Preparation of Rat Sciatic Nerve for <em>Ex Vivo</em> Neurophysiology

Adrien Rapeaux; Omaer Syed; Estelle Cuttaz; Christopher A. R. Chapman; Rylie A. Green; Timothy G. Constandinou

doi:10.3791/63838

הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

Full Text

5,141 Views

09:09 min

July 12, 2022

DOI: 10.3791/63838-v

Adrien Rapeaux^1,2,3,4, Omaer Syed⁵, Estelle Cuttaz⁵, Christopher A. R. Chapman⁵, Rylie A. Green⁵, Timothy G. Constandinou^1,2,3,4

¹Department of Electrical and Electronic Engineering,Imperial College London, ²Centre for Bioinspired Technology,Imperial College London, ³Care Research and Technology (CR&T),Imperial College London and the University of Surrey, ⁴Dementia Institute (UK DRI), ⁵Department of Bioengineering,Imperial College London

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a protocol for preparing rat whole sciatic nerve tissue to facilitate ex vivo electrophysiological stimulation and recording. This method is designed to minimize external influences and improve the reliability of neurophysiological data collection.

Key Study Components

Area of Science

Neurophysiology
Electrophysiology
Ex vivo techniques

Background

The sciatic nerve is crucial for studying neurophysiological responses and phenomena.
Prior methods have faced challenges due to variables in living organisms, such as anesthesia depth.
This protocol allows for detailed observation without the confounding factors present in in vivo studies.

Purpose of Study

To enable detailed observations of neurophysiological phenomena such as nerve block carryover.
To establish a reliable ex vivo model that improves measurement precision.
To simplify preparation procedures in comparison to in vivo approaches.

Methods Used

The protocol employs an ex vivo electrophysiological setup using rat sciatic nerve.
Dissection techniques are outlined for carefully extracting the nerve while maintaining moisture.
Critical steps include using chilled modified Krebs-Henseleit buffer during dissection and setting up a dual-chamber nerve bath.
The nerve is secured and subjected to stimulation with electrodes in a controlled environment.

Main Results

This method yields robust and repeatable electrophysiological readings.
Interference from physiological conditions is minimized, resulting in clearer data.
It allows for investigation of specific neurophysiological phenomena in a controlled, dissected environment.

Conclusions

The study demonstrates a successful approach for ex vivo nerve tissue preparation.
This technique enhances the understanding of neurophysiological mechanisms without in vivo variability.
It provides a useful model for exploring nerve function and dysfunction under controlled settings.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using ex vivo techniques?

Ex vivo methods allow for detailed observation of neurological functions in a controlled environment, minimizing confounding factors that affect in vivo studies.

How is the rat sciatic nerve prepared for stimulation?

The sciatic nerve is carefully exposed and detached from surrounding tissues, maintained in a chilled buffer to prevent drying out during the process.

What types of data can be obtained using this protocol?

This protocol provides electrophysiological data, allowing for the observation of nerve responses to specific current injections without physiological interference.

How can this method be adapted for other types of nerves?

The techniques described can be modified to accommodate different types of nerves by adjusting dissection and stimulation protocols based on anatomical variations.

What are the limitations of this approach?

Some potential limitations include the inability to observe whole-body responses and the necessity for precise dissection techniques to prevent nerve damage.

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה של רקמת עצב סיאטית שלמה של חולדה לגירוי אלקטרופיזיולוגי ex vivo ורישום באמבט מלוחים בעל שני תאים מווסתים סביבתית.

פרוטוקול זה מאפשר תצפית על תופעות נוירופיזיולוגיות רבות שאינן מובנות היטב, כגון נשיאת בלוק עצבי לאחר הזרקת זרם בתדר גבוה/משרעת גבוהה, תוך מניעת הפרעות מתהליכים אחרים בגוף חי. טכניקה זו מניבה תוצאות חוזרות וחזקות מאוד והיא מעשית יותר מאלקטרופיזיולוגיה in vivo, מכיוון שמשתנים מורכבים כגון עומק ההרדמה אינם חייבים להיות מבוקרים ולכן אינם יכולים להשפיע על המדידות. לאחר הליך המתת חסד תחת הרדמה, מניחים נקבת חולדה על שולחן הנתיחה, מחזיקים את הקרסול בחוזקה בין האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית, ומנתקים את גיד הקלקניאל באמצעות מספריים קהים ישרים בקוטר 12 ס"מ.

באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, בצע חתכים זהירים דרך שכבות השרירים הסמוכות לאמצע החלק האחורי של הרגל עד שהעצב הסיאטי נחשף. ברגע שהעצב נראה לעין, לחות את החלל באמצעות חיץ Krebs-Henseleit שעבר קריש קר כקרח, או MKHB, כדי למנוע מהעצב להתייבש. באמצעות hemostats, למשוך את דשי העור מכל צד ולשמור על החתך פתוח עבור דיסקציה עדינה יותר.

החל ממיקום החתך בגיד הקלקניאלי, באמצעות מספריים עדינים, לקטוע את השריר בצד המדיאלי של הרגל כדי לשחרר את העצב. המשך לשמור על רמות הלחות באזור עם MKHB קר כקרח. כאשר העצב נחשף תוך כדי תנועה במעלה הרגל, נתחו את רקמת השריר העליונה.

לשחרר את העצב קרוב יותר לעמוד השדרה מרקמות חיבור עד להגיע לשסע בעמוד השדרה, ואז יש קינק בעצב. אל תנקו את העצב עדיין, שכן המהירות חיונית בשלב זה. כדי להפוך את הנתיחה לקלה יותר, באמצעות מלקחיים, בעדינות למשוך את קצה העצב ליד הקרסול.

לאחר מכן, באמצעות מספריים עדינים, חתכו את העצב קרוב לעמוד השדרה. מניחים את העצב המנותח בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מלא ב-MKHB ומניחים את הצינור בחזרה על הקרח עד לתחילת הליך הניקוי. ממלאים את צלחת הפטרי המצופה באמצע הדרך ב-MKHB מחומצן צונן, ואז מניחים עצב סיאטי אחד מנותח בצלחת ומצמידים את שני קצות העצב לצלחת כך שהעצב ישר ללא סטיות, פיתולים או פיתולים.

באמצעות 6-0 תפרי משי או חוט דק, קושרים קשר כפול סביב כל קצה של העצב כדי למנוע דליפת ציטוזול לתוך החיץ. מניחים את הקשרים ממש ליד סיכות החרקים בצד קרוב יותר למרכז העצב כדי למנוע דליפה מרקמת העצב לתוך החיץ. מתחת למיקרוסקופ, באמצעות מספריים קפיציים בזווית של שני מילימטרים ומלקחיים עדינים, מסירים מהעצב שומן, כלי דם ורקמת שריר.

לגזום את כל ענפי העצב שלא ישמשו בגירוי וברישום. לאחר כל חמש דקות של ניקוי, החליפו את המאגר ב-MKHB טרי, מצונן ומחומצן. לאחר הניקוי, מניחים את העצב בחזרה לתוך צינור ההובלה המלא בחיץ ומניחים את הצינור על קרח.

הכינו אמבט עצבים נקי עם שני תאים. באמצעות ראשי מעבדה סטנדרטיים ותופסים, הניחו את אמבט העצבים מתחת לגובה בקבוק שני ליטרים המונח על מערבל החימום. חברו את ניקוז האמבטיה לכניסת המשאבה הפריסטלטית.

חברו את השקע של המשאבה הפריסטלטית לצינור המוביל בחזרה לבקבוק החיץ. חברו את פתח האמבטיה לצינור עם שסתום זרימה מתכוונן והניחו את הצינור בתוך הבקבוק. השתמש בשסתום תלת-כיווני עם מזרק המחובר לשקע האמצעי כדי לסייע בהחדרת הצינור כסיפון לזרימת חיץ בסיוע כוח הכבידה.

הכינו את הסיפון על ידי ציור המזרק עד שהמאגר זורם לתוכו. הגדר את השסתום כך שקצב זרימת המאגר לאמבטיה הוא חמישה עד שישה מילימטרים לדקה. ניתן להגדיל את קצב הזרימה בתחילה כדי למלא את האמבטיה.

לאחר שמפלס חיץ האמבטיה הגיע לניקוז, הניחו את העצבים באמבטיה. באמצעות סיכת חרקים, אבטחו את קצה העצב בפינת תא האמבטיה המלא בחיץ. באמצעות מלקחיים עדינים זוויתיים בזווית של 45 מעלות וצביטת העצב רק בקצוות, משחילים בזהירות את העצב כדי להיות מגורה דרך החור במחיצה בין שני תאי האמבטיה.

באמצעות סיכת חרקים, מהדקים את הקצה השני של העצב בתא השמן של האמבטיה, ומבטיחים שהעצב ישר מבלי להימתח והוא נקי מסטיות ופיתולים. באמצעות גריז סיליקון, צור אטם כדי למנוע דליפת חיץ מתא החיץ לתוך תא השמן מלא את תא השמן בסיליקון או בשמן מינרלי. הניחו את ווי האלקטרודה הכסופים/כסופים כלוריד בתא אמבט השמן והבטיחו אותם באמצעות ראשי בוס ותופסים.

