Name: ייצור של מיקרוגלים ציטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: למד שיטה לייצור מיקרוג'לים מצ'יטוזן ללא ממסים רעילים להנדסת רקמות ושחרור מושהה של תרופות. הטכניקה מאפשרת שליטה מדויקת בגודל וביישומים רפואיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שלד-שריר ועור של המכון הלאומי לבריאות תחת מספרי הפרס R03AR068087 ו- R21AR071585 ועל ידי קרן Boettcher (#11219) ל- MDK. CBE נתמך על ידי NIH / NCATS קולורדו CTSA מענק מספר TL1 TR001081.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו דנבר. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דאולי זכרות בנות 6 שבועות. מודל הפגיעה בלוחית הגדילה של החולדה נוצר בעקבות דו"ח30 שפורסם בעבר.
1. הכנת פולימר הצ'יטוזן
<ol><li>קבל צ'יטוזן מטוהר וליופיליזציה של משקל מולקולרי נמוך (LMW) ממקורות זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הוסיפו 495 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) ומוט ערבוב לכוס 1 ליטר. מוסיפים 5 גרם של צ'יטוזן (שלב 1.1)ומערבבים היטב. הערה: צ'יטוזן מסיס במשורה רק בתמיסה מימית ב-pH פיזיולוגי, כך שהצ'יטוזן לא יתמוסס בקלות בשלב זה.</li>
	<li>הוסיפו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לתמיסת הצ'יטוזן המוכנה לעיל.</li>
	<li>יש לערבב ב-300 סל"ד במשך 18 שעות כשהכוס מונחת באמבט מים שנערך בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באמצעות בקבוקון ומשפך של Büchner, סנן את תמיסת הצ'יטוזן באמצעות הקטנת הגדלים של נייר המסנן: 22 מיקרומטר, 8 מיקרומטר, 8 מיקרומטר ו-2.7 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הוסיפו את תמיסת הצ'יטוזן המסוננת לצינורות דיאליזה של תאית (ראו טבלת חומרים) ואפשרו דיאליזה ב-ddH2O בטמפרטורת החדר למשך 4 ימים, תוך שינוי ה-ddH2O מדי יום. הערה: השתמש במים ultrapure ddH2O לשינוי האחרון.</li>
	<li>העבר את תמיסת הצ'יטוזן עם דיאליז לכוס והתאם את ה- pH ל- 8.0 באמצעות NaOH 1 M.</li>
	<li>Aliquot את chitosan לתוך צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 4000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>נקו את הסופרנאטנט לזרם פסולת והחזירו את הצ'יטוזן ב-ddH2O, תוך חזרה על 2x.</li>
	<li>להקפיא ולאחר מכן ליופיליזציה של גלולת הצ'יטוזן.<ol>
<li>בכל יום, להסיר את המוצר lyophilized ולרשום את המסה. הערה: כאשר המסה של המוצר lyophilized כבר לא משתנה, המוצר מיובש לחלוטין וניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ייצור הידרוג'ל צ'יטוזן
<ol><li>הוסיפו 2 מ"ל של 6% חומצה אצטית ו-120 מ"ג של צ'יטוזן מטוהר (שלב 1) למזרק Luer-lock של 10 מ"ל כדי ליצור תמיסת צ'יטוזן של 6% w/v.</li>
	<li>חברו את מזרק ה-Luer-lock למזרק זהה אחר באמצעות מחבר Luer-lock נקבי-נקבי וערבבו את התמיסה קדימה ואחורה במשך 30 שניות, או עד שהצ'יטוזן מתמוסס במלואו בחומצה האצטית.</li>
	<li>לפני קישור צולב, הוסיפו כל חומר טיפולי או ביו-אקטיבי לתמיסת הצ'יטוזן (במידת הצורך). לצורך המחקר הנוכחי, 200 ננוגרם של SDF-1a ו-TGF-b3 (ראו טבלת חומרים) נוספו למיקרוגלים. הערה: SDF-1a ו- TGF-b3 הם חומרים ביו-אקטיביים הרלוונטיים להתחדשות רקמת צלחת הגדילה. SDF-1a מקדם נדידה של תאי גזע מזנכימליים לאתר הפגם, ו-TGF-b3 משמש כגורם כונדרוגני כדי לגרום להתמיינות של תאי גזע אלה במורד השושלת הכונדרוגנית31. הערה: ערבבו שוב את הצ'יטוזן בין המזרקים כדי לשלב באופן מלא את הטיפול.</li>
