Name: הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: למדו לזהות מוטנטים בנתיב הפוטורספירציה בצמחים באמצעות סקרינינג CO2 נמוך וניתוח פלואורסצנציית כלורופיל. שיטה זו מאפשרת סקרינינג בקיבולת גבוהה לזיהוי יעילות פוטוסינתטית מופחתת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מועצת המנהלים של לואיזיאנה (AWD-AM210544).

1. הכנת זרעים ועיקור
הערה: הכנת זרעים מורכבת מהטבעת זרעים ועיקור זרעים. חשוב לציין כי כל השלבים הללו יבוצעו במכסה מנוע זרימה למינרית כדי לשמור על תנאים סטריליים. כל החומרים, הריאגנטים ומדיות הגידול הדרושים חייבים להיות אוטומטיים (ראו טבלת החומרים).
<ol><li>ביבציה וריבוד זרעים הערה: קווי הזרעים שבהם נעשה שימוש הם plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) וסוג פראי (WT, Col-0).<ol><li>מחלקים את הזרעים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. טמיעים את הזרעים במים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרי ומרובדים ב-4 מעלות צלזיוס בחושך במשך יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>עיקור זרעים<ol><li>בתנאים סטריליים, הכינו 10 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 50% (v/v) והוסיפו כ-20 מיקרון של Tween 20. לעיקור זרעים, הסר מים מהזרעים המוטבעים, הוסף 1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה לתוך צינורות microcentrifuge, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>מוציאים את תמיסת האקונומיקה בעזרת פיפטה.</li>
		<li>שטפו את הזרעים ב-1 מ"ל מים סטריליים להחייאה. הסר את המים לאחר שהזרעים התיישבו לתחתית. חזור על שלב 1.6 ועל שלב 1.7 שבע פעמים.</li>
		<li>יש להשהות את הזרעים בתמיסת אגרוז סטרילית של 0.1%.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי זרעים<ol><li>הכינו נפח של 1 ליטר של Murashige & Skoog Basal Medium עם ויטמינים ו-1.0 גרם/ליטר של חומצה אתנוסולפונית (MS) 2-(N-morphonio)על ידי הוספת 5.43 גרם מהאבקה ל-500 מ"ל של מים מזוקקים. התאם את ה-pH בין 5.6 ל-5.8 באמצעות אשלגן הידרוקסיד (KOH). יש למלא עד 1 ליטר במים מזוקקים.<ol><li>יש לפצל את התמיסה הנוזלית ל-500 מ"ל ולהניח כל מחצית בבקבוקון בקוטר 1 ליטר המכיל מוט ערבוב מגנטי. הוסיפו 5 גרם אבקת אגר כדי לקבל תמיסת אגר עם 1% לכל בקבוקון.</li>
			<li>אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi במשך 30 דקות; לאחר מכן, יש להניח בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב איטי. כאשר מקורר, לשפוך 25 מ"ל של MS אגר לתוך צלחת פטרי מרובע. תנו לו להתמצק. הערה: צלחות בינוניות בסיסיות אלה של Murashige ו- Skoog מכילות 1% MS בינוני עם ויטמינים ו- 1% אגר לטיפוח המוטנטים הנבדקים.</li>
		</ol></li>
		<li>חותכים קצה פיפטה של 200 μL עם סכין גילוח. מקם זרע אחד במרכז הרשת המרובעת המיועדת לכל מוטציה או גנוטיפ של בדיקה (1 ס"מ2 מרובע) של צלחת MS מרובעת (איור 1) באמצעות מיקרופיפטה של 200 μL. הערה: הרשת המרובעת בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ מסייעת לשמור על מרחק אחיד בין השתילים ולמנוע חפיפה, דבר שיהיה חשוב בהדמיה וניתוח פלואורסצנטיים מאוחרים יותר.</li>
		<li>לאחר שהזרעים מצופה, יש לעטוף בסרט כירורגי סביב המכסה כדי לאטום אותו, ולהניח אותו בתא הגידול בתנאים כמתואר להלן.</li>
	</ol></li>
</ol>2. צמיחת צמחים וטיפול CO2 נמוך
<ol><li>לגדל את הצמחים במשך 7-9 ימים ב 20 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור של 8 שעות של 120 μmol·m−2s−1 ו 16 שעות של חושך ב 18 °C. בדוק את הצמחים ביום השישי כדי לקבוע אם הם גדולים מספיק להדמיה. ביום השמיני לאחר הציפוי, חשפו את הצמחים ל-CO2 נמוך.</li>
	<li>טיפול ב-CO2 נמוך<ol><li>לאחר 7-9 ימים, מקם ארבעה מתוך שמונת הלוחות מתנאי תא הגידול בסביבה לתנאים פוטו-טרנספוזיטיביים של 20 מעלות צלזיוס, רמות אור רציפות של 200 מיקרומול·m−2 s−1, ו- CO2 נמוך למשך 12שעות.</li>
		<li>בנה את מצב CO2 נמוך באמצעות מיכל שקוף אטום עם 100 גרם של סיד סודה ממוקם בתחתית המיכל. מקמו את המיכל בתוך אותו תא גידול כמו הבקרה. יש לשמור על מפעלי הבקרה מתחת ל-120 μmol·m−2 s−1 ב-CO2 סביבתי למשך 12שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הגדרת מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית
<ol><li>הניחו לוחית בדיקה (שהוכנה לפי סעיף 1 וסעיף 2) מרוכזת מתחת למצלמה במרחק קבוע במערכת ההדמיה הפלואורסצנטית.</li>
	<li>בתוך תוכנת המכשיר, נווט אל חלון Live וסמן את התיבה Flashes כדי להפעיל הבזקי מדידה שאינם אקטיניים.</li>
