Name: טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למד שיטה ביוכימית לטיהור ליבות פיבריל עמילואידיות מרקמת מוח באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגה. השיטה מאפשרת אפיון פרוטאומי מדויק לזיהוי מטרות טיפוליות במחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AG061865 ל- R.J.V. ו- J.N.S. המחברים מודים לחברי קבוצת המחקר ואסאר וסאבאס באוניברסיטת נורת'ווסטרן על דיוניהם המהורהרים. אנו גם מודים מקרב לב לד"ר(ים). אנסגאר סימר וראלף לאנגן באוניברסיטת דרום קליפורניה על התשומות המכריעות שלהם. אנו מודים לד"ר פארידה קורבובה על הכנת דגימות והדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים מכתימה שלילית במרכז למיקרוסקופיה מתקדמת של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

<ol><li>Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li>
<li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils%3A+abnormal+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li>
<li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease%3A+New+clues%2C+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li>
<li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).</li>
<li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+CardioOncology%22%5BJournal%5D)">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li>
<li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li>
<li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+brain+A%CE%B2+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li>
<li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+toxicity+of+A%CE%B2-%281-42%29+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li>
<li>Lu, J. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+%CE%B2-amyloid+fibrils+in+Alzheimer%27s+disease+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li>
<li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics.+Neuromethods%22">Neuroproteomics. Neuromethods</a>. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).</li>
<li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).</li>
<li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure%3A+conformational+diversity+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li>
<li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+%26+imperfect+ageing%3A+Technological+limitations+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).</li>
<li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li>
<li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+polymorphism%3A+almost+identical+on+the+atomic+level%2C+mesoscopically+very+different%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li>
<li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699(2018).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+polymorphism%3A+Structural+basis+and+neurobiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li>
<li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+Amyloid+%CE%B2+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591(2022).</li>
<li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li>
<li>Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-%CE%B2+peptide+and+other+amyloid+proteins%3A+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li>
<li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington%27s+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li>
<li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible%2C+specific%2C+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li>
<li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).</li>
<li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li>
<li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li>
<li>Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+Alzheimer%27s+%CE%B2-amyloid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li>
<li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+spatial+A%CE%B2+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer%27s+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li>
<li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פיתוח הבנה ברורה של המבנה וההרכב של עמילואידים מאתגר עבור ביולוגים מבניים וביוכימאים בשל המורכבות הביולוגית והמגבלות הניסוייות בחילוץ פיברילים מטוהרים מרקמות מוח AD 16,17. סיבי עמילואיד הם פולימורפיים ברמה המולקולרית, ומראים אוכלוסייה הטרוגנית באורכים ובמורכבויות שונות18,19. כדי להבין טוב יותר את התכונות הביולוגיות שלהם ואת הרלוונטיות הפתולוגית שלהם, נדרש אפיון ממצה של הרכב של פיברילי עמילואיד פולימורפיים...

