העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה וחסכונית להעברה ללא אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית על תאי הזנה. היתרון של פרוטוקול זה הוא בכך שהוא אינו דורש מדיה ומצעי גדילה יקרים ללא הזנה, מונע את הסיכון לדיסוציאציה מלאה על ידי אנזימים, ומקטין את הסיכון למעבר תאי גזע למצב ראשוני. מי שידגים את ההליך יהיה הגה ברינקר פיירדינגסטאד, המנהל היומי של מתקן הליבה הנורבגי לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

כדי להתחיל זרע 0.5 על 10 מועלה לעוצמה 6 פיברובלסטים אנושיים, המכונים להלן תאי הזנה, בבקבוק תרבית T 75 עם 20 מיליליטר של IMDM המכיל 10% FBS, להלן תווך תא הזנה. כאשר תאי ההזנה הגיעו למפגש של 90%, הסר את המדיום ושטוף את התאים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של DPBS כדי למנוע עיכוב של טריפסין על ידי גורמים בתווך. מוסיפים שני מיליליטר טריפסין EDTA לבקבוק ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך כחמש דקות, תוך התבוננות בניתוק תאי ההזנה בעין בלתי.

לאחר תחילת הניתוק, המשיכו לצפות בדיסוציאציה של התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שכל הצברים מנותקים לתאים בודדים. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של תווך תא הזנה טרי שחומם מראש לבקבוק כדי להשבית את טריפסין-EDTA ולהשהות בעדינות את תאי ההזנה על ידי פיפט. העבירו את מתלה התא לצינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן סגרו את הצינור והצנטריפוגה ב-200 גרם למשך 5 דקות.

בזהירות להסיר את הסאטה מבלי להפריע את הגלולה ולהשעות אותו מחדש ארבעה מיליליטר של תא מזין טרי בינוני. לאחר שווידאתם שתאי ההזנה מושהים מחדש באופן יסודי, ספרו אותם באמצעות תא ספירת תאים וחשבו את מספר התאים הדרושים לתרבית HSCs ו-HI PSCs על צלחות תרבית רקמה של 35 מילימטר. לאחר מכן כדי לבצע מעצר מיטוטי על ידי קרינת גמא, להעביר את המספר המתאים של תאים מזינים לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהוסיף תווך תא מזין לנפח כולל של חמישה מיליליטר.

יש להעביר מיד בטמפרטורת החדר למכונת הקרנת גמא ולהקרין כדי לעצור את התאים באופן מיטוטי. לאחר שתאי ההזנה נעצרים באופן מיטוטי מתחת למכסה המנוע של תרבית רקמה, השהה מחדש את התאים בתווך תא ההזנה כדי לקבל ריכוז תאים של 1.5 על 10 המועלה להספק של 5 למיליליטר. מוסיפים 2 מיליליטר של תרחיף תא ההזנה לצלחת 35 מ"מ ומעבירים את המנה ל 37 מעלות צלזיוס ואינקובטור פחמן דו חמצני 5%.

לפיזור אחיד של תאים, הניעו את המנה לאט אך בחוזקה על מדף האינקובטור קדימה ואחורה. לאחר מכן עצרו ובצעו את אותה פעולה משמאל לימין לפני סגירת דלת האינקובטור. לאחר 24 שעות, החלף את התווך של תא ההזנה ב-IMDM המכיל 10% החלפת סרום.

מצלחת התרבית המכילה תאי הזנה שנעצרו מיטוטית, החליפו את IMDM המכיל 10% מדיום החלפת סרום ב-1.2 מיליליטר של מדיום HESC שחומם מראש המכיל גורם גדילה בסיסי של סיבים או BFGF, 30 דקות לפני העברת מושבות. לאחר מכן, הסר את המדיום מצלחת תרבית המכילה HSCs או HI PSCs ושטוף את המושבות עם מיליליטר אחד של DPBS, כדי להסיר תאים לא מחוברים ופסולת תאים. מוסיפים מיליליטר אחד של 0.5 מילימולר EDTA ודגרים במשך דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, החלף את תמיסת EDTA במיליליטר אחד של מדיום HESC המכיל BFGF. טרטורים בעדינות עם אותה פיפטה כדי לשחרר את המושבות משכבת תא ההזנה עד שהשכבה משתחררת ומתקפלת על עצמה בגוש נפרד. דוחפים היטב את שכבת תא ההזנה לקצה התרבית בעזרת קצה פיפטה.

באמצעות פיפטה חדשה של מיליליטר אחד, מעבירים את המושבות המרחפות לצלחת תרבית חדשה עם תאי הזנה ומדיום HESC המכיל BFGF, המתפצלים ביחס של אחד עד חמישה. מעבירים את המנה לאינקובטור ומעבירים אותה בעדינות מצד לצד כדי להקל על חלוקה שווה של מושבות. מושבות HESC שנקטפו באמצעות EDTA היו הומוגניות יותר בגודל ובצורה מאלה שנקטפו באופן מכני.

צפיפות התאים במושבות שנקטפו וצופו מחדש הייתה דומה לקציר מבוסס EDTA ולקציר מכני. למושבות שנקטפו באופן מכני הייתה נטייה גדולה יותר לפתח נמק באזורים המרכזיים שלהן, בעוד שהמושבות שנקטפו באמצעות EDTA הציגו מראה שקוף עם קצוות ברורים. ניתוח QPCR הראה ביטוי יציב של סמן גזע ב- mRNA עבור המושבות שהתקבלו לאחר 20 מעברים באמצעות קציר מכני או מבוסס EDTA.

תצפיות דומות נעשו עם צביעה אימונוכימית ברמות חלבון עבור המושבות שהתקבלו לאחר 20 מעברים באמצעות קציר מכני או מבוסס EDTA. גופים עובריים שנוצרו מה-HSCs שהתקבלו לאחר 20 מעברים בשתי השיטות הכילו תערובת של תאים המבטאים סמנים מקובלים עבור האקטודרם, המזודרם והאנדודרם. יתר על כן, ניתוח גנטי מבוסס QPCR של סטיות גנומיות נפוצות הראה סטייה צנועה מדפוס כרומוזומלי דיפלואידי ייחוס.

חשוב להגביל את החשיפה ל-EDTA לדקה אחת. חשיפה ארוכה יותר עלולה להוביל לדיסוציאציה רבה מדי. חשוב גם למשוך היטב את שכבת תאי ההזנה הצידה כדי שזה לא יפריע בעת העברת תאי גזע עובריים אנושיים או תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לצלחת תרבית חדשה.

המעבר לתרבית ולתנאים נטולי מזון שבהם EDTA משמש בדרך כלל לפתוגן הוא פשוט ואין לנו שינוי באופן הטיפול בתאים.