	<li>לחצו על הכלים ' זום ' ו'מיקוד' עד שתמונה מלאה וחדה נראית לעין. לשם כך, השתמשו בבמה או במדף כדי להתאים את המרחק בין הצמחים למצלמה. שמור על זום, מיקוד ומרחק קבועים מהמצלמה למשך כל הניסוי.</li>
	<li>הגדר את הערך של El. Shutter ל- 0 וכוונן את הרגישות כדי לקבל אות פלואורסצנטי בטווח של 200-500 יחידות דיגיטליות. הערה: ערך תריס El. נמוך יותר (0-1) יבטיח שהבזקי המדידה לא יהיו אקטיניים, בעוד שערך גבוה יותר (2) ישפר את הרזולוציה של התמונה.</li>
	<li>מקם מד אור באותו מיקום המשמש להתאמת הגדרות המצלמה.</li>
	<li>בחלון חי, סמן את התיבה סופר כדי להתחיל פעימה רוויה הנמשכת 800 אלפיות השנייה. זכור לסמן את התיבה בכל פעם עבור דופק חדש.</li>
	<li>השתמש במחוון כדי להתאים את אחוז ההספק היחסי של פולס העל עד שמד האור יקרא 6,000-8,000 μmol·m−2s−1.</li>
</ol>4. תכנן את תוכנית התשואה הקוונטית
<ol><li>ייבוא כלי הפעלה סטנדרטיים עבור מערכת ההדמיה. כלול את default.inc כלול אור.inc הערה: תחביר התוכנית המשמש לעיון בניסוי זה הוא עבור מערכת הדמיה של FluorCam.</li>
	<li>הגדר את המשתנים הגלובליים הבאים בהתאם להגדרות התאורה שתצורתן נקבעה: תריס = 0 רגישות = 40 סופר = 65</li>
	<li>כלול את שלב הזמן לרישום נתונים: TS = 20 אלפיות השנייה</li>
	<li>אסוף את מדידת Fo על ידי דגימת פלואורסצנציה במצב מותאם כהה. F0duration = 2s; F0period = 200ms; הערה: F0duration מגדיר את טווח הזמן שבו נרשמת הפלואורסצנציה המותאמת לכהה. F0period מגדיר את מרווח הזמן שבו חוזרת על עצמה מדידת הפלואורסצנציה המותאמת לכהה.</li>
	<li>הקלט את מדידות Fo בטבלאות נתונים. <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub <0s>->מחסום, "startFo" <F0duration - F0period>=>מחסום,"endFo"; כאשר < , > מייצג את קבוצת ערכי הפלואורסצנציה באינדקס לפי זמן; => מאחסן מדידות בקובץ מערכת; MFMSUB מייצג את כל מערך הנתונים של הניסוי; וצ'ק פוינט יוצרת תת-ערכה לנתונים של מדידות ספציפיות, כגון startFo.</li>
	<li>אסוף ואחסן את מדידת Fm על ידי דגימת פלואורסצנציה לאחר פולס רווי. PulseDuration = 960ms; ## a1 = F0משך + 40 אלפיות השנייה a2 = a1 + 480ms; <a1>=>SatPulse(PulseDuration); <a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + PulseDuration>=>mfmsub <a1 + PulseDuration + 80ms>=>mfmsub; <a2>=>מחסום,"startFm" <a1 + PulseDuration - 80ms>=>מחסום,"endFm" <a2 + 80ms>=>מחסום,"timeVisual"; כאשר a1 ו - a2 הם משתנים לתיאום זמן הדגימה עם הדופק הרווי; a1 מייצג את זמן ההתחלה של מדידת Fm; ו-A2 מייצג את זמן נקודת האמצע של הדופק.</li>
</ol>5. מדידת התפוקה הקוונטית של הדגימות המטופלות
<ol><li>מיד לאחר הטיפול, מכסים את הצלחות ברדיד אלומיניום למשך 15 דקות להסתגלות כהה. הסר את רדיד האלומיניום כדי למדוד את התפוקה הקוונטית של פוטוסיסטם II באמצעות פלואורומטר שעבר שינוי באמפליטודה של פולסים. לאחר מכן, הנח את צלחת השתיל ישירות מתחת למצלמה והפעל את פרוטוקול התפוקה הקוונטית שנמצא במאגר GitHub.</li>
	<li>הורד את פרוטוקול quantum_yield מ- GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) או השתמש בתוכנית שתוכננה באופן דומה מסעיף 4. השתמש בתוכנת הפלואורומטר כדי לפתוח את קובץ התוכנית על ידי לחיצה על סמל התיקייה וניווט למיקום הקובץ.</li>
	<li>הפעל את תוכנית התשואה הקוונטית על ידי לחיצה על סמל הברק האדום.</li>
	<li>לאחר השלמת הפרוטוקול, נווט אל חלון הניתוח המקדים . חלקו את הצלחת לשתילים בודדים בעזרת כלי הבחירה לסימון כל הפיקסלים של כל שתיל בתמונת הלוחית. לחץ על אי-הכללת רקע כדי להסיר פיקסלים מסומנים ברקע, ולהשאיר רק את אזור השתיל.</li>
	<li>לחץ על נתח כדי ליצור נתוני פלואורסצנציה עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. התאם ידנית את טווח הערכים הפלואורסצנטיים כדי להציג ערכי מינימום ומקסימום עקביים בין כל הלוחות.</li>
	<li>לחץ על ממוצע מספרי מהלשונית ניסוי | ייצוא | מספרית. בחר כל הנתונים ולפי עמודה ולחץ על אישור כדי ליצור קובץ טקסט המכיל מדידות QY עבור כל שתיל.</li>
</ol>6. פתיחת קובץ הנתונים
<ol><li>פתח את קובץ הטקסט בגיליון אלקטרוני לניתוח. מבין הכותרות המציגות מספר שטח, גודל פיקסלים, Fm, Ft, Fq ו- QY, זהה את מספר השטח עבור גנוטיפ הליבה (WT או מוטנט בדיקה) ו- QYmax. בצע מבחן t זוגי ביחס לסוג פראי כדי לקבוע משמעות. נתונים מתפרשים כשונים באופן משמעותי כאשר ערכי p נמוכים מ- 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כספיים מתחרים או ניגודי עניינים.

