Name: בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: חקור שיטות בידוד וירוסים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים של Aedes albopictus ו-BHK-21. פרוטוקול זה מאפשר מחקר בטוח ובעל עמידה אתית בנוגע למחלות הנישאות על ידי יתושים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).

1. דיגום ומיון יתושים
<ol><li>לכדו את היתושים הבוגרים דרך מלכודות האור MXA-02 או מלכודות יתושים פחמן דו חמצני בשטח.</li>
	<li>הרגו את היתושים שנאספו על ידי טבילה בחנקן נוזלי10,11. העברתם למעבדה על ידי המערכת הלוגיסטית של שרשרת הקירור12. הערה: קרח יבש שימש בעיקר במערכת הלוגיסטית של שרשרת הקור.</li>
	<li>(אופציונלי) אם אתרי הדגימה היו בקרבת המעבדה, שלחו ישירות את היתושים החיים במלכודות הרשת למעבדה והרדימו אותם על ידי הקפאה בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות4.</li>
	<li>בצע זיהוי מורפולוגי של היתושים שנאספו באמצעות ספר הכלים13 לסיווג וזיהוי יתושים. הערה: במידת הצורך, ניתן להשתמש ברקוד DNA כדי לסווג ולזהות יתושים14,15.</li>
	<li>בהתבסס על תאריכי הדגימה והאתרים, הקצו אותם לבריכות שונות, ולאחר מכן אחסנו אותם בצינורות של 2-5 מ"ל.</li>
	<li>ציירו טבלה כדי לתעד כל צינור עם מיני יתושים, מספר, קוד דגימה, תאריך ואתרים.</li>
	<li>הדפס את התוויות עם קודי דגימה והצמיד אותן לצינורות.</li>
	<li>שמור צינורות עם דגימות יתושים ב -80 ° C עד ניתוח נוסף.</li>
</ol>2. טחינת יתושים
<ol><li>הכניסו 20-50 יתושים לכל צינור סטרילי בנפח 2 מ"ל עם חרוזי קרמיקה בקוטר 3 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תווך Roswell Park Memorial Institute (RPMI) המכיל 2% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B. הערה: יש לשמור את הצינורות על מגש קרח או ניס.</li>
	<li>הומוגניזציה של היתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ב 4 ° C במשך שלושה מחזורים16.</li>
	<li>צנטריפוגו את התערובות ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים.</li>
	<li>צנטריפוגה את supernatants שוב ב 15,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת יתושים12,17. הערה: במידת הצורך, ניתן לסנן את הסופרנאטנטים באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>Aliquot את supernatants (P0) לתוך 2 מ"ל פקק בורג צינורות אחסון (200 μL לכל צינור) ולאחסן אותם ב -80 ° C.</li>
</ol>3. הכנת תאים ואמצעי תחזוקת תרבית תאים
הערה: קו תאי יתוש C6/36 (חסר RNAi Aedes albopictus ) וקו תאי חוליות BHK-21 (כליה של אוגר תינוק) שימשו להגברה ולבידוד הנגיף.
<ol><li>יש לחסן 1 × 106 תאי C6/36 לתוך בקבוק 2 בגודל 75 ס"מ עם 10 מ"ל של RPMI בינוני בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-28°C באינקובטור לח 5% CO2. </li>
	<li>חסן 1 × 106 BHK-21 תאים לתוך בקבוק 2 75 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% P / S ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח. הערה: התאים עברו פעמיים או שלוש בשבוע17,18.</li>
	<li>זרעו את התאים בתרביתשל 75 ס"מ 2 בקבוקים (C6/36 או BHK-21 תאים) לתוך לוחות 24 בארות (C6/36 לכל באר: 1.4 × 105; BHK-21 לכל באר: 0.8 × 105).</li>
	<li>הניחו את הצלחות עם 24 הבארות ב-28°C או 37°C למשך הלילה.</li>
	<li>התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ ואשרו אם מפגש התאים בכל באר הוא 80%-90%.</li>
	<li>הכינו את מדיום תחזוקת תרבית התאים (500 מ"ל). הערה: עבור C6/36, המדיום היה RPMI בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון. עבור BHK-21, המדיום היה DMEM בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון.</li>
</ol>4. בידוד וירוסים
הערה: כל השלבים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). דרישת רמת הבטיחות של מעבדת הבטיחות הביולוגית נקבעה על ידי הערכת סיכוני הבטיחות הביולוגית בהתבסס על תקנות של מדינות ואזורים שונים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
<ol><li>הסר את מדיום תרבית התאים מלוחות 24 הקידוחים והוסף 100 μL של מדיום תחזוקת תרבית התא ו 100 μL של supernatant של הומוגנאט יתוש (P0) לכל באר.</li>
	<li>יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 28°C או 37°C למשך 60 דקות ולנער אותן בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע התייבשות תאים.</li>
	<li>הסירו את הסופרנאטנט ושטפו כל אחד מהם היטב בעדינות עם 600 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים כדי להסיר את הלכלוך לחלוטין.</li>
	<li>הוסף 800 μL של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים לכל באר ושמור את הצלחות באינקובטור 5% CO2 לח ב 28 ° C או 37 ° C במשך 7 ימים.</li>
	<li>עקוב אחר מצב התא של כל באר תחת המיקרוסקופ מדי יום15.</li>
	<li>אספו את הסופרנאטנטים של התאים (P1 supernatants) ביוםהשביעי ואחסנו את הסופרנאטנטים בטמפרטורה של -80°C.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.1-4.6 2x כדי לקבל סופרנאטנטים P2 ו-P3. הערה: בשלב 4.3, שטיפה עדינה של כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים הייתה אופציונלית עבור P2 ו-P3.</li>
