Name: ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למדו לייצר נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בטיטר גבוה מנוזל אלנטואי באמצעות סינון זרימה משיקתית. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לטיהור וכימות NDV לשימוש במחקרי בעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.G.E.Y זכה במלגת דוקטורט של הקולג' הווטרינרי של אונטריו ובמלגת בוגרים של אונטריו. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה מענקי תגלית ל- SKW (מענק #304737) ו- LS (מענק #401127).

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
<li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).</li>
<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).</li>
<li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li>
<li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines%3A+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li>
<li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+allergies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).</li>
<li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus%3A+time+to+celebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li>
<li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li>
<li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Axis-Shield+OptiPrepTM+The+ideal+density+gradient+medium+for+isolation+of+blood+cells%22">Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells</a>. , (2020).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
<li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

וירוסים המשמשים כחומרים טיפוליים במחקרים פרה-קליניים חייבים להיות מטוהרים מאוד כדי למנוע רעילות כאשר הם ניתנים in vivo15. אם סוכנים הרפתקנים או מזהמים אינם מוסרים, זה יכול להוביל לתגובות שליליות חמורות השוללות את ההשפעה הטיפולית של הסוכן הנגיפי28. מכיוון ש-NDV מיוצר בביצי תרנגולת עובריות, ישנם מספר חלבוני ביצה מזהמים, כגון אליפסה, שיש להסירם לפני השימוש בו in vivo במודלים פרה-קליניים או קליניים29. גם לאחר טיהור אינטנסיבי, ovalbumin ...

נגיף מחלת ניוקאסל, הידוע גם בשם Avian Orthoavulavirus-1, הוא עטוף פרמיקסווירוס עופות בעל פוטנציאל לשמש הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי 1,2,3,4,4,5,6,7. לאחרונה, NDV שתוכנן לבטא את חלבון הספייק של SARS-CoV-2 אופיין כחיסון תוך-ורידי יעיל במודלים של אתגר עכברים ואוגרים 7,8,9. כאשר משתמשים בה כאימונותרפיה של סרטן, היא גורמת לגיוס של תאי חיסון מולדים, במיוחד תאי הרג טבעיים, ייצור של אינטרפרון מסוג I, ויצירת תאי T ספציפיים לאנטי-סרטניים 10,11,12,13. בנוסף לתכונות אימונוסטימולטוריות חזקות אלה, ל- NDV יש פרופיל בטיחות חזק ומערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב 14,15. מאפיינים רצויים אלה הניעו את הערכת NDV בניסויים קליניים פרה-קליניים ובני אדם רבים (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. כדי לקדם עוד יותר את הווקטור הנגיפי המבטיח והמעורר חיסון הזה, יש צורך בשיטות מפורטות לייצור וטיהור של NDV גבוה וטהור במיוחד, שניתן לתת בבטחה in vivo.
כמו NDV הוא paramyxovirus עופות, הוא מוגברת לעתים קרובות ביותר ביצי תרנגולת עוברי. אמנם קיימות מערכות מבוססות תאים להפצת NDV, אך רובן לא הצליחו לייצר טיטרים דומים לאלה שהושגו בביצי תרנגולת עובריות18. עם זאת, ישנם כמה חסרונות בייצור NDV בביצים, כולל העובדה כי הייצור מבוסס ביצים הוא ארוך ולא ניתן להרחבה בקלות, מיקור כמויות גדולות של ביצי עוף SPF יכול להיות בעייתי, וקיים פוטנציאל לזיהום עם אלרגנים ביצים 13,18,19,20 . לאחרונה, קבוצה אחת הראתה שתאי Vero שגדלו בתרחיף במדיום ללא סרום יכולים לתמוך בשכפול של NDV לטיטרים דומים לאלה שהושגו בביצים, לפני טיהור21. עם זאת, זה דרש העברה סדרתית של הנגיף כדי להתאים את הנגיף לתאי Vero, ואת האופטימיזציה של שיטה לטהר NDV מתאי Vero השעיה עדיין נדרש21.
כפי שהודגש קודם לכן, השיטות המשמשות לטיהור נגיף בדרגה גבוהה, בדרגה in vivo משתנות בהתאם לנגיף המדובר22. קיימת מערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב הזמינה ליצירת NDV רקומביננטי. תהליך זה, הכולל שימוש בשיבוט cDNA, פלסמידים מסייעים ונגיף עוזר המבטא T7 RNA פולימראז, תואר בעבר בפירוט15,23. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על NDV לנטוגני או מזוגני. הנגיף המתואר בפרוטוקול זה הוא NDV מזוגני רקומביננטי המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea victoria המוחדרת בין גנים נגיפיים P ו-M כיחידת שעתוק בודדת, שכן זה תואר בעבר כאתר האופטימלי להחדרת טרנסגנים זרים24.
שיטות סגורות מתארות את הטיהור של NDV על סמך גודלו, הנע בין 100 ל-500 ננומטר, וצפיפותו15. זה איפשר יצירת מלאי NDV בדרגה in vivo, עם טיטר גבוה, תוך כ-3 שבועות, החל מרגע קבלת הביצים ועד לקבלת טיטר סופי. מתוארות טכניקות המשמשות לעתים קרובות בייצור בקנה מידה גדול של וירוסים מבוססי ביצים כגון סינון זרימה משיק, סינון עומק ואולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמאפשר תרגום של שיטות אלה לייצור בקנה מידה גדול יותר. טכניקות שתוארו בעבר לטיהור NDV שופרו על ידי שילוב של מאגר מייצב וירוסים, שימוש ביודיקסנול במהלך אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, ותיאור של אמצעי בקרת איכות שונים כדי להבטיח איכות בדרגה in vivo 15. זה איפשר טיהור של NDV בדרגה in vivo המגיע לטיטרסים עד 3 × 1010 10 PFU/mL מ-0.8 ל-1.0 ליטר של נוזל אלנטואי.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>HyClone</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק קצה החלקה</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק Luer-Lok</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10% תמיסת יוד פובידון</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>תרמו-פישר</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 במחט מילוי קהה</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 במחט גלישה</td><td>מדויקת BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם x 5/8 במחט</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>תרמו-פישר</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% אקרילאמיד/תמיסת ביס 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד-PBS</td><td>תרמו-פישר</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת תרבית רקמות - גריינר תחתון שטוח</td><td>Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית,</td><td>תרמו-פישר</td> קרחוני <td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 עז-אנטי-עכבר</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 צנטריפוגה</td><td>בקמן Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים רחבים ולא משוננים</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק קלטות Centramate</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Diet Gel Recovery</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td><td>ברי היל</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>נרות ביצה</td><td>ברי היל</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), pH 8.0, 0.5 מ' ב-H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי טי הברגה נקבה, ניילון, 1/8 