preparation of the Shear Force Microscope
2:11
Unfolding I-Motifs with and without Ligands
3:47
Shear Force-Actuated Click Reaction
5:29
Results: Real-Time Investigation of the Unfolding of an Ensemble Set of Biomolecular Structures by Shear Force
6:39
Conclusion
