מלמטה למעלה בשיטות במבחנה כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות

באמצעות פרוטוקול זה, דמיינו את הארגון של חלבונים נימה ציטוסקטליים על מצעי תבנית המציגים עקמומיות שונות. אנו יכולים לבדוק את רגישות העקמומיות. הרזולוציה של תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות גבוהה מספיק כך שארגונים בקנה מידה ננומטרי מוצגים באופן חזותי.

השיטות בהן אנו משתמשים לקיבוע הן מתונות מספיק כדי לשמר את הארגון התוך-מבני של החלבון. זה נשאר במסגרת מחקר בסיסי כדי להבין את ההתנהגות של חוטים cytoskeletal. התחילו בתכנון דבק אופטי גלי של נורלנד, או העתק NOA, בסביבת חדר נקי מדפוסים גליים של פולידימתילסילוקסן גלי של משרעת 250 ננומטר ומחזוריות רוחבית של שני מיקרומטרים.

כדי לעשות זאת, הפקיד חמישה מיקרוליטרים של NOA נוזלי על כיסוי זכוכית עגול בקוטר של סנטימטר אחד ולאחר מכן הנח את תבנית PDMS על הטיפה. טפלו במכלול עם אור UV בגודל 320 ננומטר למשך חמש דקות כדי לבצע פוטופולימריזציה של ה-NOA הנוזלי לסרט פולימרי דק. לאחר שתסיימו, קלפו בעדינות את תבנית ה-PDMS ממחליק הכיסוי עם NOA הפולימרי הטרי.

טפלו בסרט NOA באמצעות מנקה אוויר במשך חמש דקות כדי להפוך את פני השטח להידרופיליים. הכינו תמיסה של שלפוחיות חד-שנתיות קטנות, או רכבי שטח, כפי שמתואר בכתב היד, והשיגו את רכבי השטח על ידי החייאת סרט שומנים מיובש במאגר התצפית מתחת לסוניקציה בסוניק אמבטיה למשך חמש עד 10 דקות עד שהתמיסה תהיה שקופה. מאוחר יותר, הכנס את תלושי הכיסוי התומכים בתבניות NOA בתוך הבארות של תיבות תרביות תאים ודגר את תבניות ה- NOA הזוהרות שזה עתה השתחררו עם 100 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד לתמיסת SUV של מיליליטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור דו-שכבת שומנים נתמכת.

כדי להסיר את רכב השטח הלא מזוהם, שטפו את הצדדים ביסודיות שש פעמים עם חיץ מלח נמוך ספטין מבלי לתת לדגימה להתייבש לחלוטין בין שתי שטיפות. יש לדלל את תמיסת מלאי המחיצות האוקטומריות במאגר מלח נמוך ספטין לריכוזים סופיים, הנעים בין 10 ל-100 ננומולר ונפחים של מיליליטר אחד. לאחר מכן, דגרו את תמיסת החלבון על השקופיות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שטפו את שקופיות NOA המכילות דו-שכבתיות שומנים נתמכות שהתמזגו ודגרו חלבון עם חיץ מלח נמוך ספטין. החלף את חיץ המלח הנמוך של ספטין בתמיסה מתקבעת של 2% גלוטראלדהיד בחיץ נתרן קקודילאט טוחן 0.1, שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס, ותן לתגובה להמשיך במשך 15 דקות, ושטוף את הדגימה הקבועה שלוש פעמים, חמש דקות כל אחת עם 0.1 נתרן קקודילאט טוחן. לאחר הכביסה, לדגוגר את הדגימה בתמיסה המקובעת של אוסמיום טטרוקסיד, לאחר מכן את חומצה tannic מסונן, ולבסוף אורניל אצטט מסונן במשך 10 דקות כל אחד.