	<li>הכן 100 mM של תמיסת קרוסלינקר מלאי של גניפין (ראה טבלת חומרים) ב-100% אתנול.</li>
	<li>הוסיפו 100 μL של תמיסת הגניפין המוכנה (שלב 2.4.) למזרק המכיל צ'יטוזן, וערבבו שוב הלוך ושוב בין מזרקים במשך 30 שניות.</li>
	<li>מוציאים את התערובת מהמזרק לצלחת פטרי 35 מ"מ, מכסים אותה בסרט פרפין ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באווירה לחה. הערה: התמיסה תהפוך לכחולה כהה, מה שמעיד על כך שתגובת הקישור ההצלבה בין צ'יטוזן לגניפין התרחשה, מה שיוביל להיווצרות של מיקרוג'ל צ'יטוזן.</li>
	<li>סנן את המיקרוג'ל הצ'יטוזן המוכן בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>יש לשבור בעדינות את ההידרוג'ל לחתיכות קטנות יותר באמצעות מרית. הערה: החלקים צריכים להיות קטנים מספיק כדי להיות מועברים לחלק האחורי של מזרק 10 מ"ל, ~ 1-2 ס"מ קוטר.</li>
		<li>הניחו מסנן בגודל הרשת הרצוי בגבו של מזרק נקי של 10 מ"ל. הערה: טווח הגודל האופייני למיקרו-ג'לים הוא בין 50-200 מיקרומטר.</li>
		<li>מעבירים את חתיכות הג'ל השבורות למזרק המצויד במסנן ומוסיפים 6 מ"ל של ddH2O. הערה: ג'ל הצ'יטוזן יתנפח באופן משמעותי במדיום המיימי, ולכן צפוי שינוי גדול בנפח הג'ל.</li>
		<li>חברו את המזרק באמצעות מחבר Luer-lock למזרק נקי נוסף של 10 מ"ל.</li>
		<li>כפה את תערובת הג'ל + המים דרך המזרק עם המסנן כדי ליצור מיקרוג'לים בקוטר מקסימלי מוגדר.<ol>
<li>לאחר הסינון הראשון, פתחו את גב המזרק המכיל את המסנן והחזירו את התערובת למזרק זה.</li>
			<li>החלף את החלק האחורי של המזרק ואלץ את התערובת לעבור שוב את המסנן.</li>
			<li>חזור על הסינון 5-6x או עד שתהיה התנגדות מועטה דרך המסנן.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יש לשטוף ולטהר את המיקרוג'לים המסוננים.<ol>
<li>מעבירים את תערובת הג'ל המסוננת לצינור חרוטי של 50 מ"ל, מביאים את הנפח הכולל עד 20 מ"ל עם ddH2O, ואז מערבלים את התערובת כדי להבטיח פיזור הומוגני.</li>
		<li>צנטריפוגה המיקרוגלים ב 100 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ודקדק את הפאזה מימית העליונה.</li>
		<li>בצעו שימוש חוזר במיקרוגלים ב-10 מ"ל של 70% אתנול, מערבולת, והניחו תחת אור UV למשך שעה אחת כדי לעקר אותם.</li>
		<li>צנטריפוגות המיקרוג'לים ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, משליכים את האתנול ושוטפים 3x עם ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת מיקרוג'לים ליישומי in vitro או in vivo
הערה: עבור המחקר הנוכחי, התחדשות הסחוס בפציעות לוחות גדילה נחקרה במודל של חולדה. לפרטים ראו הפניה31.
<ol><li>Resuspend כדורי microgel 1:1 ב ddH2O. Microgels ניתן לאחסן עד 1 חודש מושהה ב ddH2O ב 4 °C (76 °F). אם נעשה שימוש בחומר ביו-אקטיבי, יש להשתמש במיקרוגלים באופן מיידי.</li>
	<li>צור את אתר הפציעה בבעל החיים בעקבות דו"ח30 שפורסם בעבר.</li>
	<li>שטפו את אתר הפציעה במי מלח ושמרו על בעל החיים ללא טיפול (לצורך מחקר בקרה) או הזריקו את המיקרוגלים של הצ'יטוזן בלבד או את המיקרוג'לים הטעונים בחומרים הביו-אקטיביים (שלב 3.2.).</li>
	<li>סגור את הפצע בבעל החיים ותן משככי כאבים לאחר הניתוח30.</li>
	<li>בימים 7 או 28 לאחר הניתוח, להרדים את החולדה על ידי מנת יתר של CO2 , לבלות את הגפיים ולבצע היסטולוגיה כדי להעריך את תיקון הרקמה באתר הפציעה31.</li>
</ol>