לאחר מכן, עטפו את החלק של העצב באמבט השמן מעל הקרסים מבלי למשוך את העצב מתוח. התאם או תקן את חותם השומן מסיליקון אם נצפתה דליפה כלשהי לאחר הזזת העצב. חברו את אלקטרודת הייחוס כסופה/כסף כלוריד לקרקע המגבר והניחו את האלקטרודה בתא האמבטיה המלא בחיץ על ידי אבטחתה באמצעות גריפר מעבדה.

לאחר הכנת אלקטרודת שרוול עצבי נקי לגירוי, הניחו את האלקטרודה בתא האמבטיה מלא החיץ. באמצעות מלקחיים או פינצטה עדינה עם קצוות קהים או זוויתיים, פותחים את האלקטרודה באמבטיה כדי להרטיב את החלק הפנימי של השרוול. אם נשארות בועות, השתמשו במזרק דק כדי לשאוב חיץ מהאמבטיה ולהוציא את הבועות מהשרוול בכוח.

באמצעות פינצטה, פתחו בעדינות את השרוול והחליקו אותו מתחת לעצב. סגור את השרוול סביב העצב, תוך הימנעות מכל סטייה או פיתול של העצב. חברו את אלקטרודת הגירוי ואת אלקטרודת החזרת הזרם אל הממריץ.

אם אתה משתמש ביריעת פלטינה מרובעת כאלקטרודת ההחזרה הנוכחית, מקם את היריעה הרחק מהעצב באמבטיה. אבטחו את שתי האלקטרודות עם סרט הדבקה. חבר את יציאת האות TTL של הממריץ לערוץ הרביעי של האוסצילוסקופ.

במסך האוסצילוסקופ, לחץ על הכרטיסיה ערוץ טריגר וציין את ערוץ ארבע כערוץ המפעיל. הגדר את רמת ההדק לוולט אחד באמצעות כפתור הרמה. באוסצילוסקופ, קבעו את רזולוציית הזמן לאלפית השנייה לכל חלוקה ואת רזולוציית המתח ל-10 מילי-מילי-וולט לכל חלוקה.

מרכז את הפניית ההדק בזמן והגדר את רמת ההדק לוולט אחד. לאחר חיבור הגירוי למחשב, הפעל את הממריץ על-ידי חיבור ספק הכוח של הסוללה לקלט החשמל. לאחר מכן, הפעל את תוכנת MATLAB במחשב.

הפעל את סקריפט MATLAB המותאם אישית. לאחר מכן, פתח את סקריפט MATLAB המצוין. ערוך את התסריט והגדר את הפרמטרים משרעת דופק מגרה למינוס 300 מיקרואמפרים, רוחב דופק מגרה ל -300 מיקרו-שניות, מספר פולסים ממריץ ל -10, וזמן מגרה בין פולסים לשנייה אחת.

התחל את פרוטוקול הגירוי על ידי לחיצה על הפעל בתוכנה. לפוטנציאל הפעולה המורכב, או CAP, הייתה משרעת שיא לשיא של מיליוולט אחד באלקטרודה ו-100 מיליוולט כאשר הוגברו. ההתרגשות העצבית האופיינית לאזיקי עצב פלטינה סטנדרטיים ולאזיקי עצב אלסטומר מוליכים בהתאמה אישית מוצגים כאן.

ה-CAP שהושג במשך יום של ניסויים באמצעות שני העצבים הסיאטיים מוצג כאן. הפחתת משרעת CAP מינימלית נצפתה עם העצב הסיאטי הימני. לעומת זאת, משרעת ה-CAP של העצב הסיאטי השמאלי בערך בשלושה מיליוולטים הייתה דומה לזו של העצב הסיאטי הימני בתחילת הניסוי יותר משש שעות לאחר מיצוי העצב.

דגש על דיוק ויכולת חזרה בטכניקת דיסקציה, ניקוי ויישום. שימו לב למה שקורה באמבטיה. אם האות העצבי הולך לאיבוד, זה יכול להיות פשוט כי האלקטרודות אינן במגע טוב או שיש מלח במחיצת שמן האמבטיה, ולא כי העצב מת.

משתמשים בפעם הראשונה עלולים להתפתות למהר, במיוחד בשלב הנתיחה. זה כנראה יוביל לטעויות ויפגע בעצב. דיוק ועקביות הם המפתח כאן ויובילו לתוצאות איכותיות יותר.

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן גם לעקביות בהכנת מאגר.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos