Name: מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למדו שיטה פשוטה להעשרת שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Mycobacterium tuberculosis באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. הפרוטוקול מספק תפוקה גבוהה עם מינימום זיהום חלבונים ומפשט את התהליך בהשוואה לשיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות על תמיכת המכללה לרפואה וטרינרית ומדעים ביו-רפואיים פרס חווייתי ותוכנית מחקר משותפת של מועצת המחקר של המכללה ל- NKG ומימון על ידי ATCC (פרס # 2016-0550-0002) ל- KMD. אנו רוצים גם להודות לאן סימפסון על תמיכה טכנית ומשאבי BEI, NIAID, NIH עבור הריאגנטים הבאים: שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LpqH (גן Rv3763), IT-54 (מיוצר במבחנה), NR-13792, שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום GroES (גן Rv3418c), שיבוט IT-3 (SA-12) (מיוצר במבחנה), NR-49223, ושחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LAM, שיבוט CS-35 (מיוצר במבחנה), NR-13811.

הוועדה לביו-בטיחות מוסדית של אוניברסיטת מדינת קולורדו אישרה את המחקר הנוכחי (19-046B). טיפוח שחפת מיקובקטריום וקצירת סופרנאטים עשירים ב-EV בוצעו על ידי צוות מיומן במעבדה להכלה גבוהה. החומרים הועברו אל מחוץ לאזור ההכלה הגבוהה לאחר ששיטת השבתה תקפה בוצעה, אושרה ואושרה על ידי מדיניות הבטיחות הביולוגית המוסדית. בעוד ששכפול הפרוטוקול, אם שיטת ההשבתה או הסינון הסטרילית המאומתת אינה אפשרית, יש לבצע את ההליכים הבאים במעבדה עם הכלה גבוהה.
1. הכנת תרכיז Mtb EV גולמי
הערה: להליכים מפורטים על גידול Mtb והכנת חלבון תסיסה תרבית (CFP), ראה הפניות11,12. מומלץ כי מדיית תרביות החיידקים תהיה נקייה מתוספי גדילה עם רכיבים המכילים EV או חלבוניים, כגון אלבומין דקסטרוז קטלאז (OADC), ודטרגנטים כגון Tween. כמו כן, מומלץ לבדוק את איכות תרבית החיידקים ואת ה-CFP שנקטף כדי להבטיח מוות מוגבל של תאים וליזה13,14.
<ol><li>הכינו מסנן צנטריפוגלי לחתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO) (ראו טבלת חומרים) על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של מי מלח עם מאגר פוספט (1x PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 2,800 x g ב 4 °C (64 °F). הערה: אם משתמשים במסנן ללא נפח עצירה מת, יש להקפיד על כך שנפח הדגימה לא יקטן מתחת לרמת המסנן, וכתוצאה מכך יתייבש המסנן באופן מלא במהלך צנטריפוגה.</li>
	<li>יש להשליך את הזרימה-דרך ואת כל ה-PBS הנותרים לפני מילוי תא הדגימה ב-Mtb CFP עד לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב 2,800 x g ב 4 °C עד הנפח הצטמצם לנפח המינימלי של התקן סינון אולטרה. חזור על הפעולה לפי הצורך, והוסף עוד CFP ליחידה עד שהמדגם כולו הופחת מספיק. הערה: שמור על חלק מהחומר של 100 kDa לזרימה דרך (100F) להסמכה במורד הזרם במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הוסף 1x PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת ההתקן הכוללת. הקטן את עוצמת הקול כמתואר ב- 1.2. חזור על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת חיץ.</li>
	<li>שחזר את 100 kDa מרוכז CFP retentate (100R) על פי מפרטי התקן סינון אולטרה (ראה טבלת חומרים). לאחר שחזור ה-100R, שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1x PBS לפחות שלוש פעמים, ואגרו את השטיפה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות.</li>
	<li>הוסיפו את החומר 100R ל-100R עם בדיקה דו-צ'ינכונינית (BCA) בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). כדי לבצע את הבדיקה, השתמש במספר דילולים של דגימות 1:2, 1:5 ו- 1:10 ב- PBS. בדוק את המדגם במשולש. הערה: שמור חלק מחומר ה- 100R להסמכה במורד הזרם במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל להעשרת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מ-CFP
הערה: ההליך הבא הוא ספציפי לשימוש ב- 3 מ"ג של 100R Mtb CFP עם עמודת SEC ואספן שברים אוטומטי (AFC, ראה טבלת חומרים). ניתן להתאים אותו לריכוזי התחלה וסוגי עמודות אחרים על ידי ביצוע מפרט היצרן. בנוסף, מומלץ למשתמשים לקרוא ולהבין את המדריך האוטומטי למשתמש של אספן שברים.
<ol><li>אפשרו לעמודת ה-SEC להתאיף לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הפעילו את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בחלק האחורי של יחידת המגדל והתאימו את ההגדרות לתא העומס, במידת הצורך, על-ידי לחיצה על SETUP במסך המגע הראשי של התפריט. יש לכייל את תא העומס רק בעת השימוש הראשון, לאחר כל עדכון תוכנה, ואם ניתן להבחין בחוסר עקביות באמצעי האחסון של איסוף השברים.</li>
	<li>ממסך SETUP , יישרו את הקרוסלה על ידי בחירה ב-CAROUSEL >-CALIBRATE. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה למגדל AFC, והתאים את הקרוסלה כך שזרבובית הנוזל תהיה ישירות מעל מיקום הסומק על ידי לחיצה על הכפתורים - ו / או + .</li>
	<li>הסר את המכסות מעמודת ה- SEC המשוזנת. החלק את עמודת ה- SEC לתוך תושבת העמודה המתאימה והתקין אותה בקפידה במגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו (RFID) בעמודה פונה ל- AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. מניחים את צינורות שקע הפסולת במיכל איסוף.</li>
	<li>ממסך SETUP , בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מ"ל על-ידי לחיצה על הלחצנים - ו / או + . השאר את ההגדרה "אמצעי אחסון מאגר" כברירת המחדל של 2.7 מ"ל ולאחר מכן סגור את החלון "לוח זמנים לאיסוף" על-ידי הקשה על X.</li>
	<li>בחר התחל אוסף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה ב- YES. טען 13 מסומן 1.7 מ"ל צינורות microcentrifuge עם המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה.</li>
	<li>קדם את ה- AFC על-ידי בחירת אישור, ולאחר מכן הרכיב את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לשטוף את העמודה על-ידי הקשה על YES, והוסף נפח עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 μm כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת ההדחה, קדם את ה- AFC על ידי לחיצה על אישור.</li>
	<li>הניחו את כיסוי הקרוסלה מעל ה-AFC ולחצו על OK. הכן נפח עמודה אחד של 0.2 מיקרומטר מסונן PBS. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף מהעמודה.</li>
	<li>הביאו 3 מ"ג של דגימת 100R כפי שמכומתת בשלב 1.5 עד 500 μL עם 1x PBS. הוסף את הדגימה של 3 מ"ג לראש העמודה. קדם את ה- AFC ואפשר לדוגמה לרוץ לתוך הפריט. לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את ה- PBS שהוכן בשלב 2.6 למאגר.</li>
	<li>נטר את הרצת ה- AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את נפח הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר שהריצה מסתיימת והקרוסלה חוזרת למצב פסולת, הסירו את הכיסוי והסירו את צינורות השבר מהקרוסלה. אחסן את השברים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הכימות (שלב 3) וההסמכה (שלב 4).</li>
	<li>אם יש לעשות שימוש חוזר בעמודה, בחר באפשרות לנקות את העמודה על-ידי הקשה על כן; אחרת, לחץ על לא. בצע את ההוראות ב- AFC. הערה: לאחר שהעמודה נשטפת ומאגר האחסון פועל, ניתן להסיר אותה, לכסותה ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).</li>
</ol>3. כימות כלי הרכב החשמליים של Mtb
<ol><li>מדוד את ריכוז החלבון עבור כל שבר באמצעות BCA ו- micro BCA12.<ol>
<li>עבור שברים של 0.5 מ"ל שנאספו מ-3 מ"ג של 100R Mtb CFP, השתמש במיקרו BCA עם דילול של 1:3 עבור שברים הממוספרים 1-7 מכל דגימה במשולש.</li>
		<li>עבור שברים של 0.5 מ"ל הממוספרים 5-13, השתמש ב- BCA ללא דילול עבור כל דגימה במשולש. הערה: חפיפה בין המבחנים עבור שברים 5-7 תסייע להבטיח שלכל השברים יש פלט קריא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יש למדוד את ריכוז החלקיקים עבור כל שבר באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA).<ol>
<li>לדלל את הדגימות ב-1 מ"ל של 1x PBS באמצעות יחסי ההתחלה המוצעים הבאים; עבור שברים 1-3, השתמש ב- 1:100 ולאחר מכן עבור השברים הנותרים, השתמש בדילול של 1:10.</li>
		<li>מערבולת את הפתרונות המדוללים ולאחר מכן שואבים את הדגימה למזרק חד פעמי של 1 מ"ל. הגדר את המזרק במשאבת מזרק אוטומטית אם היא זמינה.</li>