לשיטות הניסוי המתוארות במאמר זה יש כמה יתרונות ומגבלות. יתרון אחד הוא ששיטה זו יכולה לסנן שתילי צמחים רבים, אם כי יש לנקוט באמצעי זהירות מסוימים כדי למנוע זיהום של צלחת המדיה הצמחית במהלך תהליך הציפוי והגידול. לכן, זה קריטי לאטום את לוחות Arabidopsis עם סרט כירורגי. יתרון נוסף של ניסוי זה הוא שיש לו תקופת לחץ קצרה יותר של 12 שעות בהשוואה לעבודה שפורסמה בעבר8. קיצור זמן הטיפול נועד להבחין טוב יותר בהבדלים ב-Fv/Fm בין ה-WT למוטנטים נבחרים. ייתכן שיהיה צורך לשנות את זמן הטיפול בהתאם לחומרת הפנוטיפ בז...

תנאי עקה אביוטיים הנפוצים בשדות של חקלאים יכולים להשפיע לרעה על תנובת היבולים על ידי הפחתת היעילות הפוטוסינתטית. תנאים סביבתיים מזיקים כגון גלי חום, שינויי אקלים, בצורת ומליחות קרקע עלולים לגרום ללחצים אביוטיים שמשנים את זמינות ה-CO2 ומפחיתים את תגובת הצמח לעקה גבוהה באור. שני שטפי הפחמן היבשתיים הגדולים ביותר הם פוטוסינתזה ופוטו-רסספירציה, החיוניים לצמיחת צמחים וליבולים. רבים מהחלבונים והאנזימים החשובים המעורבים בתהליכים אלה אופיינו בתנאי מעבדה וזוהו ברמה הגנטית1. אף על פי שהושגה התקדמות רבה בהבנת הפוטוסינתזה והפוטו-רסספירציה, שלבים רבים, כולל מעבר בין אברוני צמחים, נותרים בלתי אופייניים 2,3.
פוטו-רספירציה, שטף הפחמן השני בגודלו בצמחים לאחר הפוטוסינתזה, מתחילה כאשר האנזים רובסקו מתקן חמצן במקום פחמן דו-חמצני לריבולוז 1,5 ביספוספט (RuBP), ויוצר את התרכובת המעכבת 2-פוספוגליקולאט (2PG)1. כדי למזער את ההשפעות המעכבות של 2PG ולמחזר את הפחמן שנקבע בעבר, צמחי C3 פיתחו את התהליך הרב-אורגנלרי של פוטו-רספירציה. פוטו-רספירציה ממירה שתי מולקולות של 2PG למולקולה אחת של 3-פוספוגליצראט (3PGA), שיכולה להיכנס מחדש למחזור קיבוע הפחמן C31. לפיכך, פוטו-רספירציה ממירה רק 75% מהפחמן שהיה קבוע בעבר מיצירת 2PG וצורכת ATP בתהליך. כתוצאה מכך, תהליך הפוטו-רספירציה הוא גרר משמעותי של 10%-50% על תהליך הפוטוסינתזה, תלוי בזמינות המים ובטמפרטורות בעונת הגידול4.
האנזימים המעורבים בפוטו-רספירציה היו מוקד מחקר במשך עשרות שנים, אך רק מספר קטן של חלבוני הובלה אופיינו ברמה הגנטית, למרות שלפחות 25 שלבי הובלה מעורבים בתהליך 5,6,7. שני חלבוני ההובלה המעורבים ישירות בתנועת הפחמן שנוצר בתהליך הפוטו-רספירציה הם טרנספורטר גליקולאט/גליצריט פלסטידי PLGG1 וחומצת המרה נתרן סימפורטר BASS6, שניהם מעורבים בייצוא גליקולט מהכלורופלסט 5,6.
תחת הסביבה [CO2], רוביסקו מתקן מולקולת חמצן ל-RuBP בערך 20% מהזמן1. כאשר צמחים נתונים לרמות נמוכות של [CO 2], שיעורי הפוטורספירציה עולים, מה שהופך את Low [CO2] לסביבה אידיאלית לבדיקת מוטציות שעשויות להיות חשובות תחת עקה גבוהה של פוטו-רספירציה. בדיקת קווי T-DNA נוספים של חלבון הובלת כלורופלסט תחת CO2 נמוך במשך 24 שעות ומדידת שינויים בכלורופיל פלואורסצנטי הובילו לזיהוי קווי צמחים של bass6-1 שהדגימו פנוטיפ מוטנטי של פוטו-רספירציה5. אפיון נוסף הראה כי BASS6 הוא טרנספורטר גליקולט בקרום הפנימי של הכלורופלסט.
מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול דומה למה ששימש בתחילה לזיהוי BASS6 כטרנספורטר פוטו-ספירציה, שהגיע מרשימה של חלבוני הובלה פוטטיביים הממוקמים בתוך קרום הכלורופלסט8 פרוטוקול זה יכול לשמש בניסוי בעל תפוקה גבוהה המאפיין מוטציות של Arabidopsis T-DNA או צמחים מוטנטיים שנוצרו על ידי EMS כדרך לזהות גנים החשובים לשמירה על יעילות פוטוסינתטית תחת מגוון של עקות אביוטיות כגון חום, מתח אור גבוה, בצורת וזמינות CO2 . בדיקת מוטציות צמחיות באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל שימשה בעבר לזיהוי מהיר של גנים החשובים לחילוף חומרים ראשוני9. עם עד 30% מהגנום של Arabidopsis המכיל גנים המקודדים לחלבונים בעלי תפקוד לא ידוע או בעל מאפיינים גרועים, ניתוח