Name: הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למדו את שיטת SCAD להדמיית התפתחות צלקות בעור באמצעות ניתוח רקמת עור ופשיה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת פיברובלסטים וזיהוי אינטראקציות מולקולריות מרכזיות כמו connexin-43 ו-N-cadherin לפיתוח טיפולים חדשים נגד צלקות ופיברוזיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל המחברים השותפים של Jiang et al. 2020 על תרומתם לפיתוח מתודולוגיית SCAD13. אנו מודים לד"ר סטפן דיצל ולמתקן הליבה של הדמיה ביולוגית באוניברסיטת לודוויג-מקסימילנס על הגישה למערכת המולטי-פוטון. י.ר. נתמך על ידי קרן אלזה-קרנר-פרסניוס-ספניוס (2016_A21), מענק איחוד המועצה האירופית למחקר (ERC-CoG 819933) וקרן LEO (LF-OC-21-000835).

המודל המוצג להלן מספק תיאור מפורט שלב אחר שלב של יצירת מבחן SCAD כמתואר בקצרה ב- Jiang et al., 202013. תכשירי דגימת SCAD בוצעו לאחר הקרבת בעלי החיים בהתאם להנחיות הבינלאומיות וממשלת בוואריה עילית. בעלי חיים שוכנו במתקן החיות של מרכז הלמהולץ במינכן. החדרים נשמרו עם לחות אופטימלית וטמפרטורה קבועה עם מחזור אור של 12 שעות. בעלי החיים סופקו עם מזון ומים ad libitum.
1. הכנת רקמת SCAD
<ol><li>להקריב גורים שזה עתה נולדו ביום 0 או ביום 1 (P0 או P1).</li>
	<li>יש לבלום בזהירות לפחות 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ של עור גב גב בעובי מלא עד לשכבת שריר השלד באמצעות אזמל כירורגי סטרילי.</li>
	<li>מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.</li>
	<li>שטפו את הרקמה שנכרתה ב-50-100 מ"ל של מדיית DMEM/F-12 קרה כדי להסיר דם מזהם.</li>
	<li>יש לשטוף פעם אחת עם תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים.</li>
	<li>מניחים את העור הפוך (חיתולית שטחית למעלה) בצלחת פטרי 10 ס"מ המכילה מדיית DMEM/F12.</li>
	<li>באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של 2 מ"מ, הוציאו את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שרירי panniculus carnosus הבסיסיים עד האפידרמיס ליצירת רקמות SCAD.</li>
	<li>הכן ומלא 200 μL של DMEM / F12 (ללא פנול אדום) מדיה מלאה - DMEM / F12 מדיה בתוספת 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין לתוך בארות בודדות של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות ומטביעים באופן מלא רקמת SCAD בודדת במהופך (החיתולית פונה כלפי מעלה) לבארות של צלחת בת 96 בארות.</li>
	<li>העבר את הצלחת לחממה של תרבית תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים (37 °C , 21%(v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות).</li>
</ol>2. SCAD - תרבית רקמה
<ol><li>תרבות SCADs בחממה עד 5 ימים.</li>
	<li>ביום 2 וביום 4 של התרבית, החליפו את המדיה ב-200 מיקרול של מדיה מלאה טרייה של DMEM/F12 שחוממה מראש כדי להבטיח את המשך הכדאיות של התאים והרקמות. החלף תרכובות טיפול במהלך כל שינוי במדיה. הערה: הקפד להשאיר 10 μL של מדיה בבאר כדי למנוע רקמות להידבק לבארות.</li>
	<li>הכינו SCADs לניסויים הבאים: הדמיה חיה (סעיף 3), וקצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית (סעיף 4).</li>
</ol>3. הדמיה חיה של SCADs
<ol><li>הכינו מינימום של 30 מ"ל של 2%-3% (w/v) תמיסת אגרוז נמסה נמוכה ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל עד להרתחה.</li>
	<li>מעבירים מיד את הבקבוק ומקררים את תמיסת האגרוס הנוזלי באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית/צלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ.</li>
	<li>הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר (RT) על ידי העברה איטית של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס על המנה בקוטר 35 מ"מ באמצעות פיפטה של פסטר. אגרוז מתפלמר תוך 2 דקות.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה של DMEM/F12 שחוממה מראש (ללא מחוון אדום פנול).</li>
	<li>רכוש תמונות בהילוך מהיר של יום 0 SCADs עד 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או רב-פוטון המצויד במערכת דגירה מתאימה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, 21% (v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות.</li>
</ol>4. קצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית
<ol><li>לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה עם PBS סטרילי.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות SCADs בודדים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 500 μL של 2% paraformaldehyde כדי לתקן את הרקמות במהלך הלילה ב 4 °C (74 °F).</li>
	<li>שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו עם צביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית/תלת-ממדית.</li>