<ol><li>Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+of+the+incidence+of+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis of the incidence of physeal injuries.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).</li>
<li>Mann, D. C., Rajmaira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+physeal+and+nonphyseal+fractures+in+2%2C650+long-bone+fractures+in+children+aged+0-16+years%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).</li>
<li>Eid, A. M., Hafez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+injuries+of+the+distal+femoral+physis.+Retrospective+study+on+151+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases.</a> Injury. 33 (3), 251-255 (2002).</li>
<li>Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+physeal+closure+following+distal+tibia+physeal+fractures%3A+a+new+radiographic+predictor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).</li>
<li>Shaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+approaches+for+the+treatment+of+pediatric+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+growth+arrest%3A+current+practice+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Orthopaedics+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">Management of growth arrest: current practice and future directions.</a> Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).</li>
<li>Williamson, R. V., Staheli, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+physeal+growth+arrest%3A+treatment+by+bridge+resection+and+fat+interposition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).</li>
<li>Escott, B. G., Kelley, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+traumatic+physeal+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopaedics+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">Management of traumatic physeal growth arrest.</a> Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).</li>
<li>Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgels%3A+modular%2C+tunable+constructs+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).</li>
<li>Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+microporous+scaffold+of+densely-packed%2C+growth+factor-encapsulating+chitosan+microgels%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels.</a> Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).</li>
<li>Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+PEG+microgels+into+porous+cell-instructive+3D+scaffolds+via+thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160(2018).</li>
<li>Kim, P. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+multifunctional+microgel+encapsulating+outgrowth+endothelial+cells+and+growth+factors+for+enhanced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization.</a> Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).</li>
<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
<li>Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+and+chitosan+derivatives+for+biological+applications%3A+chemistry+and+functionalization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Carbohydrate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization.</a> International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1(2011).</li>
<li>Galdioli Pellá, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+hybrid+microgels+for+oral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery.</a> Carbohydrate Polymers. 239, 116236(2020).</li>
<li>Echeverria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+dual-stimuli+responsive+hybrid+PNIPAAm-chitosan+microgels%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%26+Design%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels.</a> Materials & Design. 86, 745-751 (2015).</li>
<li>Kim, M. Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+microgels+embedded+with+catalase+nanozyme-loaded+mesocellular+silica+foam+for+glucose-responsive+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).</li>
<li>Mora-Boza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+generation+of+chitosan+microgels+containing+glycerylphytate+crosslinker+for+in+situ+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation.</a> Materials Science and Engineering: C. 120, 111716(2021).</li>
<li>Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+biocompatible+chitosan+microgels+for+targeted+pH-mediated+intracellular+release+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics.</a> Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+the+mechanical%2C+interfacial%2C+and+emulsification+properties+of+chitosan+microgels%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels.</a> Food Hydrocolloids. 121, 106972(2021).</li>
<li>Fletcher, N. A., Krebs, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+delivery+of+anti-VEGF+from+injectable+hydrogel+systems+provides+a+prolonged+decrease+of+endothelial+cell+proliferation+and+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro.</a> RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).</li>
<li>Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+delivery+of+antibodies+from+injectable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels.</a> Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).</li>
<li>Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-interactive+alginate-chitosan+biopolymer+systems+with+tunable+mechanics+and+antibody+release+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates.</a> Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).</li>
<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+rate+of+alginate-chitosan+hydrogels+influences+tissue+repair+following+physeal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580(2020).</li>
<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-VEGF+antibody+delivered+locally+reduces+bony+bar+formation+following+physeal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research. , 24907(2020).</li>
<li>Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+murine+model+to+investigate+the+molecular+process+of+transphyseal+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).</li>
<li>Planka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+in+prevention+of+partial+growth+plate+arrest+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs.</a> Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+model+of+physeal+injury+for+the+evaluation+of+regenerative+medicine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).</li>
<li>Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+ossification+mechanism+for+bone+bridge+formation+at+the+growth+plate+cartilage+injury+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site.</a> Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).</li>
<li>Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+tibial+growth+plate+injury+model+to+characterize+repair+mechanisms+and+evaluate+growth+plate+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55571(2017).</li>
<li>Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion-free+chitosan-genipin+microgels+for+growth+plate+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Applications%22%5BJournal%5D)">Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration.</a> Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chitosan-coated+magnetic+alginate+microparticles+for+controlled+and+sustained+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).</li>
<li>Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+chitosan-grafted-poly%28N-vinylcaprolactam%29+microgels+via+ionotropic+gelation+for+oncological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1654(2021).</li>
<li>Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin-crosslinked+chitosan+gels+and+scaffolds+for+tissue+engineering+and+regeneration+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone.</a> Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).</li>
<li>Muzzarelli, R. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin-crosslinked+chitosan+hydrogels+as+biomedical+and+pharmaceutical+aids%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids.</a> Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+kinetics+of+the+crosslinking+reaction+between+biopolymers+containing+primary+amine+groups+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science+Part+A%3A+Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).</li>
<li>Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+migration+ability+of+mesenchymal+stromal+cells+by+targeting+the+SDF-1%2FCXCR4+axis%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis.</a> BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).</li>
<li>Tang, Q. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B23%3A+A+potential+biological+therapy+for+enhancing+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).</li>
<li>Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+particle+shape+in+size+analysis+and+the+evaluation+of+comminution+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Particulate+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes.</a> Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).</li>
<li>Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+physicochemical+characterization+of+nanoparticles+in+pharmaceutical+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Fundamentals+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development.</a> Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מיקרוג'לים נחקרו באופן נרחב בשנים האחרונות בשל רמת הישימות הגבוהה שלהם למטרות שונות, כגון אספקת תרופות או אנקפסולציה של תאים9. קלות הייצור של מבנים ביו-חומריים בקנה מידה זעיר היא בעלת רלוונטיות משמעותית בהנדסת רקמות, מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים לפתח אסטרטגיות מבוססות הידרוג'ל בגודל ובקנה מידה מסוים של זמן. עם זאת, רוב השיטות לייצור מיקרוג'לים צ'יטוזן דורשות ציוד וריאגנטים יקרים, תחליבים או שטיפות ממסים ציטוטוקסיים, מה שמונע את תרגומם לשימוש קליני 15,16,17,18,19,20.</sup...

