טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

פלאקים עמילואיד נדרשים לאבחון מחלת אלצהיימר. עם זאת, הם לא מספיקים. למרות עובדה זו, הם נשארים חידתיים בין היתר בשל אתגרים באפיון תוכנם.

הפרוטוקול שלנו יעיל מאוד בבידוד סיבי עמילואיד בטוהר גבוה ומתאים היטב להבנת הפרטים הקטנים של מבנה והרכב. הכרת תכולת החלבון של פלאקים עמילואידיים עשויה לסייע בזיהוי המטרות של התערבות טיפולית שעשויות לעכב, להפריע או למנוע את הצטברותם. לכן, עיכוב הופעת המחלה.

שיטה זו מתאימה היטב למיצוי משקעי חלבונים מרקמות מוח מנוונות ומאגרברי חלבונים במסלולים שונים אחרים של חלבונים. התחילו על ידי הצבת אזור רקמת מוח שזה עתה נותח או נצמד בצינור של שני מיליליטר המכיל שישה עד שמונה חרוזי קרמיקה במאגר הומוגניזציה קר כקרח שהוכן זה עתה. לאחר מכן לטחון את הרקמה באמצעות הומוגנייזר טחנת חרוזים ב 4, 000 סל"ד עם שני מחזורים של 30 שניות על דופק לסירוגין.

כעת הוסיפו תשעה מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה קר כקרח למיליליטר אחד של רקמת המוח הומוגנטית וצינור 15 מיליליטר ואטם עם רצועות סרט שעווה מעבדתיות. כדי להבטיח סולוביליזציה חזקה, השאירו את הצינור מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מוסיפים סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 שומות.

מערבבים היטב וצנטריפוגה היו 250, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להחיות את הכדור בשני מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה המכיל 1.9 סוכרוז טוחן על ידי טריטורציה וצנטריפוגה ב 125, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה מעבירים את השכבה הלבנה העליונה לצינור טרי ומבודדים מיליליטר אחד של חיץ שטיפה קר כקרח על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים.

מכיוון שהכדור מועשר גם בפיברילי עמילואיד, יש להשליך את השכבה האמצעית המימית ולשלב את הכדור עם השכבה העליונה לקבלת תפוקה גבוהה יותר. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב 8, 000 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנאטנט, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ עיכול קר כקרח ולדוג בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות על מערבולת.

צנטריפוגה שוב את הדגימה, ואז לשטוף את הכדור פעמיים במיליליטר אחד של חיץ טריס קר כקרח וצנטריפוגה שוב. לאחר הכביסה השנייה, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ סולוביליזציה על ידי צנרת למעלה ולמטה ולצנטריפוגה מהירה של הצינור ב-200, 000 x g במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמרו את הכדור, ואז הפחיתו את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 לטוחנת אחת על ידי הוספת חיץ 50 מילימולאר טריס לסופרנטנט.

צנטריפוגה שוב את הסופרנטנט, ואז ממיסים את שני הכדורים ואת 100 המיקרוליטרים של מאגר Tris המכילים 0.5% SDS. עבור טיהור עמילואיד, solubilize את הכדורים העשירים עמילואיד באמצעות גלי אולטרסאונד במכשיר סוניזציה אמבטיה במשך 20 מחזורים, ולאחר מכן מיד צנטריפוגה של החומר ב 20, 000 x g במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזרו את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של 0.5% SDS Tris buffer וחזור על הכביסה ארבע פעמים נוספות, לאחר שלב הצנטריפוגה הסופי, שטפו את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מים אולטרה-אפורים וצנטריפוגה 20, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר.

ממיסים את הכדור הסופי המכיל סיבי עמילואיד מטוהרים ב-100 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים. ממיסים את 100 המיקרוליטרים המטוהרים של סיבי עמילואיד ב-400 מיקרוליטרים של מתנול ומערבולת היטב. לאחר מכן מערבבים שוב 100 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת.

לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים ומערבולת ביסודיות. לאחר צנטריפוגה ב 12, 000 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את השכבה מימית העליונה מבלי להפריע את שכבת הממשק המכילה את פתית החלבון ולהוסיף שוב את אותו נפח של מתנול. חזרו על הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הכדור באוויר.

לעיכול, ממיסים את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של חיץ גואנידין הידרוכלוריד וסוניקטים באמבט מים קרים כקרח. לאחר מכן מערבולת ביסודיות במשך 45 דקות עד שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תמיסת פעילי שטח של 0.2% ומערבולת שוב למשך 60 דקות נוספות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של 500 millimolar TCEP ולדגום במשך 60 דקות.

לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של 500 מילימולר יודואצטאמיד ודגירה בחושך במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מרווים את היודואצטאמיד עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת TCEP למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף את הנפח הנדרש של 50 מילימולר אמוניום bicarbonate תמיסה לצינור כדי להפחית את ריכוז guanidine ל 1.5 שומות.

כמו כן, הוסף תמיסת פעילי שטח של 1% לצינור. לאחר מכן מוסיפים טריפסין ומשאירים את הצינור מתערבב ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסיפו חומצה פורמית לתמיסת הפפטיד המעוכלת כדי להוריד את ה-pH ל-2.0, ואז הפעילו את עמודת הספין C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של תמיסת מתנול של 50% וסיבוב ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שיפרו את מצעי השרף של עמוד C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של חיץ שיווי משקל וסיבוב שוב במשך שתי דקות. לאחר שיווי המשקל, טענו את תמיסת הפפטיד החומצי על עמודת C18 ואת הצנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. טען מחדש את הזרימה, סובב את העמודה והשליך את הזרימה השנייה.

לאחר מכן יש לשטוף את הפפטידים הקשורים לשרף C18 פעמיים עם מאגר הכביסה. אלקט את הפפטיד שלוש פעמים על ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון וצנטריפוגה בעמודה. מייבשים את הפפטידים ברכז ואקום מהיר על ידי אידוי התמיסה המימית.

את הכדורים היבשים ניתן לשמור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני ניתוח הטרשת הנפוצה. הכתם האדום של קונגו של עמילואידים מטוהרים מתעד את העשרת סיבי העמילואיד בהשוואה לחלק המסיס של SDS. השבר המסיס SDS לא הראה נוכחות של עמילואידים.

המבנה של הפיברילים המטוהרים אישר את נוכחותם של סיבי עמילואיד כמעט טהורים. כמו כן, תיוג אימונוגולד אישר את נוכחותם של פפטידי עמילואיד בטא-42. צביעה באמצעות נוגדנים נגד עמילואיד בטא-42 ונוגדני אנטי-פיבריל הראתה שפע יחסי של פפטידי עמילואיד בטא-42 בפיברילים.

שברי עמילואיד מטוהרים הראו נוכחות של כ-250 חלבונים, בעוד שהשבר שנאסף לפני האולטרה-סוניקציה ושטיפת ה-SDS הכיל יותר מ-2, 500 חלבונים. ליבות פיבריל הראו העשרה של חלבונים הקשורים לקומפלקסים אברוניים וסופראמולקולריים שאינם קשורים ל-mmbrane. עמילואידים הם מינים בעלי שפע נמוך, אולי כמה פיקוגרמות עד כמה מיקרוגרמים למיליגרם של רקמות מוח.

אז אתה צריך להיות זהיר מאוד בעת איסוף השכבות, משטחים או השלכת supernatant. עם התפתחות טכניקה זו, כעת ניתן לזהות בביטחון רב יותר חלבונים הקשורים לזרעי העמילואיד הראשוניים, לאפיין את המבנה שלהם ולכוון אותם להתערבות טיפולית. לכן, מניעת הופעת המחלה הקטלנית הזו.