		<li>הגדר את משאבת המזרק ל- 30 μL /min והשתמש בהגדרות לכידת הווידאו עם רווח מסך של 10-12 ורמת מצלמה של 10-12. התאם את המיקוד עבור כל דגימה.</li>
		<li>אסוף מינימום של שלושה סרטונים ב-30 שניות כל אחד באמצעות זרימה קבועה.</li>
		<li>בצע את הניתוח כאשר סף זיהוי התוכנה מוגדר לחמישה. הערה: ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל נתוני נת"ע עבור השברים האחרונים (>7) מבלי להקריב נפח דגימה משמעותי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הסמכת רכבים חשמליים מסוג Mtb
<ol><li>דמיינו את פרופיל החלבון הכללי של כל שבר באמצעות ג'ל חלבון מוכתם בכסף. הערה: ניתן למצוא נהלים מפורטים עבור SDS-PAGE וכתם כסף בהפניה15.<ol>
<li>הוסף מאגר דגימות SDS ל- 10 μL של כל שבר ו- 5 מיקרוגרם של CFP, 100R ו- 100F. מרתיחים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס, ואז מעמיסים על ג'ל Bis-Tris של 4%-12% עם סולם משקל מולקולרי לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>הפעל את הג'ל באמצעות 1x 2-[N-morpholino]חומצה אתנסולפונית (MES) רץ (ראה טבלת חומרים) וזרם של 200 וולט למשך 35 דקות.</li>
		<li>מוציאים את הג'ל מהקלטת וממשיכים עם צביעת כסף15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הערך את נוכחותם או היעדרם של סמני EV בכל שבר לפי כתם מערבי. הערה: נהלים מפורטים לכתם מערבי ניתן למצוא בהפניה15.<ol>
<li>הפעל ג'ל SDS-PAGE כמתואר בשלבים 4.1.1.1-4.1.2.</li>
		<li>מוציאים את הג'ל מהקלטת ומעבירים את החלבונים שנפתרו לממברנה ניטרוצלולוז של 0.2 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על ידי מריחת זרם של 50 וולט למשך שעה לפחות.</li>
		<li>בצע ניתוח כתמים מערביים כדי להעריך חלבונים בעלי עניין. מומלץ להשתמש בנוגדנים ראשוניים נגד LpqH, ליפוראבינומנאן (LAM) ו-GroES (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>חלקי מאגר המבוססים על נוכחותם או היעדרם של סמנים לפי העניין עבור היישום במורד הזרם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אשר את נוכחותם של בועיות שלמות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).<ol>
<li>תקן 15 μL של דגימת השלפוחית על ידי הוספת 15 μL של 4% כיתה EM paraformaldehyde ולאחסן ב 4 ° C לילה.</li>
		<li>הכינו רשת TEM מנחושת מצופה 200 Mesh formvar-carbon על ידי ניקוי המשטח ויצירת מצע הידרופילי. הערה: מומלץ לנקות פלזמה עם 95% ארגון, 5% חמצן ו-30% הספק פלזמה למשך דקה אחת.</li>
		<li>שחררו 10 μL מהדגימה הקבועה על הרשת ואפשרו לדגימה להידבק למשך 10 דקות, ואז הכתימו את הנוזל העודף עם נייר מסנן.</li>
		<li>צפו את הרשת על טיפת מים אולטרה-אפורים במשך 30 שניות, ואז הורידו את עודפי הנוזלים.</li>
		<li>צפו את הרשת על טיפת אורניל אצטט בדרגה d% EM למשך 2 דקות, ואז הורידו את הנוזל העודף.</li>
		<li>אפשרו לרשת להתייבש לחלוטין באוויר.</li>
		<li>תמונה באמצעות TEM (ראה טבלת חומרים) ב- 100 kV או דומה. הערה: יש להשתמש בשיטות אחרות של כמות ואפיון של EV בהתבסס על יישומים במורד הזרם. יש לעיין במידע המינימלי למחקרים של שלפוחית חוץ-תאית18 לקבלת הנחיות כדי להבטיח את ההקפדה ויכולת השכפול של כל מחקרי הרכב החשמלי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921(2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li>
<li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li>
<li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li>
<li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022).</li>
<li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li>
<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריום שחפת הן מאגרים אנטיגניים מאוד, המציגים אותן כאפיק אטרקטיבי לפיתוח כלי אבחון וחיסונים עתידיים 4,19,20. מבחינה היסטורית, אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות שימשה להפרדת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מחומרים מסיסים ומופרשים אחרים8. בעוד שתהליך זה יעיל, הוא גם גוזל זמן רב, מאתגר מבחינה טכנית, ועלול להשפיע על שלמותם של תכשירי הרכב החשמלי המתקבלים ...

שחרור שלפוחית חוץ-תאית (EV) על ידי פתוגנים עשוי להיות המפתח לפתיחת טכנולוגיות חדשות לשליטה במחלות זיהומיות1. מיקובקטריום שחפת (Mtb) הוא פתוגן בעל השלכות גבוהות, מדביק כשליש מאוכלוסיית העולם וגובה את חייהם של מיליוני אנשים בכל שנה2. ייצור EV על ידי Mtb מתועד היטב ועם זאת חמקמק בביוגנזה ובתפקידים המגוונים (כלומר, אימונוסטימולטוריים, מדכאי חיסון, ברזל ורכישת חומרים מזינים) של כלי רכב חשמליים אלה בהקשר של זיהום 3,4,5. מאמצים להבין את הרכבם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb חשפו כדורים סגורים של 50-150 ננומטר של ממברנת השומנים הנגזרים מממברנת הפלזמה המכילים שומנים וחלבונים בעלי משמעות אימונולוגית 3,6. חקירת תפקידם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb בפיזיולוגיה של חיידקים גילתה את החשיבות של אפנון ר"ח חיידקי בתגובה ללחץ סביבתי להישרדות5. מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגנים היו מסובכים יותר לפענוח, אך הראיות מצביעות על כך שרכבים חשמליים מסוג Mtb יכולים להשפיע על התגובה החיסונית של המארח ועשויים לשמש כמרכיב חיסון יעיל 3,4,7.
רוב המחקרים על כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עד כה הסתמכו על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות להעשרת שלפוחית8. זה היה יעיל למחקרים בקנה מידה קטן; עם זאת, לטכניקה זו יש מספר אתגרים טכניים ולוגיסטיים. זרימות עבודה חלופיות מצמידות צנטריפוגה מרובת שלבים, להסרת תאים שלמים ופסולת גדולה, עם שלב אולטרה-צנטריפוגציה סופי לרכבים חשמליים כדוריים. מתודולוגיה זו יכולה להשתנות ביעילותה, ולעתים קרובות גורמת לתפוקה נמוכה ולטיהור משותף של ביו-מולקולות מסיסות שאינן קשורות לשלפוחית, תוך השפעה על שלמותהשלפוחית 9. בנוסף, תהליך זה גוזל זמן רב, אינטנסיבי באופן ידני ומוגבל מאוד בתפוקה בשל אילוצי ציוד.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חלופית ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות: כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). שיטה זו הוכחה עבור מיקובקטריה סביבתית, ובעבודה הנוכחית, היא עברה אקסטרפולציה ל- Mtb10. עמודה זמינה מסחרית ואספן שברים אוטומטי יכולים לשפר את העקביות בהכנת שלפוחית ולהפחית את הצורך בציוד ספציפי ויקר. ניתן גם להשלים פרוטוקול זה בשבריר מהזמן בהשוואה לאולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמגדיל את התפוקה. טכניקה זו פחות מאתגרת מבחינה טכנית, מה שמקל על השליטה בה, ויכולה להגביר את יכולת השכפול הבין-מעבדתית. לבסוף, ל-SEC יש יעילות הפרדה גבוהה והיא עדינה, תוך שמירה על שלמות הבועיות.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS מאגר ריצה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת</td><td>קורנינג</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>אספן שברים אוטומטי</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark סולם חלבון מוכתם מראש</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסל</td><td>בקמן קולטר</td><td>אלגרה 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - מסנן צנטריפוגלי 70, חיתוך 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>מכשיר אולטרה-סינון המשמש בשלב 1.1</td></tr><tr><td>מערכת Electroblotting</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>EM Grade Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG H& L (פוספטאז אלקליין), מולקולה שלמה, 1 מ"ל</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>JEM-1400 מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td></td> ערכת בדיקת חלבון JOEL <td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>חד שבטי אנטי-Mycobacterium tuberculosis GroES (גן Rv3814c)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-49223</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני מונוקלונלי אנטי-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13792</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני מונוקולונלי אנטי-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13811</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>לניקוי פלזמה של רשת TEM</td></tr><tr><td>Nanosight