גישה משולבת לזיהוי מיקרופרוטאינים וניתוח רצף

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות מפורטות לניתוח אזורים גנומיים בעלי עניין עבור פוטנציאל קידוד חלבונים באמצעות phyloCSF בדפדפן הגנום הידידותי למשתמש UCSC. PhloCSF יכול לזהות ביעילות מסגרות קריאה פתוחות קצרות ושמורות עם פוטנציאל קידוד מיקרו-חלבונים באזורים גנומיים שכרגע מבוארים כלא מקודדים. השיטות המתוארות כאן משמשות בקלות וניתן ליישם אותן על ידי חוקרים מכל הרקעים ללא הכשרה מוקדמת או מומחיות בביו-איפורמטיקה או בגנומיקה השוואתית.

כדי להתחיל, פתח חלון דפדפן אינטרנט ונווט לדפדפן הגנום של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז או UCSC. תחת כותרת הכלים שלנו, בחר באפשרות רכזות המסלול. בכרטיסיה רכזות ציבוריות הקלד phyloCSF לתוך התיבה מונחי חיפוש.

לאחר מכן, לחץ על לחצן חיפוש רכזות ציבוריות. התחבר ל- phyloCSF על ידי לחיצה על כפתור החיבור של שם הרכזת phyloCSF. לאחר לחיצה על התחבר, המתן כדי להפנות לדף שער הגנום של UCSC.

כדי לבצע שאילתה על מין אחר, בחר את המינים המעניינים תחת הכותרת 'עיון' או 'בחר מינים' על-ידי לחיצה על הסמל המתאים, או הקלד את המינים בתיבת הטקסט שאומרת, הזן את השם הנפוץ של המינים או את מזהה ההרכבה.באמצעות התפריט הנפתח בחר את ההרכבה לחיפוש תחת כותרת מיקום מוגדרת ולאחר מכן הזן את סמל גן המיקום או מונחי החיפוש בתיבת המיקום או מונחי החיפוש ולחץ על עבור כדי לנווט לגן בעל עניין בדפדפן הגנום. אם החיפוש הביא לכך שהתאמות מרובות ממתינות לניתוב מחדש לדף הדורש בחירה של מיקום מעניין, לחץ על הגן המתאים של העניין. לאחר ניווט לדפדפן הגנום של UCSC בחר את כלי היישור דמוי הפיצוץ או blat תחת כותרת הכלים שלנו כדי לבצע שאילתה על דנ"א או רצף חלבונים ספציפי.

לחלופין, רחף עם הסמן מעל הכרטיסיה כלים ובחר באפשרות blat או עקוב אחר הקישור הנתון. באמצעות התפריט הנפתח בחר את המינים, הגנום והרכבת העניין. לאחר מכן, הגדר את סוג השאילתה, הדבק את רצף העניין בתיבת הטקסט של גנום החיפוש blat ולחץ על שלח.

לאחר מכן, לחץ על קישור הדפדפן תחת כותרת הפעולות כדי לנווט לאזור הגנומי של העניין. סרוק באופן חזותי את אזור העניין הגנומי כדי לקבל ניקוד חיובי של אזורי phyloCSF. השתמש בתכונת הזום כדי להגדיל אזורים מעניינים כדי לבחון את מאפייני הרצף ולחפש את קודוני ההתחלה והעצירה.

כדי להגדיל את התצוגה באופן ידני החזק את מקש ההזזה ולחץ והחזק את לחצן העכבר תוך כדי גרירה לאורך אזור העניין. לחלופין, השתמש בלחצני התצוגה וההגדלה של התצוגה העליונה של הדף כדי לנווט. הגדל את התצוגה עד שהנוקלאוטיד או רצף הבסיסים יהיו גלויים לעין.

סרוק באופן חזותי את רצף הגאות הגרעינית בסמוך להתחלה ולסוף של אזורי phyloCSF בעלי הניקוד החיובי כדי לזהות התחלה עונשית ועצירת קודונים. רחף עם סמן העכבר מעל כותרת התצוגה בראש הדף ולחץ על האפשרות המרה בגנומים אחרים, ולאחר מכן הגדר את הגנום המעניין באמצעות התפריט הנפתח מתחת לכותרת הגנום החדשה. בחר את ההרכבה הגנומית המעניינת תחת כותרת ההרכבה החדשה ולחץ על לחצן השליחה.