אינץ' NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים בעלי דיוק גבוה Fine Point</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>אין צורך אם לא מבצע IFA או אם NDV אינו מקודד חלבון פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX ג'ל Imager</td><td>Syngene</td><td></td><td>הדמיה של ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>תרמו-פישר</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>תרמו-פישר</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טרנסקריפטאז הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>תרמו-פישר</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז גבוה Dulbecco Essential</td><td>Medium Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת לחות</td><td>ברי היל</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>יודיקסנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D1556</td><td>תמיסה של 60% (w/v) של יודיקסנול במים (סטרילי)</td></tr><tr><td>L-ליזין מונוהידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>זכר ונקבה Luer-Lok A 1/8 בחוט צינור לאומי, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S כונן דיגיטלי</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>משאבה פריסטלטית עם תצוגה דיגיטלית</td></tr><tr><td>Masterflex L/S ראש משאבת עומס קל לצינורות דיוק</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון Masterflex (פלטינה) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm סיליקון מרפא פלטינום</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>תרמו-פישר</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>מיני פרוטיאן טטרה תא</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE יצוק ופועל appartus</td></tr><tr><td>עכבר-אנטי-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>שיבוט 6H12</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>אומגה ממברנה LV Centramate קלטת, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A מיני ג'ל מערכת אלקטרופורזה</td><td>תרמו-פישר</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X פתרון</td><td>תרמו-פישר</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול) ממוצע Mn 20,000</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>דגם 1655050 - עבור אלקטרופורזה ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp RNA ויראלי מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer קלטת דיאליזה (חוזק נוסף), 10,000 MWCO 0.5-3 מ"ל</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (כדורים)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>ביצים ספציפיות ללא פתוגן</td><td>CFIA</td><td>NA</td><td>הספק ישתנה בהתאם למיקום</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 מסנן עומק</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td> <td>כירורגייםThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>331362</td><td>בשימוש בפרוטוקול שלב 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>מתאם SxX4750 לצינורות תחתונים קונסיאליים</td><td>בקמן קולטר</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה אולטרה-ברורים בעלי דופן דקה ( 9/16 אינץ' x 3 1/2 אינץ')</td> <td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris בסיס</td><td>תרמו-פישר</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>מהדק בורג צינורות</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>מדי לחץ שירות</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הידוע גם בשם אורתובולה עופות serotype-1, הוא נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי שפותח הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי. NDV הוא סוכן טיפולי ומניעה אטרקטיבי בשל מערכת הגנטיקה ההפוכה המבוססת היטב שלו, תכונות אימונוסטימולטוריות חזקות ופרופיל בטיחות מעולה. כאשר הוא ניתן כנגיף אונקוליטי או כחיסון בעל וקטור נגיפי, NDV מעורר תגובה חיסונית חזקה של אנטיטומור או אנטיגן ספציפי, ומפעיל הן את הזרוע המולדת והן את הזרוע הנרכשת של מערכת החיסון. 
בהתחשב במאפיינים רצויים אלה, NDV הוערך בניסויים קליניים רבים והוא אחד הנגיפים האונקוליטיים הנחקרים ביותר. נכון לעכשיו, ישנם שני ניסויים קליניים רשומים הכוללים NDV: אחד המעריך חיסון רקומביננטי בעל וקטור NDV עבור SARS-CoV-2 (NCT04871737), והשני מעריך קידוד NDV רקומביננטי אינטרלוקין-12 בשילוב עם Durvalumab, נוגדן antiPD-L1 (NCT04613492). כדי להקל על התקדמות נוספת של הווקטור הנגיפי המבטיח ביותר הזה, יש צורך בשיטות פשוטות ליצירת NDV רקומביננטי (rNDV) ברמה גבוהה, בדרגה in vivo. 
מאמר זה מתאר הליך מפורט להגברת rNDV בביצי עוף עובריות ללא פתוגנים (SPF) וטיהור rNDV מנוזל אלנטואי, עם שיפורים להפחתת האובדן במהלך הטיהור. כמו כן נכללים תיאורים של מבחני בקרת האיכות המומלצים, אשר יש לבצע כדי לאשר חוסר מזהמים ושלמות הנגיף. באופן כללי, הליך מפורט זה מאפשר סינתזה, טיהור ואחסון של NDV ברמה גבוהה, בדרגה in vivo, רקומביננטית, לנטוגנית ומזוזנית לשימוש במחקרים פרה-קליניים.