שטפו את הדגימה שלוש פעמים במים מזוקקים לאחר כל תמיסה. דגירה של הדגימה באופן סדרתי בתמיסות אתנול החל מ-50% עד 100% למשך שתיים עד שלוש דקות כל אחת. העבירו את מגלשות הזכוכית בתוך מייבש הנקודות הקריטיות הממולא מראש באתנול ופעלו לפי הוראות היצרן לייבוש.

מכיוון שדגימות יבשות הן הידרוסקופיות מאוד, מצפים אותן מיד על ידי הצמדת הכיסוי לשקעים. לאחר מכן הוסיפו רצועה של צבע כסוף לפנים העליונות של תלוש הכיסוי מבלי ליצור deglomerates צבע. ודא כי החיבור עם stub הוא משביע רצון.

כאשר הדגימה מתאדה לחלוטין, השתמש במנגנון המצויד בראש מפיץ מגנטרון פלזמה ובשלב פלנטרי סיבובי, ופעל לפי פרוטוקולים סטנדרטיים המסופקים על ידי היצרן. בצע התזת מקדים במהירות של 120 מיליאמפר למשך 60 שניות כדי להסיר את שכבת התחמוצת מפני השטח. לאחר מכן להפקיד 1.5 ננומטר של טונגסטן עם צג עובי הסרט ב 90 מיליאמפר ומרחק עבודה של 50 מיליליטר.

מאוחר יותר, אחסן את הדגימות תחת ואקום כדי להגן עליהן מפני אוויר הסביבה עד ולאורך ניתוחי SEM. כדי להשיג הדמיית תמיסה גבוהה על ידי גילוי האלקטרונים המשניים עם הגלאי היבשתי, הגדר את מתח ההאצה לשלושה קילו-וולט ואת זרם הקרן ל-20 מיקרומטר צמצם. עבור תצפיות, השתמש ברזולוציות הנעות בין 21.25 ננומטר לפיקסל ל-1.224 ננומטר לפיקסל.

השתמש ברזולוציה של 5.58 ננומטר לפיקסל לניתוח נתונים. הגדר את מרחק העבודה בין מילימטר לשני מילימטרים לתצפית ברזולוציה גבוהה וכשלושה מילימטרים אם נדרש עומק שדה מוגבר. כוונן את מהירות הסריקה ואת שילוב הקו באופן רציף כדי להבטיח יחס אות לרעש קבוע עם זמן רכישה של כ-30 עד 45 שניות לכל תמונה.

הניתוח המייצג ממחיש את השפעת החומר שהופקד על חוטי ספטין על תבניות PDMS גליות עם 1.5 ננומטר של פלטינה ו-1.5 ננומטר של טונגסטן. נצפה כי שלפוחית חד-לשונית ענקית חשופה, או GUVs, היו כדוריות לחלוטין. לאחר העיוות שנגרם על ידי ספטין, הבועיות הופיעו פנים והעיוותים נשארו סטטיים, ולכן לא השתנו.

בריכוזים גבוהים יותר של המחיצות נצפו עיוותים תקופתיים בשלפוחית. הרכבה עצמית של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחיות חד-ממדיות גדולות, או LUVs, נבדקה באמצעות תמונת מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו ושחזור תלת-ממדי התקבל מסדרה מוטה. הסידור התלוי בעקמומיות של חוטי ספטין הודגם על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

בהגדלה נמוכה נראתה תבנית גלית עם מחזוריות של עקמומיות שלילית וחיובית. הארגון האולטרה-מבני של חוטי הספטין נצפה בהגדלה גבוהה יותר. יש לקלף את ה-NOA בעדינות כדי למנוע השפלה.

לאחר ההדמיה, ניתן לבצע ניתוח תמונה מסוים כדי לכמת את תכונות המבנה האולטרה המוצגות על ידי SCM, כגון ריווח נימה, וכיוון החוט. השיטה הנוכחית יושמה על ספטינים, אך היא יכולה לשמש גם עבור חלבונים ציטוסקטליים אחרים או חלבונים המארגנים חוטים ארוכים ולכן רגישים לעקמומיות.