לאחר שהדפדפן מחזיר רשימה של אזורים במכלול החדש עם דמיון. לחץ על הקישור למיקום הכרומוזום כדי לנווט לאזור העניין ההומולוגי. עקוב אחר אסטרטגיות הניווט שתוארו קודם לכן כדי לנתח את הרצף.

כדי לנווט לדף תיאור הגן, לחץ על הגן המעניין במסלול קוד הגנים בדפדפן הגנום של UCSC. תחת הכותרת 'רצף' וקישורים לכלים ולבסיסי נתונים לחצו על הקישור בטבלה שקורא מינים אחרים מהר יותר. לחץ על התיבות המשויכות למינים המעניינים כדי לבחור אותם.

לאחר מכן, לחץ על שלח. העתק והדבק את הרצפים המופיעים בתחתית העמוד בתבנית מהירה יותר למסמך עיבוד תמלילים. לאחר מכן, פתח חלון דפדפן שני ונווט אל כלי יישור הרצפים המרובים של אומגה clustal באתר האינטרנט של המכון האירופי לביואינפורמטיקה.

הדבק את קבצי הרצף בלוח בתיבה בשלב הראשון שקוראת רצפים בכל תבנית נתמכת. גלול לתחתית הדף ולחץ על שלח. שימו לב למטה לתוצאות המיושרות עבור סמלים המציינים את מידת השימור של כל חומצת אמינו.

כדי להציג את תכונות חומצות האמינו והצבע לחץ על הצבעים להראות קישור ישירות מעל הרצפים כדי לצבוע את חומצות האמינו על פי תכונותיהם. לאחר מכן העתק והדבק את יישור הרצף לתוכנית עיבוד תמלילים או הצגת שקופיות כדי ליצור קובץ איור או איור. כדי לצפות בתפוקות אחרות מדף תוצאות האומגה הקלוסטלית, לחצו על עץ ההדרכה של הכרטיסיות או על העץ הגנטי phylo.

לבסוף, לחץ על הכרטיסייה של מציג התוצאות לקבלת אפשרויות להצגת מידע הרצף באמצעות jalview או כדי לגשת לקישורים ישירים ל- mview ולפילוגנזה פשוטה. ניתוח phyloCSF מייצג של הגן mitoregulin מצביע על אזור של שימור רצף גבוה המתאים למיקרו חלבון מאומת. רצף הקידוד השלם של mitoregulin כלול בתוך exon one ומקבל ציונים גבוהים מאוד ב- phyloCSF מינוס רצועה אחת.

ניתן לראות קודון התחלה שמור בתחילת אזור הניקוד החיובי ב- phyloCSF מינוס מסלול אחד. אזור הניקוד החיובי באקסון הראשון של מיטורגולין מתחיל ישירות מעל קודון התחלה ומסתיים בקודון העצירה. יישור הרצף המרובה של המיקרו-חלבון mitoregulin עבור שמונה מינים שונים מוצג כאן.

הניתוח של האוויר החם הארוך שאינו מקודד RNA הראה ציון שלילי לאורך כל הגן בכל ששת המסלולים, מה שמצביע על חוסר שימור רצף ותומך בכך שאוויר חם מבואר נכון כרנ"א שאינו מקודד. ניתוח PhyloCSF של העכבר אחד, שמונה, אחד, אפס, אפס, חמש, שמונה, I 24 rike גן הראה כי מסגרת קריאה פתוחה שמורה משתרעת על פני שלושה אקסונים וציון phyloCSF החיובי קופץ ממסלול פלוס שניים באקסון אחד למסלול פלוס שלוש באקסון שתיים, ואז בחזרה לרצועת פלוס שתיים באקסון שלוש. ניתוח PhyloCSF של לוקוס הגן meet one שימש גם הוא למעשה לזיהוי מספר מסגרות קריאה פתוחות מקודדות נפרדות בתוך מולקולת RNA אחת.

חשוב לציין כי בעוד שציון phyloCSF חיובי מרמז מאוד על יכולת קידוד מיקרו-חלבונים, קו ראיות זה אינו יכול לעמוד בפני עצמו ויש לאמת אותו בניסוי. לאחר שזוהתה תקופה של מיקרו-חלבון, ניתן לנתח את רצף חומצות האמינו עבור תחומים שמורים או מאפייני רצף כדי לספק תובנה לגבי תפקודו. PhyloCSF שימש ביעילות לזיהוי מיקרו-חלבונים חדשים באזורים גנומיים שנחשבו בעבר ללא קידוד, וימשיך להיות כלי מועיל במחקרי זיהוי מיקרו-חלבונים עתידיים.