	<li>תלוי איזו באר מראה את ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) - תאים מתים, פיקנוזיס, ומתנתקים מפני השטח; מיזוג עם תאים סמוכים ליצירת סינקטיה; או הופעתם של גופי הכללה גרעיניים או ציטופלזמיים – הוסיפו 300-400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט של CPE זה היטב לכל באר של לוחות 6 בארות חדשים המכילים תאים (מפגש התאים היה 80%-90%) כדי להגביר מאוד את הנגיפים.</li>
	<li>אספו את הסופרנאטנטים והכניסו אותם לצינורות אחסון של 2 מ"ל פקק בורג (500 מיקרוליטר לצינור). אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C. הערה: לאחר שלושה דורות של מעבר רצוף בתאים, הדגימות שלא גרמו ל-CPE הושלכו. במידת הצורך, ניתן להגדיל את הדורות של מעברים רצופים בתאים.</li>
</ol>5. איתור רצפים נגיפיים על ידי RT-PCR
<ol><li>חלצו את סך כל הרנ"א מ-200 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות ערכת מיני RNA נגיפי16. הערה: כאן, מערכת מיצוי חומצת גרעין אוטומטית שימשה לחילוץ RNA כולל בהתאם להוראות יצרן המכשיר.</li>
	<li>המר את הרנ"א ל-cDNA בהתאם להוראות ערכת RT-PCR באמצעות מכשיר PCR.<ol><li>הוסף 15 μL של RNA מעורבב עם 1 μL של פריימרים אקראיים לתוך צינור PCR. מניחים את הצינור בטמפרטורה של 70°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מניחים אותו על קרח למשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסף 5 μL של 5x buffer ו 25 μL של תערובת (10 mM dNTP, 40 U/μL RNase inhibitor, ו 200 U/μL M-MLV) לתוך הצינור ומניחים את הצינור על 42 ° C במשך 60 דקות ו 95 ° C במשך 10 דקות.</li>
		<li>יש לאחסן את הצינור בטמפרטורה של -20°C.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בערכת PCR ובפריימרים אוניברסליים (טבלה 1) כדי לזהות וירוסים באמצעות PCR.<ol><li>עבור arboviruses, להגדיר את מערכת התגובה PCR (סה"כ 30 μL) עם הרכיבים הבאים: 3 μL של 10x Taq buffer, 3 μL של dNTP (1mM), 1 μL של פריימר קדמי (10 μm), 1 μL של פריימר הפוך (10 μm), 0.3 μL של Taq (10 U/μL), 19.7 μL של ddH 2 O, ו2μL של cDNA.</li>
		<li>לזיהוי flaviviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 52 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>לזיהוי אלפא-וירוסים, הגדר את תהליך התגובה כ: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>לזיהוי של bunyaviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>זהה את מוצרי הגברה PCR על ידי 1% אלקטרופורזה ג'ל agarose ולשלוח אותם לניתוח ריצוף. הערה: אם התנאים מאפשרים זאת, הסופרנאטנטים יכולים לעבור ניתוח ריצוף של הדור הבא כדי לזהות וירוסים חדשים ולקבל את כל הגנום הנגיפי.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-associated+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342(2020).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+%282007-2017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li>
<li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265(2021).</li>
<li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873(2019).</li>
<li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses%3A+evolution%2C+infection%2C+and+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li>
<li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li>
<li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30(2018).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+%28BAV%29+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555(2018).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640(2020).</li>
<li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+M+%22Handbook+for+Classification+and+Identification+of+Main+Vectors%22">Handbook for Classification and Identification of Main Vectors</a>. , Suzhou University Press. (2019).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bold%3A+The+Barcode+of+Life+Data+System+%28www.barcodinglife.org%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Notes%22%5BJournal%5D)">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298(2022).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).</li>
<li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan%2C+PR+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מטרת שיטה זו הייתה להציע דרך מעשית לבידוד נגיפים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים שונים. חיוני להוסיף את האנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) לסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים או פטריות. יתושים וסופרנאטנטים נגיפיים המתקבלים בשדה חייבים להיות בקירור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
צעד קריטי נוסף בפרוטוקול היה השחיקה. דגימות יתושים צריך להיות אבקה ביסודיות ומאוחסן על קרח. רקמות יתושים טחונות מספיק י...