לוח הגדילה, הידוע גם בשם הפיזה, הוא מבנה הסחוס הממוקם בקצה העצמות הארוכות המתווך צמיחה אצל ילדים. אם צלחת הגדילה נפגעת, יכולה להיווצר רקמת תיקון המכונה "מוט גרמי", אשר קוטעת את הצמיחה הרגילה ועלולה לגרום לפגמים בגדילה או לעיוותים זוויתיים. נתונים אפידמיולוגיים הראו כי 15%-30% מכלל פציעות השלד בילדות קשורות ללוחית הגדילה. היווצרות מוטות גרמיים מתרחשת בעד 30% מהפציעות הללו, מה שהופך את הפציעות של לוחות הגדילה והטיפול הקשור אליהן לבעיה משמעותית של ביטוי קליני 1,2,3,4. כאשר מתרחשת היווצרות מוטות גרמיים, שדרת הטיפול הנפוצה ביותר כוללת כריתה של המוט הגרמי והחדרת חומר אינטרפוזיציוני, כגון סיליקון או רקמת שומן5. עם זאת, לחולים שעוברים ניתוח כריתת בר גרמי יש לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה להחלמה מלאה, שכן אין כיום טיפול שיכול לתקן באופן מלא לוחית גדילה פצועה 6,7,8. לאור חסרונות אלה, קיים צורך קריטי באסטרטגיות יעילות לטיפול בפציעות של לוחות גדילה, הן במניעת היווצרות מוט גרמי והן בחידוש רקמת סחוס גופנית בריאה.
מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל, או מיקרו-ג'לים, צברו לאחרונה עניין כפיגומים הניתנים להזרקה שיכולים לספק שחרור מתמשך של טיפולים9. בשל יכולת הכוונון הגבוהה וההתאמה הביולוגית שלהם, מיקרו-ג'לים מתאימים גם לגורם ביו-אקטיבי או לעטיפת תאים. מיקרוג'לים יכולים להיות עשויים מחומרים שונים, החל מפולימרים סינתטיים, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), ועד פולימרים טבעיים כמו אלגינט או צ'יטוזן 10,11,12. הודגם כי לצ'יטוזן יש מספר השפעות מועילות על הנדסת רקמות, כגון יכולתו לערער את הממברנה החיצונית של חיידקים גראם שליליים, ובכך להציע פעילות אנטי-מיקרוביאלית מובנית1 3,14. בנוסף, chitosan הוא חסכוני, אינטראקטיבי לתאים, ומשתנה בקלות באמצעות המבנה המכיל אמין שלו. מיקרוג'לים מבוססי צ'יטוזן מבטיחים אסטרטגיה חומרית ביולוגית להעברת תרופות ואיתות חומרים שיכולים לקדם התחדשות רקמות תוך מניעת זיהום חיידקי. עם זאת, מיקרוג'לים צ'יטוזן מיוצרים לעתים קרובות עם מגוון רחב של טכניקות הדורשות ציוד מיוחד, טכניקות תחליב או שטיפות ממסים ציטוטוקסיים. לדוגמה, מחקרים מסוימים יצרו מיקרו-ג'לים צ'יטוזן בשיטות מבוססות תחליב, אך פרוטוקולים אלה דורשים שטיפות ממסים והצלבות ציטוטוקסיות, מה שעלול לשלול את תרגומם להגדרות קליניות15,16. מחקרים אחרים השתמשו בגישות מיקרופלואידיות או אלקטרוספריי כדי לייצר מיקרוג'לים של צ'יטוזן, הדורשים ציוד מיוחד, הכנה והכשרה17,18. מיקרוגלים של צ'יטוזן מיוצרים בדרך כלל גם בתהליך טיפתי של קרוסלינקר לתמיסת צ'יטוזן; עם זאת, שיטה זו תלויה מאוד בצמיגות התמיסה, בריכוז הפולימרים ובקצב הזרימה, מה שמקשה על שליטה בגודל ובפיזור של המיקרוג'לים19,20. לעומת זאת, השיטה לייצור מיקרוג'ל המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מומחה או שטיפות ממסים, מה שהופך את המיקרוג'לים הללו לכדאיים לייצור כמעט בכל מעבדה או סביבה. לכן, מיקרוג'לים אלה מייצגים ביו-חומרים רלוונטיים ביותר עבור כלי מהיר, חסכוני וקל לייצור של תרופות עבור יישומים רבים.