	<li>צביעה אימונופלואורסצנטית תלת-ממדית<ol>
<li>חלחלו לרקמות על ידי דגירה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של PBS בתוספת 0.2% ג'לטין, 0.5% Triton-X100 ו-0.01% תימרוסל (PBSGT) ב-RT למשך 24 שעות.</li>
		<li>להכין כמות נאותה של נוגדנים ראשוניים בהתאם להוראות היצרן ולדגום רקמות SCAD ב 150 μL של תמיסת PBSGT במשך 24 שעות ב RT. הערה: אם ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית אינו מדווח על ידי היצרן, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים על רקמות בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>שטפו בעדינות את ה-SCADs שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.</li>
		<li>דגירה רקמה עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT.</li>
		<li>לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 30 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.</li>
		<li>מעבירים את הרקמה לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית או מולטי-פוטון. הערה: בעת שימוש במטרות טבילה במים, הטמיעו את ה-SCADs באגרוז של נקודת התכה נמוכה ב-2% כדי לשתק את הרקמה כדי למנוע היסחפות במהלך רכישת התמונה</li>
	</ol>
</li>
	<li>צביעה דו-ממדית של אימונופלואורסצנציה<ol>
<li>מעבירים את הרקמה לתבנית קריו וממלאים בעדינות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.</li>
		<li>כוונון בעדינות את כיוון הרקמה, מה שמבטיח היעדר בועות אוויר כדי להשיג חתך רוחב או חתך אנכי.</li>
		<li>הניחו את התבנית על קרח יבש למשך 20-30 דקות ודגרו את הבלוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>הגדר את טמפרטורת הלהב ל -25 °C (75 °F) ואת טמפרטורת בלוק הדגימה ל -17 °C (74 °F). הכינו מקטע קריו של 6 מיקרומטר באמצעות cryostat, העבירו את החלקים לשקופית הידבקות ואחסנו את השקופיות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS ולדגום את השקופיות ב-5% אלבומין בסרום בקר (BSA) w/v ב-PBST (PBS בתוספת 0.05% Tween) למשך שעה אחת.</li>
		<li>מוסיפים כמות מתאימה של נוגדן ראשוני ל-150μl PGST, ודוגרים למשך הלילה ב-4 °C (4 °F) הערה: אם היצרן לא מדווח על כך שהיצרן מדווח על ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים במקטעי בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>שטפו בעדינות את החלקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.</li>
		<li>דגירה של רקמות עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT למשך שעתיים.</li>
		<li>לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.</li>
		<li>הרכיבו את המגלשות עם מדיום הרכבה המכיל DAPI ויבשו את המגלשות בחושך ב-RT.</li>
		<li>דמיינו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li>
<li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+wound+healing%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li>
<li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+scars+and+keloids%3A+a+review+and+current+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li>
<li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wounds+and+its+burden%3A+An+updated+compendium+of+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151(2015).</li>
<li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparisons+of+the+morphology%2C+migration%2C+cell+adhesions%2C+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+wound+healing%3A+an+emphasis+on+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%3A+Official+Journal+of+International+Society+for+Bioengineering+and+the+Skin+%28ISBS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Digital+Imaging+of+Skin+%28ISDIS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Skin+Imaging+%28ISSI%29%22%5BJournal%5D)">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Animal+models+of+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
</ol>

כל הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

מספר דגמים כבר פותחו כדי להבין היווצרות צלקות לאחר פציעה. אמנם נעשו הרבה התקדמויות בעניין זה, אך המנגנונים בפועל עדיין אינם ברורים. בניגוד לטכניקה הקודמת, מודל SCAD משלב את כל סוגי התאים והשכבות העוריות, ובכך שומר על המורכבות של עור מקומי18,19. מתודולוגיה זו מסוגלת לייצר מערכי נתונים בסיסיים החשובים להבנת מנגנונים מולקולריים המניעים היווצרות צלקות. הבדיקה מתוכננת באופן פשוט, מינימליסטי, אך מסוגל לייצר קריאות בסיסיות ותפקודיות החיוניות להבנת נדידת פיברובלסטים, תצה...