עמילואיד הוא סידור סופראמולקולרי יציב ביותר שנמצא בפאנל מגוון של חלבונים, שחלקם מובילים לשינויים פתולוגיים1. הצטברות של אגרגטים עמילואידיים תוך או חוץ-תאיים נצפית במספר מחלות נוירודגנרטיביות2. אגרגטי עמילואיד הם הטרוגניים ומועשרים במספר רב של חלבונים ושומנים3. בשנים האחרונות, העניין בפרוטאום העמילואידי עורר עניין רב בקרב מדעני מוח בסיסיים ותרגומים. מספר שיטות פותחו כדי לחלץ ולטהר אגרגטים עמילואידיים מרקמות מוח אנושיות של עכברים ופוסט-מורטם. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, מיצוי חיסוני, דה-תאיזציה ובידוד ביוכימי של אגרגטים עמילואידיים הן שיטות נפוצות לחילוץ וטיהור של פלאקים עמילואידים, פיברילים ואוליגומרים 4,5,6,7. רבים מהמחקרים האלה התמקדו בקביעת הרכב החלבון של מרבצי הפיברילארים הדחוסים האלה באמצעות טרשת נפוצה כמותית למחצה. עם זאת, התוצאות הזמינות אינן עקביות, והמספר הגדול באופן מפתיע של חלבונים המטהרים יחד שדווחו בעבר מאתגר לפענוח.
המגבלה העיקרית של הספרות הקיימת המתארת את הפרוטאום של ליבת העמילואיד במוחות של עכברי AD ו-AD היא שהחומר המטוהר מכיל מספר בלתי ניתן לניהול של חלבונים המטהרים יחד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להתגבר על מגבלה זו ולפתח טיהור ביוכימי חזק לבידוד ליבות פיבריל עמילואידיות. אסטרטגיה זו משתמשת בשיטה ביוכימית מבוססת אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות סוכרוז שתוארה קודם לכן לבידוד של שברים עמילואידים מועשרים בלתי מסיסים של SDS מרקמות מוח של אדם ועכבר AD שלאחר המוות 8,9. שיטה זו מתבססת על הספרות הקיימת, אך מרחיקת לכת יותר עם אולטרה-סוניזציה ושטיפות SDS כדי להסיר את רוב החלבונים הקשורים לעמילואיד הקשורים באופן רופף, מה שמוביל לבידוד של סיבי עמילואיד מטוהרים מאוד (איור 1). הפיברילים המטוהרים על ידי פרוטוקול זה מתגברים על מספר אתגרים קיימים שנתקלים בהם לעתים קרובות במחקרים מבניים של סיבי עמילואיד המבודדים מתמציות מוח. הדמיה של הפיברילים האלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מאשרת את השלמות והטוהר של החומר המטוהר (איור 2). במחקר זה, הפיברילים המבודדים עוברים בדידות ומעוכלים לפפטידים עם טריפסין, וניתוח טרשת נפוצה ללא תווית יכול לחשוף בקלות את זהות החלבונים היוצרים את ליבת הפיבריל. יש לציין כי לחלק מחלבונים אלה יש נטייה מובנית ליצור מכלולים סופראמולקולריים באברונים שאינם קשורים לממברנה. בנוסף, רבים מהחלבונים שזוהו בניתוח של פיברילי עמילואיד-בטא (Aβ) קשורים גם למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, מה שמרמז על כך שחלבונים אלה עשויים למלא תפקיד מפתח בפרוטאינופתיות מרובות.
סביר להניח ששיטת SDS/אולטרה-סוניקציה זו לא תשנה או תשבש את מבנה ליבות הפיבריל. החומר המטוהר מתאים גם למגוון רחב של גישות אנליזה פרוטאומיות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה ולאסטרטגיות ניתוח מבניות נוספות המבוססות על טרשת נפוצה, כגון הצלבה כימית או חילופי מימן-דאוטריום. ההתאוששות הכוללת בשיטה זו גבוהה יחסית, ולכן מתאימה למחקרים מבניים מפורטים, הדורשים מיקרוגרם למיליגרם של החומר המטוהר. החומר המטוהר מתאים גם למחקרים מבניים באמצעות cryoEM ומיקרוסקופיית כוח אטומי. פרוטוקול זה, בשילוב עם התווית האיזוטופית היציבה של יונקים, יכול להקל על מחקרי תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (NMR) של מבנה עמילואיד10.

<table><tbody><tr><td>שבחים PepMap 100 C18 עמודת HPLC 0.075 מ"מ x 20&nbsp; mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164535</td><td>ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עמילואיד בטא (1-16) 6E10 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>803001</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עמילואיד בטא (17-24) נוגדן 4G8</td><td>Biolegend</td><td>800701</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עמילואיד בטא (N terminus 82E1) נוגדן</td><td>IBL America</td><td>10323</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן LOC סיבי עמילואיד</td><td>&nbsp; EMD Millipore</td><td>AB2287</td><td></td></tr><tr><td>ערכת BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; C1016</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>הושלם&nbsp; קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>HyperSep C18 מחסניות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60108-302</td><td></td></tr><tr><td>צינור פרוטאומיקה משולב - IP2&nbsp;</td><td>http://www.integratedproteomics.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>יודואצטמיד (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>K54 מערכת הומוגניזציה של רקמות מנוע</td><td>קול פארמר</td><td>Glas-Col 099C</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ערכת מיקרו BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nanoviper 75 &mu; מטר x 50&nbsp; cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164942</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>BR-8101P-E</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribridספקטרומטר מסה</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 עמודי ספין Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 הומוגנייזר רקמות</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>ProteaseMAX(TM) פעילי שטח טריפסין משפר</td><td>Promega</td><td>V2072</td><td></td></tr><tr><td>RawConverter</td><td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נתרן אזיד</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75002446 מהירות ואקום רכז</td><td>Labconco</td><td>7315021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold-Mass מפרט כיתה</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>ULTIM3000RSLCNANO</tr></tbody></table>