על ידי ויסות הרכב המיקרוג'ל ומאפייני החומר, חוקרים יכולים להשיג שליטה מדויקת על המיקרו-סביבה התאית, ובכך לכוון את התנהגות התאים באופן התלוי בחומר. ניתן להשתמש במיקרוג'לים בכוחות עצמם או בשילוב עם מערכות חומר ביולוגי בתפזורת כדי להקנות פונקציות ספציפיות, כגון שחרור ממושך של גורמים ביו-אקטיביים או איתות מיוחד מדויק לתאים מקומיים או אקסוגניים. ביו-חומרים ומיקרו-ג'לים התגלו כאפיקי טיפול אטרקטיביים לפציעות בלוחות גדילה. מאמץ משמעותי הוקדש לפיתוח ביו-חומרים מבוססי אלגינט וצ'יטוזן לטיפול בפציעות של לוחות גדילה 21,22,23,24,25. בשל האופי הזמני הדינמי של אוסיפיקציה של צלחת גדילה והתארכות עצם, המנגנון של היווצרות מוטות גרמי אינו מובן במלואו. לכן, פותחו מספר מודלים של בעלי חיים כדי להבהיר טוב יותר את המנגנונים של אוסיפיקציה אנדוכונדרלית והיווצרות מוטות גרמיים, כגון בחולדות, ארנבות וכבשים 26,27,28. מודל אחד כזה הוא מודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה, המשתמש בפגם חור מקדחה בשוקת החולדה כדי לייצר מוט גרמי באופן צפוי וניתן לשחזור ומחקה פציעות אנושיות בכל שלושת האזורים של לוחית הגדילה29,30. מספר אסטרטגיות מבוססות חומר ביולוגי לטיפול בפציעות של לוחות גדילה נבדקו באמצעות מודל זה. בנוסף, פותחו שתי שיטות שונות לייצור מיקרוגלים צ'יטוזן, שיכולות לשמש כמערכת חומרית ביולוגית הניתנת להזרקה המשחררת טיפולים באופן מתמשך10,31. מיקרו-ג'לים אלה הוכנסו למודל של פגיעה גופנית בחולדה, והם הראו שיפור בהתחדשותהסחוס 31 בעת שחרור SDF-1a ו-TGF-b3. הטכניקות המסופקות בפרוטוקול זה מתארות שיטות שפותחו לייצור מיקרו-ג'לים צ'יטוזן אלה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים להנדסת רקמות. לדוגמה, מחקרים אחרונים השתמשו במיקרוגלים של צ'יטוזן המגיבים לתרמו או מג'נטו עבור יישומי אספקת תרופות אונקולוגיות מבוקרות32,33.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>SigmaAldrich</td><td>AX0073</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרק Luer-Lock</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner משפך</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB966F</td><td>קוטר 100 מ"מ</td></tr><tr><td>צ'יטוזן (משקל מולקולרי נמוך)</td> <td>SigmaAldrich</td><td>448869</td><td>75-80% דה-אצטילציה</td></tr><tr><td>צינורות ממברנה דיאליזה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-670-5C</td><td>3500 MWCO</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמאאולדריץ'</td><td>493538</td><td></td></tr><tr><td>ג'ניפין</td><td>סיגמאאולדריץ'</td><td>G4796</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i חממה</td><td>ThermoFisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי SDF-1a</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TGF-b3</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>Whatman סינון נייר כיתה 540</td><td>SigmaAldrich</td><td>Z241547</td><td>8 מ"מ נקבוביות</td></tr><tr><td>גודל Whatman סינון נייר כיתה 541</td><td>SigmaAldrich</td><td>WHA1541055</td><td>22 מ"מ גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>Whatman נייר סינון כיתה 542</td><td>SigmaAldrich</td><td>WHA1542185</td><td>2.7 מ"מ גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>מסננת רשת תיל</td><td>McMaster-Carr</td><td>9317T86</td><td>מס' 100 רשת</td></tr></tbody></table>