יתושים הם קבוצה של וקטורים פתוגניים חשובים של פרוקי רגליים. ישנם כ -3,500 מינים של יתושים במשפחה Culicidae 1,2. פיתוח טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה הוביל לגילוי רצפים חדשים דמויי וירוסים רבים ביתושים ממקומות שונים בעולם3. באופן כללי, ניתן לסווג את הנגיפים הקשורים ליתושים אלה לשתי קבוצות עיקריות: MBVs ו- MSVs.
MBVs הם קבוצה של וירוסים מגוונים שהם גורמים סיבתיים למחלות רבות של בני אדם או בעלי חיים, כגון וירוס קדחת צהובה (YFV), נגיף דנגי (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) ונגיף קדחת עמק השבר הסורי אפריקאי (RVFV)4. הם איימו באופן חמור על בריאות הציבור בכך שגרמו לתחלואה ותמותה קשות הן בבני אדם והן בבעלי חיים ברחבי העולם. MBVs מקיימים באופן טבעי מחזור חיים בין פונדקאים מגוונים באמצעות העברה מיתוש נגוע לפונדקאי תמים, כמו גם מפונדקאי נגוע בנגיף ויתוש האכלה5. לכן, נגיפים אלה יכולים להדביק הן שורות תאי יתושים והן שורות תאים של בעלי חוליות במעבדה1.
MSVs, הכוללים וירוס Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) ווירוס Chaoyang (CHAOV), הם תת-קבוצה של וירוסים ספציפיים לחרקים 1,6,7. בשנים האחרונות, חלה עלייה בגילוי של MSV חדשים, וחלק MSV אלה נמצאו כבעלי השפעה על העברת MBVs. לדוגמה, CxFV, אשר יכול להיות זיהום מתמשך ב Culex pipiens, יכול לדכא שכפול WNV בשלב מוקדם8. נגיף פלבי ספציפי נוסף לחרקים, נגיף סוכן איחוי תאים (CFAV), נמצא כמעכב את התפשטות נגיף DENV וזיקה (ZIKV) ביתושים Aedes aegypti 9. לפיכך, פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים ושליטה במחלות המועברות על ידי יתושים.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנן ממברנה m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>סרטי פולימר עם דירוגי נקבוביות ספציפיים. להסרת פסולת תאים וחיידקים.</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>CORNING</td><td>3524</td><td>מיכלים לתא</td></tr><tr><td>75 ס"מ2 צלוחיות</td><td>CORNING</td><td>430641</td><td>מיכלים לתא</td></tr><tr><td>צינור סטרילי 2 מ"ל עם חרוזי</td><td></td><td></td><td></td>קרמיקה 3 מ"מ</tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>אנטיביוטיקה במדיום למניעת זיהום מחיידקים ופטריות</td></tr><tr><td>חומצת גרעין אוטומטית מערכת מיצוי</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 תאים</td><td>מרכז משאבי הנגיפים הלאומי, המכון לווירולוגיה</td><td></td><td></td>של ווהאן</tr><tr><td>C6/36 תאים</td><td>מרכז משאבי הנגיפים הלאומי, מכון ווהאן לווירולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונה צנטריפוגלית</td><td>Himac</td><td>CF16RN</td><td>מכשיר לצנטריפוגה של דגימות יתושים</td></tr><tr><td>CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דולבקו מדיום חיוני מינימלי (DMEM)</td> <td>מדיום Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>לקווי תאים של בעלי חוליות</td></tr><tr><td>וירוס</td><td></td><td></td> אגם אבינור <td>בידוד Cu20-XJ</td></tr><tr><td>סרום בקר פטה (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td> לספק תזונה לתאים</td></tr><tr>שירות<td>הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה במהירות</td><td>גבוההbio</td><td>KZ-III-F</td><td>מכשיר לטחינה</td></tr><tr><td>אינקובטור (28 מעלות; ג)</td> מכשיר <td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>לחממת תרביות תאים</td></tr><tr><td>(37 מעלות; ג)</td> <td>מכשיר Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>צינור PCR</td> פניצילין-סטרפטומיצין <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15410-122</td><td>אנטיביוטיקה במדיום למניעת זיהום מחיידקים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B תמיסת</td><td>15240096</td><td></td><td>מקרר Gibco</td></tr><tr><td>(-80 & deg; C)</td> <td>sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק&nbsp; בינוני (RPMI)</td> <td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>בינוני לקווי תאים mosiquto</td></tr><tr><td>צינורות אחסון מכסה בורג (2 מ"ל)</td> <td>biofil</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>FCT010005 עליים סטריליים</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y004</td><td>חומרים מתכלים&nbsp; לטחינת</td></tr><tr><td>TGrinder OSE-Y30 מטחנת רקמות חשמלית</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td>מכשיר לטחינה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ החיתוך</td><td>ZEISS</td><td>stemi508</td><td></td></tr><tr><td>מלכודות האור MXA-02</td><td>Maxttrac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת</td> <td>ספיגת היתושיםNingbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות הפיפטה</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני RNA ויראלית QIAamp</td><td>QIAGEN</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