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

תכלילי פיברילאר חלבוניים הם סימני היכר פתולוגיים מרכזיים של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות. בשלבים המוקדמים של מחלת האלצהיימר (AD), פפטידים עמילואיד-בטא יוצרים פרוטופיברילים במרחב החוץ-תאי, המשמשים כזרעים הגדלים בהדרגה ומתבגרים לתוך פלאקים גדולים של עמילואיד. למרות ההבנה הבסיסית הזו, הידע הנוכחי על מבנה העמילואיד פיבריל, הרכב ודפוסי התצהיר במוח מוגבל. אחד המחסומים העיקריים היה חוסר היכולת לבודד פיברילי עמילואיד מטוהרים מאוד מתמציות מוח. גישות מבוססות מיקרו-דיסקציה של טיהור זיקה ולכידת לייזר שימשו בעבר לבידוד עמילואידים, אך הן מוגבלות על ידי הכמות הקטנה של החומר שניתן לשחזר. פרוטוקול חדשני וחזק זה מתאר את הטיהור הביוכימי של ליבות פלאק עמילואיד באמצעות סולוביליזציה של נתרן דודציל סולפט (SDS) עם אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות סוכרוז ואולטרה-סוניקציה, ומניב פיברילים טהורים ביותר מחולי AD ומדגמי AD רקמות מוח. ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה (MS) מלמטה למעלה של החומר המטוהר מייצג אסטרטגיה חזקה לזיהוי כמעט כל מרכיבי החלבון העיקריים של פיברילי עמילואיד. מחקרים פרוטאומיים קודמים על חלבונים בעמילואיד קורונה חשפו אוסף גדול באופן בלתי צפוי ומגוון מבחינה תפקודית של חלבונים. יש לציין כי לאחר זיקוק אסטרטגיית הטיהור, מספר החלבונים המטהרים במשותף הופחת ביותר מפי 10, מה שמעיד על הטוהר הגבוה של החומר הבלתי מסיס SDS המבודד. כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרונים אימונו-זהב אפשרו אישור לטוהר ההכנות הללו. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את התכונות המרחביות והביולוגיות התורמות לתצהיר חלבונים אלה לתכלילי עמילואיד. יחד, אסטרטגיה אנליטית זו ממוקמת היטב כדי להגביר את ההבנה של ביולוגיה עמילואידית.

כאן מסוכמת שיטה מפורטת לבידוד וטיהור של פיברילים עמילואידיים באמצעות שיטת טיהור אולטרה-צנטריפוגציה של צפיפות סוכרוז שעברה שינוי (ראו איור 1). החידוש בשיטה זו הוא הכללת שלבים של שטיפה מבוססת אולטרה-סוניקציה באמצעות מערכת סוניקציה של אמבטיית מים ואחריה SDS solubilization, אשר מסירה חלבונים רבים הקשורים באופן רופף מסיבי העמילואיד המטהרים יחד עם הפיברילים הצפופים והנקיים ביותר. שלב האולטרה-סוניקציה מייצר כוח גזירה גבוה ומתסיס את הפיברילים, משחרר את הכוחות ההידרופוביים ומשחרר את החלבונים המסיסים ...