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

מיקרוגלים של Chitosan הם בעלי עניין משמעותי בהנדסת רקמות בשל מגוון רחב של יישומים, עלות נמוכה ואימונוגניות. עם זאת, מיקרוג'לים צ'יטוזן מיוצרים בדרך כלל בשיטות תחליב הדורשות שטיפות ממס אורגניות, שהן רעילות ומזיקות לסביבה. הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, לא ציטוטוקסית, לא מבוססת תחליב, לייצור מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפין ללא צורך בשטיפות ממס אורגניות. ניתן לייצר את המיקרוג'לים המתוארים כאן עם בקרת גודל מדויקת. הם מציגים שחרור מתמשך של ביומולקולות, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד להנדסת רקמות, ביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית. Chitosan הוא crosslinked עם genipin כדי ליצור רשת הידרוג'ל, ולאחר מכן מועבר דרך מסנן מזרק כדי לייצר את microgels. ניתן לסנן את המיקרוג'לים כדי ליצור מגוון גדלים, והם מראים נפיחות תלוית pH ומתפרקים עם הזמן באופן אנזימטי. מיקרוג'לים אלה שימשו במודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה והודגמו כמעודדים תיקון מוגבר של רקמות הסחוס ומראים פירוק מלא לאחר 28 ימים in vivo. בשל העלות הנמוכה שלהם, הנוחות הגבוהה וקלות הייצור שלהם עם חומרים cytocompatible, מיקרוג'לים chitosan אלה מציגים טכנולוגיה מרגשת וייחודית בהנדסת רקמות.