עם היישום הרחב של טכנולוגיות ריצוף, רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים התגלו בפרוקי רגליים, כולל יתושים. שתי הקטגוריות העיקריות של וירוסים חדשים אלה הקשורים ליתושים הם "וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs)" ו"וירוסים ספציפיים ליתושים (MSVs)". נגיפים חדשים אלה עשויים להיות פתוגניים הן לבעלי חוליות והן ליתושים, או שהם יכולים פשוט להיות סימביוטיים עם יתושים. וירוסי ישויות חיוניים כדי לאשר את המאפיינים הביולוגיים של וירוסים אלה. לפיכך, תואר כאן פרוטוקול מפורט לבידוד והגברה של וירוסים מיתושים שנאספו בשטח. ראשית, דגימות היתושים הוכנו כסופרנאטים של הומוגנאטים של יתושים. לאחר צנטריפוגה פעמיים, הסופרנאטנטים חוסנו לקו תאי יתוש C6/36 או לקו תאי חוליות BHK-21 להגברת הנגיף. לאחר 7 ימים, הסופרנאטנטים נאספו כסופרנאטנטים P1 ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סופרנאטנטים P1 הועברו פעמיים נוספות בתאי C6/36 או BHK-21 בזמן שמצב התא נבדק מדי יום. כאשר התגלתה ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) על התאים, סופרנאטנטים אלה נאספו ושימשו לזיהוי נגיפים. פרוטוקול זה משמש כבסיס למחקר עתידי על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל MBV ו- MSVs.

לאחר שחוסנו עם הסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים (P0), תאי C6/36 הציגו מרחב בין-תאי רחב, ותאי פילינג נצפו בשעה 120 שעות (איור 1A) בהשוואה לתאים הלא מחוסנים (קבוצת ביקורת) באותו זמן (איור 1B). לאחר הדגירה על תאי BHK-21 עם סופרנאטנטים P3, CPE נראה בתאי BHK-21 לאחר 48 שעות (איור 1C) בניגוד לתאי הבקרה (איור 1D). PCR בוצע כדי לקבוע מינים ויראליים. הפריימרים האוניברסליים לזיהוי פלאווי-וירוסים, אלפא-וירוסי...