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

פלאקים עמילואיד נדרשים לאבחון מחלת אלצהיימר. עם זאת, הם לא מספיקים. למרות עובדה זו, הם נשארים חידתיים בין היתר בשל אתגרים באפיון תוכנם.הפרוטוקול שלנו יעיל מאוד בבידוד סיבי עמילואיד בטוהר גבוה ומתאים היטב להבנת הפרטים הקטנים של מבנה והרכב. הכרת תכולת החלבון של פלאקים עמילואידיים עשויה לסייע בזיהוי המטרות של התערבות טיפולית שעשויות לעכב, להפריע או למנוע את הצטברותם. לכן, עיכוב הופעת המחלה.שיטה זו מתאימה היטב למיצוי משקעי חלבונים מרקמות מוח מנוונות ומאגרברי חלבונים במסלולים שונים אחרים של חלבונים. התחילו על ידי הצבת אזור רקמת מוח שזה עתה נותח או נצמד בצינור של שני מיליליטר המכיל שישה עד שמונה חרוזי קרמיקה במאגר הומוגניזציה קר כקרח שהוכן זה עתה. לאחר מכן לטחון את הרקמה באמצעות הומוגנייזר טחנת חרוזים ב 4, 000 סל"ד עם שני מחזורים של 30 שניות על דופק לסירוגין.כעת הוסיפו תשעה מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה קר כקרח למיליליטר אחד של רקמת המוח הומוגנטית וצינור 15 מיליליטר ואטם עם רצועות סרט שעווה מעבדתיות. כדי להבטיח סולוביליזציה חזקה, השאירו את הצינור מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מוסיפים סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 שומות.מערבבים היטב וצנטריפוגה היו 250, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להחיות את הכדור בשני מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה המכיל 1.9 סוכרוז טוחן על ידי טריטורציה וצנטריפוגה ב 125, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה מעבירים את השכבה הלבנה העליונה לצינור טרי ומבודדים מיליליטר אחד של חיץ שטיפה קר כקרח על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים.מכיוון שהכדור מועשר גם בפיברילי עמילואיד, יש להשליך את השכבה האמצעית המימית ולשלב את הכדור עם השכבה העליונה לקבלת תפוקה גבוהה יותר. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב 8, 000 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנאטנט, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ עיכול קר כקרח ולדוג בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות על מערבולת.צנטריפוגה שוב את הדגימה, ואז לשטוף את הכדור פעמיים במיליליטר אחד של חיץ טריס קר כקרח וצנטריפוגה שוב. לאחר הכביסה השנייה, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ סולוביליזציה על ידי צנרת למעלה ולמטה ולצנטריפוגה מהירה של הצינור ב-200, 000 x g במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמרו את הכדור, ואז הפחיתו את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 לטוחנת אחת על ידי הוספת חיץ 50 מילימולאר טריס לסופרנטנט.צנטריפוגה שוב את הסופרנטנט, ואז ממיסים את שני הכדורים ואת 100 המיקרוליטרים של מאגר Tris המכילים 0.5% SDS. עבור טיהור עמילואיד, solubilize את הכדורים העשירים עמילואיד באמצעות גלי אולטרסאונד במכשיר סוניזציה אמבטיה במשך 20 מחזורים, ולאחר מכן מיד צנטריפוגה של החומר ב 20, 000 x g במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזרו את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של 0.5% SDS Tris buffer וחזור על הכביסה ארבע פעמים נוספות, לאחר שלב הצנטריפוגה הסופי, שטפו את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מים אולטרה-אפורים וצנטריפוגה 20, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר.ממיסים את הכדור הסופי המכיל סיבי עמילואיד מטוהרים ב-100 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים. ממיסים את 100 המיקרוליטרים המטוהרים של סיבי עמילואיד ב-400 מיקרוליטרים של מתנול ומערבולת היטב. לאחר מכן מערבבים שוב 100 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת.לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים ומערבולת ביסודיות. לאחר צנטריפוגה ב 12, 000 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את השכבה מימית העליונה מבלי להפריע את שכבת הממשק המכילה את פתית החלבון ולהוסיף שוב את אותו נפח של מתנול. חזרו על הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הכדור באוויר.