ריפוי פצעים הוא תהליך של שחזור פצעים שנפרצו. פגיעות ברקמות אצל חסרי חוליות גורמות להתחדשות חלקית או מלאה. לעומת זאת, יונקים מגיבים לפציעה עמוקה על ידי הצטלקות, תהליך המותאם לאטום פצעים במהירות עם תקעים צפופים של סיבי מטריצה הממזערים את האזור הפרוע ובמקביל מעוותים לצמיתות את האתר הפגוע 1,2,3. כוויות עור גדולות או פצעים פתוחים עמוקים ביונקים גורמים לפנוטיפים פתולוגיים כגון צלקות היפרטרופיות או קלואידיות 4,5. צלקות נשגבות אלה גורמות לעומס עצום על מערכות הבריאות הקליניות והעולמיות. בארה"ב לבדה, ניהול צלקות עולה כ-10 מיליארד דולר בשנה 6,7. לכן, פיתוח מתודולוגיות רלוונטיות נדרש כדי להבין טוב יותר את התהליכים והמנגנונים המממנים המעורבים ביצירת צלקות.
בשנים האחרונות, מגוון רחב של מחקרים בעכברים גילו אוכלוסיות פיברובלסטים הטרוגניות עם עוצמות תפקודיות מובהקות בהתבסס על מקורותיהם במקומות מסוימים בעור 8,9,10. בעור האחורי, Rinkevich et al., 2015, זיהו כי אוכלוסייה פיברובלסטית ספציפית עם ביטוי עוברי מוקדם של Engrailed-1 (En1), המכונה EPF (פיברובלסט חיובי חרוט) תורמת להצטלקות עורית עם פציעה. לעומת זאת, שושלת פיברובלסטית אחרת ללא היסטוריה של ביטוי חרוט, פיברובלסט שלילי חרוט (ENF), אינה תורמת להיווצרותצלקת 8. מיפוי גורל של שושלות En1 אלה באמצעות קווי עכברים מהונדסים מונעי Cre שנחצה לקווי עכברים פלואורסצנטיים כגון R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) מאפשר הדמיה של אוכלוסיות EPF ו- ENF.
חקר נדידת פיברובלסטים in vivo במשך מספר ימים מוגבל על ידי אילוצים אתיים וטכניים. יתר על כן, מסכי ספריית נוגדנים מורכבים, נגיפיים ומנטרלים כדי לווסת מסלולים המעורבים בהצטלקות הם מאתגרים מבחינה טכנית. בעבר נעשה שימוש במודלים של in vitro או ex vivo חסרים את היכולת לדמיין נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה אמיתית של העור, אחידות בהתפתחות צלקות, כמו גם מורכבות רקמות המחקה סביבות עור in vivo 11,12. כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, פיתחנו מבחן צלקות ex vivo המכונה SCAD (רקמה דמוית SCar בצלחת A)13,14. בדיקה פשוטה זו יכולה להתבצע על ידי כריתת עור בעובי מלא של 2 מ"מ המכיל את האפידרמיס, הדרמיס ואזורי החיתולית התת עוריים ושילובם במדיית DMSO בתוספת סרום למשך עד 5 ימים. צלקות המופקות מ-SCAD משכפלות באופן מהימן סימני היכר תעתיקיים ופרוטאומיים של צלקות in vivo. בנוסף, SCADs שנוצרו מקווי עכברים מהונדסים רלוונטיים (למשל, עכברי En1) שהוצלבו עם קווי עכברים פלואורסצנטיים מאפשרים הדמיה של דינמיקת נדידת פיברובלסטים והתפתחות צלקות ברזולוציה חסרת תקדים. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לכל יישומי תפוקה גבוהה (למשל, ספריית תרכובות, ספריית נוגדנים או סינון ויראלי)13,14. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב ליצירת SCADs ויישומי עיבוד במורד הזרם הבאים כדי לחקור את הדינמיקה התאית והמטריקסית בפיתוח צלקות.

