הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנן חיידקים עם השפעה על עמידות לעקה תרמית חמצונית של C.elegans בשני זני C.elegans על 48 חיידקים מבודדים במקביל. גישה זו היא רב-תכליתית ומדרגית. הוא מאפשר סינון מהיר של מצבים מרובים עם השפעה על C.elegans נגד בריאות, אשר ישים לחקר מנגנונים של בריאות ומחלות.

באמצעות שימוש בעמידות ללחץ כפרוקסי לבריאות, צינור זה ישים בקלות להקרנה פרה-קלינית של תרופות, תרופות אנטי-דלקתיות ופרוביוטיקה על מודלים של מוטציה נמטודה, נוק-דאון, מהונדסים ומחלות. היכולת לבחון תנאים רבים במקביל מאפשרת לחקור אינטראקציות מורכבות המעורבות ולשרת תהליכים פיזיולוגיים. אלה כוללים אינטראקציות בין מיקרובים מארחים, הפרעות מטבוליות, טיפול בסטרס והזדקנות.

זה קריטי כדי למנוע זיהום לאורך כל הדרך. אין לאפשר לתולעים להיגמר במזון, ולבצע צעדים מרכזיים ברגע שהתולעים מגיעות לשלב הנדרש. התחל עם הכנת תרבית מרוכזת של חיידקי E.coli OP50 על ידי חיסון ארבעה בקבוקי מרק ליזוגני של ליטר אחד עם שני מיליליטר של תרבית התחלה OP50 כל אחד.

לאחר מכן מניחים את הבקבוקים באינקובטור רועד למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-160 גרם, ולאחר מכן פולטים את החיידקים ב-3057 גרם וב-20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופר-נאטנט והשעו מחדש את הכדורים עם שישה מיליליטר של OP50 בינוני. לאסוף את התרבות המרוכזת בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר.

לחסן שמונה צלחות NGM של שישה סנטימטרים לכל זן עם 100 מיקרוליטרים של תרבית OP50 רוויה שגדלה בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לצלחת. לאחר מכן יש לשמור את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני השימוש. לאחר מכן חותכים נתח אגר מרובע של 0.5 ס"מ עם תולעים מצלחת NGM שהורעבה לאחרונה באמצעות אזמל, ומעבירים לכל אחד משמונת לוחות ה-NGM המחוסנים בשישה סנטימטרים.

דגירה של צלחות אלה ב 20 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר מכן, השהה מחדש את התולעים על ידי הוספת עד שלושה מיליליטר של חיץ M תשע סטרילי ללוחות NGM של שישה סנטימטרים באמצעות פיפטה P1000, ואסוף את תמיסת התולעת מכל שמונה הצלחות לכל זן בצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה ב 142 פעמים G במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהסיר בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה P5000 או משאבת מים מצויד פיפטה סטרילית פסטר או קצה.

לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ M תשע סטרילי לשטוף את כדור התולעת. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והעבר את התולעים לצלחת NGM מחוסנת OP50 באורך 15 ס"מ בתוספת OP50 מרוכזת באמצעות פיפטה. הגדל כל זן תולעת על צלחת NGM בקוטר 15 ס"מ במשך שלושה עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס על ידי האכלה מחדש של התולעים עם 0.5 מיליליטר של OP50 מרוכז מדי יום.

לאחר איסוף ושטיפה של מאגר M 9, מעבירים כל תרבית זן תולעים ליותר צלחות NGM, ומפיצים תולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד ש-95% מהאוכלוסייה הם בוגרים כבידים. לאחר מכן הלבינו את התולעים הבוגרות על ידי ביצוע שיטת הכנת הביצים הסטנדרטית, והעבירו את הביצים על שתי צלחות NGM בגודל 15 ס"מ לא מזוהות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לכל הזחלים L one לבקוע ולגדול באופן סינכרוני בשלבים הבאים. ראשית, אספו את כל מסת החיידקים שגדלה בעבר על צלחת אגר LB של שישה סנטימטרים, והעבירו אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ M 9.

לאחר מכן מערבלים את צינור המיקרוצנטריפוגה עד שכדורי החיידקים מושעים מחדש לחלוטין. לאחר מכן, סובבו כלפי מטה ב-9, 300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והסירו 700 מיקרוליטרים של סופר-נטנט. שוב להשעות מחדש את כדור החיידקים על ידי מערבולת.

לאחר מכן, להעביר 200 מיקרוליטר של כל תרחיף חיידקים לתוך באר אחת של צלחת סטרילית ריקה 96 באר. מצלחת זו, יש לחסן שמונה צלחות אגרוז NGM 96 באר עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת חיידקים באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ולדגור עם המכסה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, אטמו את לוח התלייה 96 היטב עם סרט תקרה דבק נקי, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך עד חמישה ימים.

כדי להתחיל, להעריך את השלב ההתפתחותי של אוכלוסיית תולעים מסונכרנת על ידי התבוננות בצלחות. לאחר שיותר מ-90% מהתולעים הגיעו ל-L 4, אספו את התולעים בעד 10 מיליליטר של תמיסת M nine סטרילית בצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את התולעים באופן נרחב במשך ארבע פעמים על ידי סיבוב בטמפרטורה של 142 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך הוספת 10 מיליליטר של M סטרילי טרי תשע בין כל שטיפה כדי להיפטר מחיידקי OP50.

לאחר מכן להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את כדור התולעת ב 10 מיליליטר של M תשע. העבר 50 מיקרוליטר של תמיסת תולעת לתוך צינור קשירה נמוך של 1.5 או שני מיליליטר המכיל 950 מיקרוליטר של M 9. לאחר ערבוב עדין של תכולת הצינור כדי למנוע שקיעה של תולעים, השתמש במהירות בקצה פיפטה נמוך רטוב כדי להעביר שלוש עד ארבע טיפות נפרדות של 10 מיקרוליטר על מגלשת זכוכית או צלחת NGM.

תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 16, סופרים את מספר התולעים וממוצעים של ספירות משלוש עד ארבע טיפות כדי לקבוע את מספר התולעים למיקרוליטר בתמיסת התולעת. התאם את ריכוז התולעים ל-15 תולעים למיקרוליטר בצינור החרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן העבר שמונה מיקרוליטרים של תמיסת תולעת לכל אחת מהבארות של שמונה לוחות האגרוז NGM 96 באמצעות פיפטה רב-ערוצית או פיפטה חוזרת.

לאחר 36 שעות, יש לחלק 30 מיקרוליטרים של M תשע לתוך כל באר של צלחת 96 באר. לאחר מכן, העבר תולעים לצלחת הבאר 384 בהתאם לפריסות שנקבעו באמצעות טיפים לשמירה נמוכה, כדי להבטיח שקוראי הלוחות מוגדרים כראוי. לאחר מכן, הוסיפו את 384 לוחות הקידוח עם יותר M 9, תוך שאיפה לנפח סופי של 60 מיקרוליטר לבאר על ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של M nine לבדיקת עקה תרמית ו-34 מיקרוליטרים של M nine בשישה מיקרוליטרים של TBHP לעקה חמצונית הנגרמת על ידי TBHP.

לאחר מכן התחל את הבדיקה תוך שתי דקות מהוספת TBHP. לאחר מכן, סגור את הצלחות עם המכסה השקוף שלהם, ואטם את הקצוות של 384 צלחות היטב עם סרט מיסוך, להבטיח כי הקלטת לא לעבור על המכסה או מתחת לצלחת. לאחר מכן הכנס את הצלחת לקורא הלוחות.

קבעו ערך פלואורסצנטי שמתחתיו שיא לא יהיה שונה באופן משמעותי מרעש, ושימו לב לנקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה תנודות פלואורסצנטיות נרגעות לפני שהן עולות. לאחר מכן שים לב לנקודות הזמן שביניהן צפויים לרדת ערכי פלואורסצנציה מינימליים ומקסימליים, מכיוון שהם ישמשו להתאמת עקומה. לאחר מכן, בדקו אם המשרעת של פסגות הפלואורסצנציה משתנות באופן משמעותי בין הבארות.

נרמל את הנתונים לפני ניתוח נוסף באמצעות הנוסחה כמתואר בכתב היד. ראשית, הורד LFASS מ- GitHub, והפעל את MATLAB, ונווט לתיקיית LFASS. לאחר מכן הקלד והפעל תיקיית התאמה בחלון הפקודה, בהתאם להוראות שעל המסך.

לאחר הקלדת התיקיה המתאימה, הקלד את שם תיקיית הנתונים שבה קובץ Excel ממוקם כנתונים שלי. לאחר מכן הזן שניים עבור מרווח הזמן בין מדידות עוקבות בפרוטוקול הנוכחי, והקלד את ערך סף הרעש. לאחר מכן, הקצה את סף הסבילות העליון על ידי הקלדת 0.94, ואת סף הסובלנות התחתון על ידי הקלדת 0.06 כדי להגביל את ההתאמה הסיגמואידית.

הגדר מרווחי זמן כדי למצוא ערכי מקסימום ומינימום. כדי לבדוק באופן חזותי את התאמות ההתכנסות, הקלד Y עבור כן או N עבור לא עבור לא עבור אי הצגת קימורים מותאמים וחלקים כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר מכן, ספק גבולות זמן חדשים, תחתונים ועליונים כדי לנסות להתאים מחדש.

אם ברצונך לנסות לבצע את השיפוץ, הקלד שתיים. אבל אם ברצונך לקבל את השיפוץ ולעבור לעקומה הבאה, הקלד אפס. על מנת לבחור אם לנתח עקומות המזוהות כרעש או להתאים מחדש עקומות שאינן מותאמות היטב, סוג Y כדי לאשר ו- N כדי לדחות.

לאחר ניסיון שיפוץ או דחייה עבור כל העקומות הנותרות, התוכנית מסתיימת. אחזר קבצי תוצאות מתיקיית התוצאות ושמור כנקודה XLSX לניתוח במורד הזרם. מבחני עמידות לחום ולעקה חמצונית בוצעו על בריסטול N שתי תולעי בר, שהוזנו מחיידקים מבודדים מסוג MYB11 או MYB115 או מחיידקי בקרת E coli OP50.

לאחר 36 שעות, אוכלוסיות תולעי הבר הבוגרות נחשפו לעקה תרמית של 42 מעלות צלזיוס ולעקה חמצונית הנגרמת על-ידי 7% TBHP. זמן המוות החציוני נע בין 40 ל-130 דקות לבדיקת העקה התרמית, ובין 90 ל-240 דקות לבדיקת העקה החמצונית. כדי לוודא שהתולעים גדלות בשלב 2.5, ושלב 2.1 עשוי להימשך עד שעתיים, ציירו פריסת צלחת להכנת תולעים מ-96 באר ל-284 צלחות קידוח בשלב 4.6.

ניתן להוסיף או להחליף שלבים. לדוגמה, ניתן לבצע מסכי RNA רחבים של הגנום המארח או מסכים גנטיים של חיידקים על ידי החלפת חיידקי מעיים מבודדים בשיבוטים של RNI או מוטציות חיידקיות בהתאמה. לכן אנו משתמשים כעת בגישה זו כדי לזהות חיידקים פרוביוטיים חדשים ולחשוף רשתות לוויסות גנים המעורבות במיקרו-אינטראקציות של מארחים בהקשר של זיהומים והזדקנות.