לעיכול, ממיסים את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של חיץ גואנידין הידרוכלוריד וסוניקטים באמבט מים קרים כקרח. לאחר מכן מערבולת ביסודיות במשך 45 דקות עד שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תמיסת פעילי שטח של 0.2% ומערבולת שוב למשך 60 דקות נוספות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של 500 millimolar TCEP ולדגום במשך 60 דקות.לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של 500 מילימולר יודואצטאמיד ודגירה בחושך במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מרווים את היודואצטאמיד עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת TCEP למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף את הנפח הנדרש של 50 מילימולר אמוניום bicarbonate תמיסה לצינור כדי להפחית את ריכוז guanidine ל 1.5 שומות.כמו כן, הוסף תמיסת פעילי שטח של 1% לצינור. לאחר מכן מוסיפים טריפסין ומשאירים את הצינור מתערבב ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסיפו חומצה פורמית לתמיסת הפפטיד המעוכלת כדי להוריד את ה-pH ל-2.0, ואז הפעילו את עמודת הספין C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של תמיסת מתנול של 50% וסיבוב ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שיפרו את מצעי השרף של עמוד C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של חיץ שיווי משקל וסיבוב שוב במשך שתי דקות. לאחר שיווי המשקל, טענו את תמיסת הפפטיד החומצי על עמודת C18 ואת הצנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. טען מחדש את הזרימה, סובב את העמודה והשליך את הזרימה השנייה.לאחר מכן יש לשטוף את הפפטידים הקשורים לשרף C18 פעמיים עם מאגר הכביסה. אלקט את הפפטיד שלוש פעמים על ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון וצנטריפוגה בעמודה. מייבשים את הפפטידים ברכז ואקום מהיר על ידי אידוי התמיסה המימית.את הכדורים היבשים ניתן לשמור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני ניתוח הטרשת הנפוצה. הכתם האדום של קונגו של עמילואידים מטוהרים מתעד את העשרת סיבי העמילואיד בהשוואה לחלק המסיס של SDS. השבר המסיס SDS לא הראה נוכחות של עמילואידים.המבנה של הפיברילים המטוהרים אישר את נוכחותם של סיבי עמילואיד כמעט טהורים. כמו כן, תיוג אימונוגולד אישר את נוכחותם של פפטידי עמילואיד בטא-42. צביעה באמצעות נוגדנים נגד עמילואיד בטא-42 ונוגדני אנטי-פיבריל הראתה שפע יחסי של פפטידי עמילואיד בטא-42 בפיברילים.שברי עמילואיד מטוהרים הראו נוכחות של כ-250 חלבונים, בעוד שהשבר שנאסף לפני האולטרה-סוניקציה ושטיפת ה-SDS הכיל יותר מ-2, 500 חלבונים. ליבות פיבריל הראו העשרה של חלבונים הקשורים לקומפלקסים אברוניים וסופראמולקולריים שאינם קשורים ל-mmbrane. עמילואידים הם מינים בעלי שפע נמוך, אולי כמה פיקוגרמות עד כמה מיקרוגרמים למיליגרם של רקמות מוח.אז אתה צריך להיות זהיר מאוד בעת איסוף השכבות, משטחים או השלכת supernatant. עם התפתחות טכניקה זו, כעת ניתן לזהות בביטחון רב יותר חלבונים הקשורים לזרעי העמילואיד הראשוניים, לאפיין את המבנה שלהם ולכוון אותם להתערבות טיפולית. לכן, מניעת הופעת המחלה הקטלנית הזו.

biochemical-purification-proteomic-characterization-amyloid-fibril

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי...

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לבידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת מוח של עכבר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ועיכול של חלבונים שאינם עמילואידים.

בידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת המוח

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של אלפא-סינוקלאין (α-syn) שהופך ליותר ויותר בלתי מסיס/מצטבר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות ניצול חוצצים עם חוזק חומר ניקוי הולך וגובר וטכניקות אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה, ניתן לבחון את המאפיינים המשתנים של צבירת α-syn ברקמות חולה ולא חולות.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

למד שיטה ביוכימית לטיהור ליבות פיבריל עמילואידיות מרקמת מוח באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגה. השיטה מאפשרת אפיון פרוטאומי מדויק לזיהוי מטרות טיפוליות במחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

גלה סרטונים נוספים