המושרה על ידי עקה של יעילות פוטוסינתטית יכול לספק תובנה לגבי תפקודים מולקולריים שלא נצפו בתנאים מבוקרים בצמחים מוטנטיים10. מטרת שיטה זו היא לזהות מוטציות של המסלול הפוטו-רציונאלי באמצעות בדיקת CO2 נמוכה. אנו מציגים שיטה לזיהוי מוטציות המשבשות את הפוטו-רספירציה לאחר חשיפה ל-CO2 נמוך. יתרון של שיטה זו הוא שמדובר בסינון בתפוקה גבוהה עבור שתילים שניתן לעשות בפרק זמן קצר יחסית. פרקי פרוטוקול הווידאו מספקים פרטים על הכנה ועיקור זרעים, צמיחת צמחים וטיפול נמוך ב- CO2 , תצורת מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית, מדידת התשואה הקוונטית של הדגימות המטופלות, תוצאות מייצגות ומסקנות.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10810-070</td><td>מיכל לעיקור זרעים</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>VWR</td><td>9012-36-6</td><td>כימיקל המשמש לתליית זרעים כדי להקל על הציפוי</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana זרעי (abcb26)</td><td>ABRC, שהוזמנו דרך TAIR www.arabidopsis.org</td><td>SALK_085232</td><td>זרעי arabidopsis המשמשים כקבוצת</td></tr> <tr><td>ניסויArabidopsis thaliana זרעים (plgg1-1)</td><td>ABRC, הוזמנו דרך TAIR</td><td>www.arabidopsis.org</td><td>SALK_053469C זרעי ארבידופסיס הוריים&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana זרעים (WT)</td><td>ABRC, הוזמנו באמצעות TAIR www.arabidopsis.org</td><td>Col-0</td><td>arabidopsis זרעים מסוג בר המשמשים כקבוצת ביקורת</td></tr><tr><td>&nbsp; אקונומיקה&nbsp;</td><td>אקונומיקה גנרית</td> <td>של קלורוקס</td>&nbsp;<td>כימיקל המשמש לעיקור זרעים</td></tr><tr><td>מוצרי Medline</td> <td>סופגי קרבוליים</td><td>S232-104-001</td><td>CO2 סופג</td></tr> סגור <tr><td>FluorCam</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>FC 800-C</td><td>מצלמת פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Photon Systems מכשירים</td><td>סגורים FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>מצלמת פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>FluoroCam7</td><td>Photon Systems מכשירים</td><td>סגורים FluorCam FC 800-C/1010- </td><td>S תוכנת ניתוח תמונות פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>Gelzan (אגר צמחי)</td> <td>מעבדות Phytotech</td><td>71010-52-1</td><td>כימיקל המשמש למיצוק מדיה MS כלוחות&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית 1 ליטר</td><td>Fisherbrand</td><td>מיכל FB5011000</td><td>לייצור וחיטוי</td></tr><tr><td>תא גידול</td> מדיה <td>MS Caron</td><td>7317-50-2</td><td>תא גידול המשמש לגידול צמחים</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog בזאלי בינוני עם ויטמינים & 1.0 גרם/ליטר MES (MS)</td><td>מעבדות פיטוטק</td><td>M5531&nbsp;</td><td>מצע גידול לשתילי Arabidopsis&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td> <td>מעבדות Phytotech</td><td>1310-58-3</td><td>מייצרות כפתרון 1 M לאורות עכביש לכוונון pH</td></tr><tr><td></td><td>Mean Well Enterprises נורות</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>המשמשות בבדיקת האור&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מרובעת עם רשת, סטרילית</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td><td>המשמשת להחזקת מדיה MS לשתילי arabidopsis</td></tr><tr><td>סרט כירורגי</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>סרט המשמש לאיטום צלחות</td></tr><tr><td>tween 20</td><td>biorad</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>חומר פעילי שטח המשמש לסיוע בעיקור זרעים</td></tr></tbody></table>

הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

פוטוסינתזה ופוטו-רספירציה מייצגות את שטפי הפחמן הגדולים ביותר בחילוף החומרים הראשוני של הצמחים, והן נחוצות להישרדות הצמח. רבים מהאנזימים והגנים החשובים לפוטוסינתזה ולפוטו-רספירציה נחקרו היטב במשך עשרות שנים, אך היבטים מסוימים של המסלולים הביוכימיים האלה וההצלבה שלהם עם כמה תהליכים תת-תאיים עדיין אינם מובנים במלואם. חלק גדול מהעבודה שזיהתה את הגנים והחלבונים החשובים בחילוף החומרים בצמחים נערך בסביבות מבוקרות מאוד שאולי אינן מייצגות בצורה הטובה ביותר את האופן שבו פוטוסינתזה ופוטו-נשימה מתפקדות בסביבות טבעיות וחקלאיות. בהתחשב בכך שעקה אביוטית גורמת ליעילות פוטוסינתטית לקויה, יש צורך בפיתוח מסך בעל תפוקה גבוהה שיכול לנטר הן עקה אביוטית והן אחר השפעתה על הפוטוסינתזה.
לכן, פיתחנו שיטה מהירה יחסית לסינון שינויים הנגרמים על-ידי עקה אביוטית ביעילות הפוטוסינתטית, שיכולים לזהות גנים לא אופייניים עם תפקידים בפוטורספירציה באמצעות ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל ובדיקת CO2 נמוכה. מאמר זה מתאר שיטה לחקר שינויים ביעילות הפוטוסינתטית במוטנטים של דנ"א מועבר (T-DNA) ב-Arabidopsis thaliana. ניתן להשתמש באותה שיטה לסינון מוטנטים המושרים על ידי אתיל מתנסולפונט (EMS) או להקרנה מדכאת. שימוש בשיטה זו יכול לזהות מועמדים לגנים למחקר נוסף בחילוף החומרים הראשוני של הצמח ובתגובות עקה אביוטיות. נתונים משיטה זו יכולים לספק תובנה לגבי תפקוד גנים שאולי לא ניתן לזהות עד לחשיפה לסביבות עקה מוגברות.