ייצור מוצלח של מיקרוגלים צ'יטוזן מסתמך על תגובת ההצלבה בין גניפין לצ'יטוזן, במיוחד המערבת את האמינים בשרשראות הפולימרים של הצ'יטוזן. בניגוד לטכניקות אחרות לייצור מיקרוג'ל, שיטה זו אינה דורשת תחליבים או שטיפות ממסים וניתן לבצע אותה במהירות ובקלות עם ציוד זול. סימן היכר לייצור מוצלח של מיקרוג'ל הוא שינוי הצבע המובהק מאוף-ווייט לכחול כהה לאחר שהכיטוזן והגניפין התערבבו. התגובה ההצלבה בין גניפין לתרכובות המכילות אמין, כגון צ'יטוזן או חלבונים אחרים, אופיינה היטב בספרות34. בקיצור, מנגנון ההצלבה נחשב להתק...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ'יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג'לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...

פרוטוקול זה מאפשר ייצור נוח של מיקרוג'לים צ'יטוזן ללא ממסים רעילים שיכולים לשמש למגוון יישומי הנדסת רקמות ואספקת תרופות. טכניקה זו אינה דורשת ציוד או אימון מיוחד ואינה דורשת טכניקות תחליב רעילות או שטיפות ממס, מה שהופך אותה להתאמה ביולוגית גבוהה וניתנה לתרגום למסגרת קלינית. יישמנו טכניקה זו כאסטרטגיה של חומר ביולוגי לטיפול בפציעות של לוחות גדילה.עם זאת, אנו מאמינים כי טכניקה זו תהיה שימושית גם ביישומים אחרים של רפואה רגנרטיבית. ניתן ליישם טכניקה זו על יישומים אחרים של רפואה רגנרטיבית אשר ייהנו ממערכת פיגומים ביולוגית הניתנת להזרקה, מתכלה, עם פוטנציאל לשחרור תרופתי מתמשך. התחילו בהוספת חומצה אצטית וצ'יטוזן מטוהר למזרק מנעול לואר 10 מיליליטר כדי ליצור תמיסת צ'יטוזן במשקל של 6%.באמצעות מחבר נעילת לואר נקבה נקבה, חברו שני מזרקי מנעול לואר, ואז ערבבו את התמיסה קדימה ואחורה עד שהצ'יטוזן פנימה נמס במלואו בחומצה הסגפנית. כעת מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תמיסת הגניפין למזרק המכיל צ'יטוזן ומערבבים קדימה ואחורה בין המזרקים למשך 30 שניות, ואז פולטים את התערובת מהמזרק לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. מכסים את צלחת הפטרי בסרט פרפין ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באווירה לחה.השתמשו במרית כדי לשבור את ההידרוג'ל לחתיכות קטנות יותר, ואז הניחו מסנן של גודל הרשת הרצוי לתוך גבו של מזרק נקי של 10 מיליליטר. מעבירים את חתיכות הג'ל השבורות למזרק המצויד במסנן ומוסיפים 6 מיליליטרים של מים מזוקקים כפולים. חברו את המזרק באמצעות מחבר נעילת Luer למזרק 10 מילימטר נקי אחר.דחפו את תערובת הג'ל והמים דרך המזרק עם המסנן כדי ליצור מיקרוג'לים. לאחר הסינון הראשון, פתחו את המזרק המכיל את המסנן והוסיפו את התערובת בחזרה למזרק זה. דחפו את התערובת שוב דרך המסנן.כעת, מעבירים את תערובת הג'ל המסוננת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומוסיפים מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח ל-20 מיליליטר. וורטקס את הפתרון כדי לקבל פתרון הומוגני. צנטריפוגה המיקרוגלים ב 100 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר צנטריפוגה, הסר את הפאזה המימית העליונה והחזיר את המיקרוג'לים ל-10 מיליליטרים של 70% אתנול, ולאחר מכן סובבו את המיקרוג'לים והניחו אותם תחת אור UV למשך שעה אחת כדי לעקר אותם. כעת, צנטריפוגות המיקרוג'לים ב 1000 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את האתנול ולשטוף 3 פעמים במים מזוקקים כפולים.יש להחיות את כדורי המיקרוגל בנפח שווה של מים מזוקקים כפולים. עם העלייה ב- pH, המיקרוגלים הראו ירידה בנפיחות כפי שמתואר על ידי השינוי בקוטר ה-Feret. כמו כן, גודלם של חלקיקי המיקרוג'ל תלוי בגודל הנקבוביות של המסנן שבו נעשה שימוש.מספר 200 רשת יצר חלקיקים קטנים, בעוד שמספר 100 רשת הוליד חלקיקים גדולים. הימצאותם של מיקרוג'לים באתר הפצוע קידמה את התחדשות הסחוס. צביעת המטוקסילין כחולה אלקיאנית הראתה כי מיקרוגלים שהוזרקו לרקמה הפצועה מנעו היווצרות מוטות גרמיים מוקדמת, ומיקרוג'לים עמוסים בחומרים ביו-אקטיביים SDF-1a ו-TGF-B3 קידמו את היווצרות הסחוס.חשוב לוודא כי מסנן רשת החוטים ממוקם כראוי לתוך המזרק, כך שניתן יהיה לבצע סינון יעיל. חשוב גם לחזור על הסינון כמה פעמים כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של גודל המיקרוג'ל. מיקרוג'לים אלה יכולים להיות מיושמים על מגוון רחב של יישומים הנדסיים של רקמות הדורשים מצע פיגום ביו-חומרי שיש לו פוטנציאל לשחרור מתמשך של טיפולים.

