מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לבנות מוטיבים ציטוסקטליים מתוך רכיבים מטוהרים ולמדוד ישירות את הכוחות שהרשתות האלה מייצרות כדי להבין כיצד המרכיבים המכניים האלה של התא מתפקדים הן במצב בריא והן במצב של מחלות. שיטה זו מאפשרת לנו לכמת כוחות ולתאם את המספרים הללו ישירות כדי לשמור על פרמטרים של החלבונים המעורבים, כולל ריכוז החלבון וצפיפותו. פרמטרים שבדרך כלל בלתי אפשרי לרכוש בתוך התא.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי כל סוג של רשת ציטוסקלטון, כגון אלה המעורבים במיטוזה או בהתפתחות עצבית. ניתן להתאים אותו בקלות לרשתות מחקר המעורבות בהתכווצות שרירים או בנדידה של תאים פשוט על ידי החלפת החלבונים הספציפיים האלה שנמצאים בשימוש. ההיבט המסובך ביותר של שיטה זו הוא התיאום של הטכנולוגיות השונות, הכוללות מלכודת אופטית של קרן אחת, ומיקרוסקופ TIRF.

בנוסף, ניסויים במולקולה בודדת דורשים הכנה מדוקדקת של משטחים, כגון החלקת הכיסוי, ולכן הכנת דגימות באיכות גבוהה היא בעלת חשיבות עליונה. התחילו בבניית תא לחות על ידי הנחת רקמה מקופלת ונטולת מוך שהורטבה במים טהורים במיוחד בתחתית קופסת קצה פיפטה ריקה. הציגו את כל הריאגנטים על ידי ניקוז הנוזל בקצה אחד של הערוץ ופתילת הנוזל בקצה הנגדי.

באמצעות קצה פיפטה בזווית של 20 מיקרוליטר, יש לזרום באיטיות ב-10 מיקרוליטרים של 0.5 מיליגרם למיליליטר סטרפטאבידין או NeutrAvidin. יש לדגום את המגלשה בתא הלחות למשך 4 דקות כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה. יש לשטוף את התא באמצעות 20 מיקרוליטרים של BRB80 1x באמצעות רקמה נטולת מוך כדי לשאוב נוזלים.

לאחר חזרה על ריאגנטים זורמים ודגירה פעם נוספת, שלב שטיפה עם 10 מיקרוליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר קזאין חוסם פתרון. הזרימו 10 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים מדוללים בביוטינילטים-אדומים-רחוקים לתוך התא, ולאחר מכן שטפו את התא עם 20 מיקרוליטרים של 1x BRB80. לאחר הזרמת הריאגנט והדגירה כפי שהוכח קודם לכן, לשטוף את השלב עם 10 microliters של ריכוז מתאים של חלבון לא מוטורי להיחקר, ולאחר מכן לזרום ב 10 microliters של microtubules רודאמין ולחזור על הדגירה ושטיפה.

לאחר מכן, לשלב 1 מיקרוליטר של חרוזים מצופים קינזין קפד ו 19 microliters של מאגר תגובה. אטמו את שני קצוות התא עם לק שקוף והמתינו עד שהלק יתייבש. השתמש במכשיר מיקרוסקופ הפוך בעל יכולות הדמיה פלואורסצנטיות של השתקפות פנימית כוללת, ואשר לתוכו נבנתה מלכודת אופטית של קרן אחת.

הוסיפו טיפה אחת של שמן טבילה על משטח הכיסוי של תא הדגימה. כאשר צד הכיסוי של תא הדגימה פונה כלפי מטה, הנח את הדגימה להדמיה על פלטפורמת המיקרוסקופ. לאט לאט להעלות את המטרה כך שיהיה מגע בין הכיסוי לבין המטרה דרך השמן.

התאם את הגובה האובייקטיבי כך שמשטח ההחלקה של הכיסוי של תא הדגימה יהיה ממוקד. הקלט תמונות במסגרת אחת של הדוגמאות בכל שלושת הערוצים. עבור הניסויים כאן, השתמש 100 עד 200 אלפיות השנייה של חשיפה.

כוונן את עוצמת הלייזר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מהדגימות תוך מזעור הלבנת התמונות במשך 2 עד 5 דקות כאשר החבילה הבודדת נבדקת. התדירות של צרורות מיקרוטובולים לכל שדה ראייה צריכה להיות בערך שלושה עד ארבעה צרורות מיקרוטובולים לכל 100 מיקרוליטר על 100 מיקרוליטר שדה ראייה לכל תא. שימו לב לצפיפות החרוזים בדגימה באמצעות שדה בהיר ומטרת 100x במיקרוסקופ.