התוצאות מציגות תמונות לוח של תמונות גולמיות ופלואורסצנטיות מהקרנת סביבה ו-CO2 נמוכה של WT ומוטציות בדיקה. כל צמח מסומן לפי מספר שטח, עם קריאות פלואורסצנטיות מתאימות הניתנות כ- QY. הנתונים מיוצאים כקובץ טקסט וניתן לפתוח אותם בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח (ראה טבלה משלימה S1). קווים מוטנטיים plgg1-1 ו- abcb26 נבחרו כדי להדגים את הזיהוי החיובי והשלילי של גנים הקשורים ללחץ פוטו-טראומטי. PLGG1 מקודד עבור הטרנספורטר הראשון במסלול לאחר החמצון של RuBP6, בעוד AB...

אנו מתארים גישה למדידת שינויים ביעילות הפוטוסינתטית בצמחים לאחר טיפול ב-CO2 נמוך באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל.

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

המטרה של שיטה זו היא לזהות מוטציות במסלול הפוטו-רויטריאליסטי באמצעות בדיקת CO2 נמוכה. אנו מציגים שיטה לזיהוי מוטציות המשבשות את הפוטו-רספירציה לאחר חשיפה ל-CO2 נמוך. יתרון של שיטה זו הוא שמדובר בסינון תפוקה גבוהה לשתילים שניתן לעשות בפרק זמן קצר יחסית.הסעיפים הבאים יספקו פרטים על הכנת זרעים ועיקורם, גידול צמחים וטיפול נמוך ב- CO2, יגדירו את מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית, ימדדו את התשואה הקוונטית של דגימות מטופלות, תוצאות מייצגות ומסקנות. הכנת זרעים ועיקור. הכנת הזרעים מורכבת מהטמעת זרעים ועיקור זרעים.חשוב לציין כי כל השלבים הללו נעשים במכסה מנוע זרימה למינרי כדי לשמור על תנאים סטריליים. כל החומרים הדרושים, ריאגנטים, ומדיום הצמיחה הם autoclaved. קווי הזרעים המשמשים הם plgg1-1, abcb26, ו- WT או סוג פראי.יש לשאוב זרעים במים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית, ואז לרבד בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך יומיים. בתנאים סטריליים, הכינו 10 מיליליטר בנפח של 50% לתמיסת אקונומיקה בנפח והוסיפו כ-20 מיקרוליטרים של Tween 20. הסר מים מזרעים imbibed, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת אקונומיקה לתוך צינור microcentrifuge ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.מוציאים את תמיסת האקונומיקה בעזרת פיפטה. שטפו את הזרעים במיליליטר אחד של מים סטריליים להחייאה. הסר את המים לאחר שהזרעים התיישבו לתחתית.יש להשהות זרעים בתמיסת אגרוז סטרילית של 0.1%. לציפוי זרעים, צלחות בינוניות בסיסיות עם 1% MS בינוניות עם ויטמינים ו-1% אגר לטיפוח מוטציות הבדיקה. חותכים קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם סכין גילוח.באמצעות פיפטה, הניחו זרע אחד במרכז הרשת המרובעת המיועדת לכל מוטציה או גנוטיפ בדיקה. כאן, צלחת מרובעת עם רשת אחד על סנטימטר משמש. זה עוזר לשמור על מרחק אחיד בין כל שתיל ולמנוע חפיפה, אשר יהיה חשוב מאוחר יותר בהדמיה פלואורסצנטית וניתוח.לאחר שהזרעים צופו, עטפו סרט כירורגי סביב המכסה כדי לאטום אותו, ואז הניחו אותו בתא הצמיחה. צמיחת צמחים וטיפול נמוך ב- CO2. לגדל צמחים במשך שבעה עד תשעה ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במחזור אור של שמונה שעות של 120 מיקרומולים למטר מרובע לשנייה ו-16 שעות חושך ב-18 מעלות צלזיוס.בדוק צמחים ביום השישי כדי לקבוע אם הם גדולים מספיק להדמיה. ביום השמיני לאחר הציפוי, חשפו את הצמחים ל-CO2 נמוך. הניחו את מתקני הטיפול בקופסה אטומה בתוך תא הגידול בעוצמת אור של 200 מיקרומולים למטר רבוע לשנייה למשך 12 שעות.מצב ה-CO2 הנמוך נבנה באמצעות מיכל שקוף אטום עם 100 גרם של סיד סודה שהונח בתחתית המיכל. המיכל הונח בתוך אותו תא גידול כמו הבקרה. מתקני הבקרה יישארו מתחת ל-120 מיקרומולים למטר רבוע לשנייה ב-CO2 סביבתי למשך 12 שעות.