fabrication-size-controlled-emulsion-free-chitosan-genipin-microgels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

אנו מציגים שיטה קלילה לפברק פלטפורמת שחרור תרופה מתכלה מבוסס ג'לטין כי הוא מגנט-תרמית תגובה. זו הושגה על ידי שילוב חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי ו poly (N-isopropylacrylamide- שיתוף -acrylamide) בתוך רשת מיקרו ג'לטין כדורית crosslinked ידי genipin, בשיתוף עם מערכת יישום השדה המגנטי לסירוגין.

מוני Microgels לטין היברידי שדה-Responsive המגנטי לשחרור סמים מבוקר

פיגום הנדסת רקמות בזריקות מורכב פולי (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAm-ז-CS) microparticles אלגינט המכילים הוכן. כוחו הדבק, נפיחות נכסים ב biocompatibility במבחנה מנותח במחקר זה. טכניקות האפיון שפותחו כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

Free Free solution אלקטרופורזה נימית היא שיטה אנליטית מהירה, זולה וחזקה המאפשרת ניטור כמותי של תגובות כימיות בזמן אמת. התועלת שלו לניתוח מהיר, נוח ומדויק מודגמת כאן באמצעות ניתוח השתלת פפטיד קוולנטי על סרטי צ'יטוזן לשיפור הידבקות התאים.

אלקטרופורזה הנימים לפקח פפטיד האריך על Chitosan סרטים בזמן אמת

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

המוצג כאן הוא שיטה עבור ביופסיה 3D של ג'לטין מתיאקריל.

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

מוצג כאן היא טכניקת הדפסה 3D מתון מונע על ידי כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין כדי לאפשר את הבנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל. חרירים תוצרת בית מציעים גמישות, ומאפשרים החלפה קלה לחומרים וקטרים שונים. מיקרוקארים מחייבים תא בקוטר של 50-500 מיקרומטר ניתן להשיג ולאסוף עבור culturing נוסף.

הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין

עבודה זו מתארת שיטות פשוטות, ניתנות להתאמה ובעלות נמוכה לייצור מיקרוג'לים עם פיצול שחול, לעבד את המיקרוג'לים להידרוג'לים גרגיריים הניתנים להזרקה, וליישם את ההידרוג'לים הגרעיניים כדיו להדפסת שחול עבור יישומים ביו-רפואיים.

פיצול הידרוג'לים בתפזורת ועיבוד להידרוג'לים גרעיניים ליישומים ביו-רפואיים

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שיטות לסינתזה של אבני הבניין של המיקרוג'ל עבור פיגומים של חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים, אשר יכולים לשמש למגוון יישומי רפואה רגנרטיבית.

סינתזה מיקרופלואידית של אבני בניין מיקרוג'ל עבור פיגום חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים

למד שיטה לייצור מיקרוג'לים מצ'יטוזן ללא ממסים רעילים להנדסת רקמות ושחרור מושהה של תרופות. הטכניקה מאפשרת שליטה מדויקת בגודל וביישומים רפואיים שונים.

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

גלה סרטונים נוספים