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20, חומר ניקוי לא יוני</td><td>Biorad Laboratories</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר, פרקט אתנול קר</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדום-500 מ"ל</td><td>LIFE Technologies</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus הידבקות שקופיות</td><td>פישר מדעי</td><td>J1800AMNZ</td><td>הידבקות סרום</td></tr><tr><td>בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, דרום אמריקה מקור-500 מ"ל</td><td>LIFE Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>10500064</tr><tr><td>Fluoromount-G עם DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>00 4959 52</td><td>מדיום הרכבה עם מלקחיים DAPI</td></tr><tr><td>מעוקלים עם נקודות עדינות עם נירוסטה מנחה (פינצטה) באורך 125 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12381369</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>Sigma</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX תוסף-100 מ"ל</td><td>LIFE Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום-500 מ"ל</td><td>LIFE Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>מערכת דגירה של גז איבידי ל-CO2 ו-O2</td><td>Ibidi</td><td>11922</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi</td><td></td><td>10915</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף Leica SP8 - עירור מולטיפוטון 680&ndash; 1300 ננומטר</td><td>Leica</td><td></td><td>מצויד במטרת טבילה במים פי 25 (HC IRAPO L 25x/1.00&thinsp; W) בשילוב עם לייזר מתכוונן (Spectra-Physics, InSight DS&thinsp;+&thinsp; יחיד)</td></tr> <tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>LIFE Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG אגרוז, 25 גרם</td><td>ביוזים/לונזה</td><td>859081</td><td></td></tr><tr><td>OCT מטריצת הטמעה</td><td>קרלרוט</td><td>6478.1</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, 16% W/V AQ. 10 x10 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>עט-סטרפטוקוק</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Stiefel Biopsy-Punch 2 מ"מ</td><td>Stiefel</td><td>270130</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים חדים/חדים 11.4 ס"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>15654444</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal Bioxtra, 97%&ndash; 101%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager M2 מיקרוסקופ זקוף</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת scad - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

התגובה הגלובלית של היונקים לאיטום פצעי רקמות עמוקים היא באמצעות היווצרות צלקות והתכווצות רקמות, המתווכת על ידי פיברובלסטים מיוחדים של החיתולית. למרות המשמעות הקלינית של היווצרות צלקות וריפוי פצעים לקוי, הבנתנו את הדינמיקה הפיברובלסטית של החיתולית בריפוי פצעים היא מעורפלת בשל היעדר מבחנים רלוונטיים המאפשרים הדמיה ישירה של כוריאוגרפיה פיברובלסטית ודינמיקה בסביבות מורכבות כגון פצעים בעור. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת צלקות עור לשעבר באמצעות SCAD או "רקמה דמוית SCar בצלחת A Dish" המחקה את הסביבה המורכבת של פצעי עור. במבחן זה, עור 2 מ"מ בעובי מלא נכרת ומתורבת הפוך במדיה במשך 5 ימים, שבמהלכם צלקות והתכווצויות עור מתפתחות באופן אחיד. מתודולוגיה זו, יחד עם מודלים של עכברים מהונדסים ספציפיים לשושלת פיברובלסטים, מאפשרת הדמיה של שושלות פיברובלסט בודדות לאורך כל תהליך תיקון הפצע. באופן כללי, פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין תהליכים ומנגנונים בסיסיים של תיקון פצעים, תוך בחינה ישירה של ההשפעות של מודולטורים על תוצאות ריפוי פצעים.

ניתן להפריד את הדור של SCADs לשלושה שלבים חיוניים: קצירת עור בחזרה מעכברי P0-P1, יצירת אגרופי ביופסיה בעובי מלא, והתרבות שלאחר מכן של סקאדים בודדים עד 5 ימים בלוחות של 96 בארות. כקריאה, ניתן ליישם עוד יותר את הבדיקה הזו כדי לנתח את ההיבטים המרחביים והזמניים של הצטלקות. הניתוח המרחבי משתמש בתיוג חיסוני דו-ממדי ותלת-ממדי של רקמות כדי לחקור לוקליזציה מרחבית של רכיבי תאים ומטריצות בתוך רקמת צלקת מתפתחת. מחקרים Spatiotemporal מאפשרים הדמיה של צלקות ex-situ אלה באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים פנימיים או חיצוניים של רקמו...

פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה "SCar כמו רקמה בצלחת" או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

בעבר נעשה שימוש במודלים של מבחנה או ex vivo חסרים רכיבי תאי עור ומורכבות של רקמת העור. בדיקת SCAD זו של ex situ מתגברת על מגבלה מוגדרת ומאפשרת לחקור את התפתחות הצלקות מחוץ לחיה פצועה. בדיקת SCAD מאפשרת הדמיה של נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה של העור.זה מאפשר ספריות סינון של מפעילים או מעכבים כדי להבין את הבסיס המכניסטי של היווצרות צלקות. בדיקות סינון בתפוקה גבוהה של ספריות שטוחות תוך שימוש במודל SCAD בהבנת התהליך הבסיסי וקורס המולקולות המעורב בתיקון פצעים. בדיקת ה-SCAD קלה לביצוע באמצעות חומרי העור.עבור צלקת עקבית, מומלץ לבחור עור יום אפס או יום אחד לאחר הלידה. לאחר הקרבת יום אפס לאחר הלידה או יום אחד של גור שזה עתה נולד, השתמשו באזמל כירורגי סטרילי כדי לבלות בזהירות את העור הגבי בעובי מלא של 1.5 על 1.5 ס"מ עד לשכבת שרירי השלד. מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.לשטוף את הרקמה שנכרתה עם 50 עד 100 מיליליטרים של DMEM F-12 קר בינוני כדי להסיר דם מזהם. לאחר מכן, שטפו את הרקמה בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים. מניחים את העור הפוך עם חיתולית שטחית למעלה בצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה מדיום DMEM F-12.לאחר מכן, באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של שני מילימטרים, מוציא את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא כדי ליצור רקמות מפוספסות, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שריר ה-panniculus carnosus הבסיסי עד האפידרמיס. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום מלא DMEM F-12 טרי ללא פנול אדום לכל באר של צלחת בעלת 96 בארות. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים ומטביעים באופן מלא רקמה בודדת הפוכה לבארות של צלחת בת 96 בארות.מעבירים את הצלחת לחממת תרביות תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים. בימים השני והרביעי של התרבית, יש להסיר את המדיום ולהשאיר 10 מיקרוליטרים בבאר ולהוסיף מדיום מלא DMEM F-12 טרי שחומם מראש יחד עם תרכובות הטיפול כדי לשמור על המשך תנאי הכדאיות של התאים והרקמות. להדמיה חיה של SCADs, הכינו 30 מיליליטרים של תמיסת אגרוז נמסה נמוכה של 2%-3% ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל.לאחר הרתיחה, מיד להעביר את הבקבוק ולקרר את תמיסת אגרוז נוזלי באמבט מים 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית או הצלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ. לאחר מכן הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר על ידי שפיכה איטית של אגרוז נוזלי של 40 מעלות צלזיוס על הרקמה באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר.אגרוז מתפלמר תוך שתי דקות. לאחר הפילמור, הוסף שני מיליליטרים של מדיום מלא DMEM F-12 מחומם מראש. לאחר מכן באמצעות קונפוקל או מיקרוסקופ מולטי-פוטון המצויד במערכות דגירה מתאימות המוסברות בכתב היד, רכשו תמונות בהילוך מהיר של יום אפס עד היום הראשון.לקצירת רקמות, לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה ב- PBS סטרילי. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים כל SCAD לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטרים של 2% פרפורמלדהיד כדי לתקן את הרקמות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS לפני שתמשיכו לצביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית או תלת-ממדית כמתואר בכתב היד של הטקסט.התמונות הייצוגיות של SCADs בשדה בהיר של כל ההרכבה בימים אפס וחמישה מוצגות כאן. צביעת הטריכרום של המאסון בחתכי רקמות אנכיות חושפת חתימות של הצטלקות רקמות, כיווץ רקמות והצטברות של מטריצה חוץ-תאית בליבת הצלקת בימים אפס וחמישה. הכתם האימונופלואורסצנטי של SCADs בימים אפס וחמישה מוצגים.מצלקת בשלב מוקדם ומאוחר, הפיברובלסט החיובי המושרש מוצג בירוק ופיברובלסט שלילי מושרש באדום. עבור הדמיה תלת מימדית, הרקמות הוטמעו בתמיסת אגרוז ומעליהן PBSGT. התמונות הייצוגיות מדגימות לוקליזציה בלעדית של חלבון N-cadherin באתר הצלקת של SCAD ביום החמישי.מערך ההדמיה התלת-ממדי של קיטועי הזמן המצויד בתא דגירה הציג אירועים מוקדמים של התקדמות נחילי הפיברובלסט במהלך 12 השעות הראשונות או בשלבים המוקדמים של התפתחות הצלקת. הייצוג הגרפי של מסלולים תאיים חד-תאיים במעקב של פיברובלסטים בודדים על התפתחות צלקות מוצג כאן. חשוב מאוד למקם את רקמת ה-SCAD במהופך בתוך צלחת הבאר כך שהפאסיה תפנה כלפי מעלה.כישלון לעשות זאת יגרום לשינויים בלתי נמנעים בדפוסי ההגירה. הליך זה מאפשר לבחון שכבות עוריות לטיפולים או לתרבית באמצעות מודולטורים כימיים, נוגדנים מנטרלים או שיטות ויראליות. זה עוזר בהערכת תגובות פיברוטיות פתולוגיות במסגרות רפואיות מגוונות.הראינו את הביטוי של קונקסין-43 ו-N-cadherin כמולקולות מפתח המעורבות בגיוס החיתולית לאחר הפציעה. מתודולוגיית SCAD מאפשרת זיהוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לצמצום הצטלקות ופיברוזיס.