קצירת נוזל אלנטואי מכיוון שנוזל אלנטואי נקטף מביצי תרנגולת עובריות, הוא צריך להיראות ברור ושקוף. אם הנוזל נראה אטום וצהוב, הדבר מצביע על נוכחות של מזהמים. הכללת נוזל אלנטואי זה במהלך הטיהור תעכב את תהליך הטיהור, שכן הלחץ יעלה במהירות ויעלה על 10 psi, וכתוצאה מכך גזירה של הנגיף ואובדן של וירוס זיהומיות. נוזל אלנטואי שנראה מדמם מצביע על כך שהביצים חוסנו עם יותר מדי PFU של הנגיף. התשואה מקבוצה זו של ביצים תהיה נמוכה משמעותית מהצפוי ואין זה סביר כי וירוס זה יוכל לשמש in vivo. ביציות שחוסנו ב-NDV...

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי > 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

פרוטוקול זה מתווה את הטכניקות המשמשות לייצור וירוס מחלת ניוקאסל, כך שניתן יהיה לתת אותו בבטחה לעכברים ולבעלי חיים אחרים כגון אוגרים וכבשים. השימוש בסינון זרימה משיק מאפשר עיבוד יעיל יותר של נפחי התחלה גדולים בהשוואה להליכים קיימים המשתמשים בתהליכי צנטריפוגה בלבד. זהו הליך ארוך הכולל מספר שלבים מורכבים, כלומר ניהול זמן עשוי להוות בעיה.הייתי ממליץ לזהות את כל שלבי ההשהיה הפוטנציאליים כך שניתן יהיה לפצל את הטכניקה כראוי, ולמזער את הלחץ. מי שידגים את ההליך הזה יהיה אלכס, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. עבור טיהור של וירוס מחלת ניוקאסל או NDV, ראשית, ראש מערכת הניסוי שנקבעה בעבר על ידי הפעלת 50 מיליליטרים של PBS דרכה.עצור את המשאבה כאשר כחמישה מיליליטרים של PBS נשארים בצינור. לאחר מכן, חברו מסנן עומק עם דירוג שימור מיקרומולרי אחד עד שלושה לצינורות. כדי לאוורר את המסנן, הסר את המכסה השני בצד האפי של מסנן העומק ולאחר מכן התחל להריץ 50 מיליליטרים נוספים של PBS דרך המערכת.ברגע שה-PBS מתחיל לזרום דרך פתח האוורור שבראש המסנן, סגרו את היציאה והמשיכו לזרום PBS דרך הקווים. לאחר מכן להחליף את כלי הפסולת עם כלי איסוף סטרילי חדש ולהתחיל להריץ נוזל Allantoic דרך מסנן העומק. לאחר מכן, הגדר את סינון הזרימה המשיקה או את מערכת ה- TFF באישור פתוח והפעל כמתואר בכתב היד.כאשר נותרו במאגר כחמישה מיליליטרים של נוזל, השהו את המשאבה והוסיפו למאגר נוזל אלנטואי מסונן לעומק. לאחר מכן לחדש את זרימת המשאבה. כדי למנוע גזירה של הנגיף, חשוב לוודא כי הלחץ של המערכת לא יעלה על 10 פאונד כוח לכל אינץ 'מרובע.כדי להגביר את האשליה, יש להשתמש בשילוב של מהירות המשאבה הפריסטלטית ומהדק C. 150 עד 100 מיליליטרים של נוזל אלנטואי נשארים במאגר, משהים את המשאבה ומחליפים את החיץ על ידי הוספת 150 עד 200 מיליליטרים של מאגר ML. שוב, השהה את המשאבה כאשר חמישה עד 10 מיליליטרים של נוזל נשארים במאגר, ולאחר מכן באמצעות שני מהדקי C לסגור את קו המותניים.שחררו את הקו המחודש המזין את המאגר והכניסו אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן לחדש את הזרימה ולהשהיה כאשר נותרו כמה טיפות של נוזל במיכל המאגר. לאחר מכן, הסר את מהדקי ה- C מקווי הפסולת וחבר מחדש את קו ההזנה המחודש למיכל המאגר.בינתיים, כדי להתכונן לשיפוע צפיפות יודיקסנול אולטרה-צנטריפוגציה, הוסיפו תחילה 0.5 מיליליטר של 40% יודיקסנול לצינור אולטרה צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה 13.2 מיליליטר פתוח על הקיר הדק. לאחר מכן להכין את העמודה עם תוספות עוקבות של 2.5 מיליליטרים של 20% יודיקסנול, ו -2.5 מיליליטרים של 10% יודיקסנול. לפני ultracentrifugation, יש להוסיף בזהירות שישה עד 6.5 מיליליטרים של תמיסת הנגיף הנרמזת ממערכת TFF לעמודת היודיקסנול מבלי להפריע לשיפוע.לאחר ultracentrifugation, להסיר את הצינורות עם זוג מלקחיים סטריליים. רצועת היעד צריכה להיות פס גדול בין שיפועים של 10% ל-20%. לאחר מכן, להשעות את הצינור מעל החלק העליון של הכוס באמצעות מעמד retort.לאחר מכן, חברו מחט בקוטר 1.5 אינץ' של 18 מד למזרק של חמישה מיליליטר ואז נקבו את הצד של צינור האולטרה-צנטריפוג' עם המחט והסירו את רצועת המטרה על ידי הארכה איטית של הבוכנה. לאחר הסרת יודיקסנול מתמיסת הנגיף כפי שמתואר בכתב היד, השתמש במזרק כדי להזריק בזהירות את הנגיף לתוך קלטת דיאליזה. כדי לרכז את תמיסת הנגיף, הסירו את קלטת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה והניחו אותה בשקית ניילון קטנה ואטומה.לאחר מכן הוסיפו לתיק 15 עד 25 מיליליטרים של 40% פוליאתילן גליקול, כך שקסטת הדיאליזה שקועה לחלוטין. לאחר דיאליזה לשטוף לזמן קצר את קלטת הדיאליזה עם PBS. לאחר מכן, מלאו מזרק המצויד במחט בקוטר 1.5 אינץ' של 18 מד באוויר, הכניסו את המזרק לתוך קלטת הדיאליזה ודחפו את הבוכנה.סובב את המנגנון להסרת הווירוס מבלי להסיר אף אחד מהאוויר שהוצג. כדי לעקור את שאריות הנגיף הדבקות בקרום, יש לעסות בזהירות את הממברנה באצבעות עם כפפות מבלי לפגוע בה. כדי להקל על תהליך הפריקה, הסר חלק מעודף האוויר בקלטת הדיאליזה.לצורך מבחני בקרת איכות, ראשית, דיללו את תמיסת הנגיף 100 פעמים על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים ממנו ל-990 מיקרוליטרים של PBS בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן המשך דילול סדרתי על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של הדילול הקודם ל-900 מיקרוליטרים של PBS. לבדיקות זיהום, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של כל אשליה לכל באר של צלחת 96 באר.לפני בחינת ההשפעה הציטופתית של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או ביצוע בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה, דגירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות לפחות. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, NDV מטוהר מאוד הושג כפי שהוכח על ידי נתרן דו סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה של חלבונים ויראליים. ההדבקה של הנגיף שטוהר בשיטה זו אומתה גם על ידי מינון זיהום תרבית רקמה של 50% או בדיקת TCID50 שנעשתה ב -96 צלחות באר.ה-TCID50 נקבע על פי מספר הבארות החיוביות לכל דילול באמצעות מחשבון ספירמן-קרבר. בדיקת הזיהום חשפה את ההבדל בין ההשפעות הציטופתיות של NDV לנטוגני ומזוגני על תאי DF אחד בתנאים שונים לאחר 10 ו -24 שעות של דגירה. הבדיקה החיסונית של פירנצה הייתה יעילה גם בחקר הזיהום של תאי Vero על ידי NDV לנטוגני.בעת הטמעת מערכת הניסוי, ודא כי הקווים מוכנים ביעילות כמו כל שאריות נתרן הידרוקסיד ישביתו את הנגיף. כמו כן חשוב לשמור על שלמות הממברנה שכן התפשרות על כך תפגע באופן משמעותי בטיהור הנגיף ובתפוקתו.