להשתמש בריכוז חרוזים כך שהחרוזים יהיו במרחק של לפחות 10 מיקרומטר זה מזה בממוצע, ולוודא שהם נקיים מכל סוג של כליאה או התקבצות של פני השטח. ודאו שהמיקרוטובולים האדומים-רחוקים מחוברים היטב לפני השטח של הכיסוי מחליקים ושהרודמין ללא תנועה בראונית נראית לעין. ודא שהמיקרוטובולים של הרודמין מחוברים למיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה באמצעות מפת הקישור הצולב, והם משתנים באופן ניכר בקצותיהם החופשיים.

זהה צרור מיקרוטובולים מתאים המכיל רק שני מיקרוטובולים, אחד ביוטינילציה עם חיבור מלא לפני השטח ומיקרוטובול אחד שאינו ביוטינילציה שהוא חופשי חלקית בתמיסה ומיושר על ציר x או y. השתמש במלכודת האופטית כדי ללכוד חרוז חופשי המדגים תנועה בראונית. לאחר לכידת החרוז, העבירו בזהירות את החרוז אל צרור המיקרוטובולים שנבחר, כדי להבטיח שלא יימשכו חרוזים אחרים למלכודת בתהליך.

ודאו שהחרוז נמצא במרחק של מספר מיקרונים מאזור החפיפה המכיל חלבונים צולבים. מנמיכים בזהירות את החרוז בציר z עד שהוא יוצר מגע עם קצה הקטע החופשי של מיקרוטובול הרודמין. משכו כלפי מעלה בעדינות ועברו בניצב לציר המיקרוטובול כדי לבדוק את החיבור על ידי התבוננות בכיפוף המיקרוטובול של הרודמין ומעקב אחר מיקום החרוז.

יישרו מחדש בזהירות את המיקרוטובול של הרודמין לאורך ציר המיקרוטובול של המיקרוטובול המחובר לפני השטח על ידי הזזת שלב מיקום הננו והגדרת הפרמטרים למשיכה אוטומטית של צרור המיקרוטובולים. קבעו את הכיוון לאורך הציר המקביל של המיקרוטובולים. הגדר את מהירות המשיכה הרצויה ואת זמן המשיכה הרצוי בהתאם לאורך החפיפה.

התחל להקליט נתוני פלואורסצנציה בשלושת הערוצים בקצב של 1 עד 2 פריימים לשנייה. השתמש בכוחות הלייזר ובזמני החשיפה הממוטבים. התחל תנועה אוטומטית של הבמה ותעד נתוני השמנה משלב הגלאי הרגיש למיקום ומשלב המצלמה הפלואורסצנטית של ההשתקפות הפנימית הכוללת.

השביתו את המלכודות כדי לשחרר את החרוז וחזרו על הניסוי כרצונכם. הרכבים של החלבון המוטורי המיטוטי החיוני קינסין-5 יכולים לווסת את החלקת המיקרוטובול על ידי יצירת כוחות דחיפה ובלימה בקנה מידה ליניארי עם אורך חפיפה. נמצא כי תחום הזנב של מסוף C נדרש לקישור צולב יעיל וליצירת כוח.

החלבון באורך מלא מסוגל לייצר כוחות מתמשכים שמתהווים כאשר כל החלבונים המוטוריים מגיעים לכוח העצירה האינדיבידואלי שלהם. עם זאת, מנוע הקינזין-5 חסר זנב מסוף C שלו מייצר כוחות מרביים הקטנים כמעט פי חמישה. הרכבים של החלבון המיטוטי הלא-מוטורי PRC1 פועלים כתרמיל מקף מכני כדי להתנגד להחלקת מיקרוטובולים באזור הביניים של ציר אנאפאזה.

הכוחות הנגדיים אינם תלויים באורך אזורי החפיפה בין זוגות מיקרוטובולים או בצפיפות ההצלבה המקומית, אך הם תלויים מאוד בריכוז הכולל של מולקולות PRC1 מעורבות. ניתן להתאים שיטה זו לחקר מערכות ביולוגיות מגוונות כגון ארגון מיקרוביאלי ונוירונים באמצעות חלבונים חלופיים. ניתן גם להרחיב אותו בקלות כדי לנתח גיאומטריות רשת מבוססות אקטין כדי לחקור התכווצות שרירים או תנועתיות תאים.

טכניקה זו מאפשרת לחקור גיאומטריות ייחודיות של סך התא, שבהן החוטים הם גם מסלול וגם מטען ומאורגנים על ידי הרכבים קטנים של חלבונים. הגיאומטריות האלה מחקות טוב יותר את מה שקורה בתאים במהלך תהליכים ביולוגיים רבים.