visualizing-scar-development-using-scad-assay-an-ex-situ-skin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

במהלך התפתחות היונקים, פצעי עור הריון מוקדמים נרפאים ללא צלקת. כאן אנו מפרטים מודל אמין וניתן לשחזור של ריפוי פצעים עובריים ללא צלקת בגב העורי של עוברי עכברים E16.5 (ללא צלקת) ו-E18.5 (צלקות).

דגם עור עכבר עוברי של תיקון פצע צלקות

היכולת לנדוד היא פונקציה מרכזית של סוגי תאים רבים ושונים, כולל תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). עם זאת, כימות שינויים ביכולת הנדידה לאחר נזק הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר בדיקת הגירה הניתנת להתאמה בקלות המשתמשת בסטטיסטיקה קפדנית כדי לכמת שינויים ביכולת הנדידה של MSC לאחר נזק.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בmacromolecular הצפיפות כדי ליצור מודל מחוץ לגוף האדם יפרטרופית רקמת צלקת הדומה בתנאים vivo. כאשר מעובדים בסביבה macromolecular צפופה, העור האנושי לגידולים התערוכה פנוטיפים, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ופונקציונלי מאפיינים דומים רקמת צלקת.

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

מתוארת מתודולוגיית הדמיית פיזור ראמאן קוהרנטית להדמיה וכימות של תרכובות תרופתיות בתוך העור. מאמר זה מתאר הכנת רקמות עור (אדם ועכבר) ויישום פורמולציה מקומית, רכישת תמונה לכימות פרופילי ריכוז מרחביים-טמפורליים, וניתוח פרמקוקינטי ראשוני להערכת אספקת תרופות מקומית.

הדמיה וכימות של תרכובות פרמצבטיות בתוך העור באמצעות הדמיית פיזור ראמן קוהרנטית

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

פרוטוקול זה יסביר כיצד לבסס מודל עכברי צלקות היפרטרופיות המגביר את איתות הטרנסדוקציה המכנית כדי לדמות צלקות דמויות אדם. שיטה זו כוללת הגברת מתח מכני על פני חתך ריפוי בעכבר ושימוש במכשיר מיוחד ליצירת רקמת צלקת מוגזמת הניתנת לשחזור לצורך ניתוחים היסטולוגיים וביואינפורמטיים מפורטים.

מודל עכבר של צלקות היפרטרופיות דמויות אדם המונעות על ידי מכניקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי לזיהוי וכימות תאים חיסוניים ולא חיסוניים בחלקי עור באמצעות SCAnED, מאקרו חינמי מבוסס ImageJ לסגמנטציה של העור.

SCAnED - מאקרו פילוח עור בקוד פתוח לזיהוי אוטומטי למחצה של תאים וגרעינים בתאי עור האפידרמיס והעור

למדו את שיטת SCAD להדמיית התפתחות צלקות בעור באמצעות ניתוח רקמת עור ופשיה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת פיברובלסטים וזיהוי אינטראקציות מולקולריות מרכזיות כמו connexin-43 ו-N-cadherin לפיתוח טיפולים חדשים נגד צלקות ופיברוזיס.

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

גלה סרטונים נוספים