production-high-titer-recombinant-newcastle-disease-virus-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

במאמר זה, אנו מתארים את הזיהוי של adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 3 (AAV3) כווקטור היעילה ביותר להכוונת האדם תאים סרטניים בכבד.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAVs) וקטורים נעשים חשובים יותר ויותר...

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

ביצי תרנגולות פוריות נמצאות בשימוש נרחב לייצור כמויות גדולות של נגיף שפעת אנושי A מכיוון שהן מספקות מערכת נוחה וחסכונית להוכחת תשואות גבוהות של הנגיף.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV ברמה מחקרית באמצעות תאי HEK 293 דבקים הגדלים בערימות תאים וטיהור כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי &gt;1 x 1013 גנומים וקטוריים /mL, ומספק כמויות וקטוריות המתאימות למחקרים גדולים בבעלי חיים.

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת אנטיגן של 4 יחידות המגלוטינציה לבדיקה סרולוגית של נגיף מחלת ניוקאסל. על ידי קביעה מדויקת של טיטר ההמגלוטינציה של האנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית יותר, ותהליך התאמה מוגדר היטב, הוא משפר את יעילות הבדיקה, מפחית תוצאות חיוביות כוזבות ומשפר את מעקב המחלות בעופות.

אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

למדו לייצר נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בטיטר גבוה מנוזל אלנטואי באמצעות סינון זרימה משיקתית. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לטיהור וכימות NDV לשימוש במחקרי בעלי חיים.

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

גלה סרטונים נוספים