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים והדברת מחלות המועברות על ידי יתושים. שימוש בקווים דקים לבידוד וירוסים במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הוא בטוח ויעיל יותר. שלא כמו הליכי בידוד וירוסים אחרים, כגון מחזור חיסון אדום עם נוזלים משתנים, טכניקה זו אינה מחייבת ניסויים בבעלי חיים או הערכה אתית.הזיהום מהדגימות והתאים הנשאבים במהלך הדגירה יכול להוביל לכישלון הניסוי. לפיכך, יש צורך להוסיף 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin לתוך המדיום כדי למנוע זיהום. התחל עם תוספת של חרוזים קרמיים שלושה מ"מ, 1.5 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון בצינור סטרילי שני מיליליטר מונח על קרח ולאחר מכן להעביר 50 יתושים בו.לאחר מכן, הומוגניזציה של יתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ו 4 מעלות צלזיוס במשך 3 מחזורים. צנטריפוגה הומוגנאט ב 15, 000 גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatants לצינורות החדשים. כדי להסיר את פסולת היתושים לחלוטין, צנטריפוגה את supernatant שוב ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.יש להכניס את 200 המיקרוליטרים של Supernatant P0 לצינור אחסון של פקק בורג של שני מיליליטר, ולאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להגברת הנגיף, השתמשו בקו תאי יתוש חסר Aedes albopictus RNAi C6/36 וקו תאי חולייתנים, כליה של אוגר תינוק, או BHK-21 מבקבוק מרובע של 75 סנטימטרים וזרעו אותם ב-24 צלחות באר בנפרד. מניחים את צלחת 24 הזרעים היטב לילה ב 28 או 37 מעלות צלזיוס.למחרת, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר מפגש של 80% עד 90% בכל באר. הכינו 500 מיליליטר של מדיום תחזוקת תרבית התא בתוספת אנטיביוטיקה. מוציאים את מדיום תרבית התאים מ-24 צלחות הבאר ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית התאים לכל באר.לאחר מכן לחסן את התאים עם 100 מיקרוליטר של supernatant של יתוש homogenate או P0. לדגור על הצלחות ב 28 או 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ולנער בעדינות את הצלחות לאחר כל 15 דקות כדי למנוע את התייבשות התאים. לאחר שתסיים, הסר את הסופרנאטנט ושטוף כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים כדי להסיר את הפסולת לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים לכל באר לפני שתניחו את הלוחות באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 28 או 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.מדי יום לפקח על מצב התאים של כל באר מתחת למיקרוסקופ. ביום השביעי, אספו את הסופרנאטנט של התאים המכונה P1 ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. חזור על התהליך כדי לאסוף סופרנאטנטים נגיפיים P2 ו- P3.בשל ההשפעה הציטופתוגנית, או CPE, תאים מחלק מהבארות מתים ומתנתקים מפני השטח. כדי להגביר מאוד את הנגיפים, אספו 300 עד 400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מבארות המראות את אפקט ה-CPE והעבירו אותו לצלחת חדשה בעלת שש בארות בעלת מפגש תאים של 80% עד 90% תאי תרבית. לבסוף, אספו והעבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהבארות של צלחת שש הקידוחים לצינורות אחסון של פקק בורג שני מיליליטר לפני אחסונם במינוס 80 מעלות צלזיוס.החיסון של תאי C6/36 עם יתוש homogenates P0 הציג חלל בין-תאי רחב בתאים exfoliated בתקופה של 120 שעות לאחר ההדבקה בהשוואה לתאים לא מחוסנים או ביקורת. דגירה של תאי BHK21 עם סופרנאטנטים נגיפיים P3 הדגימה CPE נראה לעין 48 שעות לאחר ההדבקה, והציגה את מות התא וניתוק מפני השטח בניגוד לתאי הביקורת. פריימרים אוניברסליים זמינים מסחרית או Flaviviruses, Alphaviruses ו Bunyaviruses שימשו כדי ליצור את מוצרי PCR עבור supernatant ויראלי.מוצר PCR עבור וירוס Bunyavirus, וירוס אגם אבינור, הוגדר כבקרה חיובית. איסורי הגברת ה-PCR בנתיבים השייכים ל-Bunyaviruses והשליטה החיובית הדגישו את האפשרות של נוכחות Bunyavirus בסופרנאטנטים. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של בידוד הנגיף, יש לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הובלת דגימות, בידוד וטחינה.מוסיפים אנטיביוטיקה כאשר הומוגניזציה של היתושים והתרבות עצמה. ולטפל בתרבות במהירות במהלך הדגירה והסרת מדיום התרבות. בנוסף להליך זה, ניתן להזריק את תמיסת הטחינה לחולדה מחזורית או לעובר תרנגולת.עם זאת, הליך האישור יעלה חששות אתיים ויגדיל את הוצאות הניסוי.

mosquito-associated-virus-isolation-from-field-collected-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

מקור: ליו, X. ואחרים. בדיקת האכלה חיידקית דרך הפה עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון הזה מדגים את ניתוח המעי האמצעי של היתושים כדי לבודד חיידקי מעיים. המעי האמצעי מופק ממערכת העיכול, עובר הומוגני לשחרור החיידקים, ומוצף על אגר נוטריינט לתרבית מושבות חיידקים.

בידוד חיידקים מהמעי הבינוני של היתוש

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

חקור שיטות בידוד וירוסים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים של Aedes albopictus ו-BHK-21. פרוטוקול זה מאפשר מחקר בטוח ובעל עמידה אתית בנוגע למחלות הנישאות על ידי יתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

גלה סרטונים נוספים