הגדר את מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית. הנח לוחית בדיקה מרוכזת מתחת למצלמה במרחק קבוע במערכת ההדמיה הפלואורסצנטית. בתוך תוכנת המכשיר, נווט אל החלון החי וסמן את התיבה Flashes כדי להפעיל הבזקי מדידה שאינם אקטיניים.לחץ על כלי הזום והמיקוד עד שתראה תמונה מלאה וחדה. הגדר את הערך של תריס EL לאפס וכוונן את הרגישות כדי לקבל אות פלואורסצנטי בטווח של 200 עד 500 יחידות דיגיטליות. מקם מד אור באותו מיקום המשמש להתאמת הגדרות המצלמה.בחלון החי, סמן את התיבה סופר כדי להתחיל פולס רווי שנמשך 800 אלפיות השנייה. השתמש במחוון כדי להתאים את אחוז ההספק היחסי של פולס העל עד שמד האור יקרא 6, 000 עד 8, 000 מיקרומולים למ"ר לשנייה. מדידת תפוקה קוונטית של דגימות מטופלות.מיד לאחר הטיפול, יש לכסות את הצלחות בנייר אלומיניום למשך 15 דקות להסתגלות חשוכה. הסר רדיד אלומיניום כדי למדוד את התפוקה הקוונטית של פוטוסיסטם שתיים באמצעות משרעת פולסים שונה פלואורומטר. לאחר מכן הנח את צלחת השתיל ישירות מתחת למצלמה והפעל את פרוטוקול התפוקה הקוונטית שנמצא במאגר GitHub שלנו.הורד את פרוטוקול התשואה הקוונטית מ- GitHub. השתמש בתוכנת פלואורומטר כדי לפתוח את קובץ התוכנית על ידי לחיצה על סמל התיקייה וניווט למיקום הקובץ. הפעל את פרוטוקול התשואה הקוונטית על ידי לחיצה על סמל הברק האדום.לאחר השלמת הפרוטוקול, נווט אל חלון טרום הניתוח. חלק את הצלחת לשתילים בודדים על-ידי הדגשת כל הפיקסלים עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. לחץ על אי-הכללת רקע כדי להסיר פיקסלים מסומנים ברקע, ולהשאיר רק את אזור השתיל.לחץ על נתח כדי ליצור נתוני פלואורסצנציה עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. התאם ידנית את טווח הערכים הפלואורסצנטיים כדי להציג ערכי מינימום ומקסימום עקביים בין כל הלוחות. בכרטיסיה ניסוי, לחץ על יצא ולאחר מכן על מספרי.לחץ על ממוצע מספרי כדי ליצור קובץ טקסט המכיל את התפוקה הקוונטית עבור כל שתיל. פתח את קובץ הטקסט והגיליון האלקטרוני לניתוח. הגיליון האלקטרוני מכיל את מספר האזור, גודל הפיקסלים, Fm, Ft, Fq ו- QY. ראשית, עלינו לזהות את מספר האזור לגנוטיפ המתאים לו, בין אם סוג בר או מוטציה של בדיקה, תוצאות.להלן תמונות הלוחות של תמונות גולמיות ופלואורסצנטיות מסינון סביבתי ו-CO2 נמוך של סוגי בר ומוטציות בדיקה. כל לוח מסומן לפי מספר שטח עם קריאות פלואורסצנטיות מתאימות כתפוקה קוונטית או QY. הנתונים מיוצאים כקובץ טקסט וניתן לפתוח אותם בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. יעילות התפוקה הקוונטית של Fv/Fm המותאמת לחושך של סוגי בר ומוטנטים מדומה על ידי חלקות קופסה ושפם.כדי לבחון את ההבדל הסטטיסטי בין סוגי בר ומוטציות בדיקה, נעשה שימוש במבחן T זוגי עם ערך P של פחות מ-0.05. כאן, אנו משתמשים בקו המוטציה הפוטו-טרנסציונלית עם תפוקה קוונטית מופחתת Fv/Fm כמוטנט בדיקה כדי לבדוק את היעילות של שיטת הסינון שלנו. התוצאות שלנו מראות שלמוטציות הבדיקה יש יעילות תפוקה קוונטית נמוכה משמעותית בהשוואה לסוגים הפראיים.זה מצביע על כך ששיטת הסינון שלנו מסוגלת לזהות מוטציות פוטו-רציפות באמצעות סינון CO2 נמוך. מסקנות. דבר חשוב שיש לזכור בעת השימוש בפרוטוקול זה הוא לוודא כי שתילי Arabidopsis הם גדולים מספיק כדי למדוד פלואורסצנציה, אבל לא כל כך גדול כי הצמחים יחפפו במהלך הדמיה. עדיף לדמות את השתילים כעלים האמיתיים הראשונים כדי לנסות לשמור על גודל העלה וזוויות העלים אחידים.פרוטוקול זה יכול לשמש כסינון תפוקה גבוהה עבור שתילים. הדמיה של כל צלחת היא מהירה יחסית ויש לה פוטנציאל לסנן הרבה מעל 1, 000 שתילים ליום. ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל אפשר לנו לזהות מוטציות פוטו-טרנסמיטיביות באמצעות בדיקת CO2 נמוכה, החשובה לשמירה על יעילות הפוטו-נשימה.פרוטוקול זה אינו מוגבל לערבידופסיס ויש לו פוטנציאל לשימוש בניסויי תגובה ללחץ אביוטי.

evaluation-photosynthetic-efficiency-photorespiratory-mutants

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד התנהגות גידול הצמח, במיוחד פנוטיפים באופן לשחזור. אנו מראים כיצד לספק משתנה ועל הזמן אותו יציבים לתנאי תאורה. ניתוחים נכונה תלויה מספיקים מדגם והערכות סטטיסטיות בתוקף.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

אנו מתארים גישה טכנית חדשה כדי ללמוד תגובות פוטוסינטתיים בצמחים גבוהים יותר מעורבים מדידות בו של כלורופיל מחזירי אור והשתקפות העלה באמצעות פאם ורדיומטר ספקטרלי לאיתור אותות מן אותו אזור עלה באראידאופזיס.

הערכה של התנהגויות פוטוסינטתיים על ידי מדידות סימולטני של השתקפות עלה וניתוחים כלורופיל פלואורסצנטית

פלואורומטר קצב חזרה מהיר (FRRf) היא שיטה מועילה למדידת פוטו-פיזיולוגיה של פוטו-מערכת II ופרודוקטיביות ראשונית. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד פוטופיזיולוגיה PSII של אצה אפיזואית, Colacium sp. על מצע zooplankton באמצעות FRRf סוג cuvette.

מדידת פוטופיזיולוגיה של השלב המצורף של קולאקיום sp. על ידי פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג Cuvette

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת הרפיה של מרווה לא פוטוכימית על ידי פלואורומטריה של כלורופיל מווסתת משרעת פולסים. השיטה מיושמת על גליצין מקס שגדל בשדה וניתן להתאים אותה למינים אחרים כדי לסנן מגוון גנטי או אוכלוסיות רבייה.

ניתוח בתפוקה גבוהה של מרווה לא פוטוכימית בגידולים באמצעות פלואורומטריית כלורופיל מווסתת משרעת פולסים

רוב האורגניזמים הפוטו-אוטוטרופיים השוחים מראים שינויים התנהגותיים הנגרמים על ידי פוטו-אבה(photobehavior). הפרוטוקול הנוכחי מתבונן בפוטו-בהביור האמור באורגניזם המודל Chlamydomonas reinhardtii.

תצפית על פוטו-בהביור בכלמידומונס ריינהרדטי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.

הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

כתב יד זה מתאר גישה לא הרסנית ובעלת תפוקה גבוהה למדידות שדה אוטונומיות של יעילות קוונטית, החזרה ספקטרלית וארכיטקטורת צמחים בפוטוסיסטם II, המאפשרת פנוטיפינג של פוטוסינתזה בקנה מידה גדול בניסויים אגרונומיים ושטחי רבייה.

סינון בשטח בקצב גבוה של יעילות פוטוסינתטית בצמחי גידול באמצעות רובוט אוטונומי

באמצעות גירוי חשמלי בתדר גבוה, תפיסת כמו פעילות יכול להיגרם...

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

למדו לזהות מוטנטים בנתיב הפוטורספירציה בצמחים באמצעות סקרינינג CO2 נמוך וניתוח פלואורסצנציית כלורופיל. שיטה זו מאפשרת סקרינינג בקיבולת גבוהה לזיהוי יעילות פוטוסינתטית מופחתת.

הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל

גלה סרטונים נוספים