מצויד במשאבת מזרק ומחשב עם תוכנת NanoSight NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה, גליל, 0.2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט, 1X ללא סידן ומגנזיום</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי PowerPac</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV מקורי 35 ננומטר 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC עמודה</td></tr><tr><td>SDS מאגר דגימה</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>מתכון פנימי המשמש בהליך זה, אולם מוצר זה שווה ערך</td></tr><tr><td>לתא ג'ל SDS-PAGE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>פרוטוקול פנימי המשמש בהליך זה, אולם ערכה זו מקבילה למדעי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיית האלקטרונים</td><td>Uranyl Acetate</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בהקשר של זיהום חיידקי התגלה כאפיק חדש להבנת הפיזיולוגיה המיקרוביאלית. באופן ספציפי, כלי רכב חשמליים של Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ממלאים תפקיד באינטראקציה בין מארח לפתוגן ובתגובה ללחץ סביבתי. כלי רכב חשמליים מסוג Mtb הם גם אנטיגניים מאוד ומראים פוטנציאל כמרכיבי חיסון. השיטה הנפוצה ביותר לטיהור רכבים חשמליים מסוג Mtb היא אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות. לתהליך זה יש מספר מגבלות, כולל תפוקה נמוכה, תפוקה נמוכה, הסתמכות על ציוד יקר, אתגרים טכניים, והוא יכול להשפיע לרעה על ההכנה המתקבלת. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) היא שיטה חלופית עדינה יותר הנלחמת ברבות מהמגבלות של אולטרה-צנטריפוגציה. פרוטוקול זה מדגים כי SEC יעיל להעשרת Mtb EV ומייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה של תפוקה מוגברת באופן מהיר ומדרגי. בנוסף, השוואה ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות על ידי כימות והליכי הסמכה מדגימה את היתרונות של SEC. בעוד שההערכה של כמות EV (ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים), פנוטיפ (מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה) ותוכן (כתם מערבי) מותאמת לרכבים חשמליים מסוג Mtb, ניתן ליישם את זרימת העבודה המסופקת על מיקובקטריות אחרות.

חלבון ניעול תרבית (CFP) מ-Mycobacterium tuberculosis (Mtb) היה מרוכז, כומת, ולאחר מכן הוחלו 3 מ"ג של חומר על עמודת כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). ריכוזי החלבון והחלקיקים נמנו על ידי BCA ו-NTA, בהתאמה. הטווחים הצפויים להתאוששות חלבונים וחלקיקים בתוספת הערכים המדויקים שהתקבלו עבור תוצאות אלה מדווחים בטבלה 1. ערכים גבוהים בהרבה מטווחים אלה עשויים להצביע על בעיות זיהום או שלמות עמודה. הערכים נמוכים משמעותית מצביעים על בעיות בשלבי הסינון האולטרה-סינון, ולכן יש להשוות את הזרימה-דרך ל-CFP ההתחלתי ול...

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

פרוטוקול זה מפחית את המורכבות הטכנית ואת הזמן הנדרשים להעשרת שלפוחיות חוץ-תאיות משחפת Mycobacterium, Mtb EVs. הוא מספק אלטרנטיבה עדינה לטכניקות מסורתיות מבוססות אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי קל לבצע, מה שהופך אותו יותר לשכפל.הוא מספק תפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עם העשרה משותפת מינימלית של חלבונים שאינם EV. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ואני ראיין, סטודנטית לשעבר לתואר שני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכן מסנן צנטריפוגלי בעל משקל מולקולרי של 100 קילודלטון על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של PBS.צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס. בטל את הזרימה ואת כל ה- PBS הנותר, ומלא את תא הדגימה ב- Mtb CFP עד לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס עד נפח מופחת לנפח המינימלי של מכשיר אולטרה סינון.יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד שהדגימה כולה צומצמה במידה מספקת. הוסף 1X PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת המכשיר הכוללת. הפחיתו את עוצמת הקול כפי שתואר קודם לכן וחזרו על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת מאגרים.לאחר מכן, לשחזר את 100 קילו קילודלטון מרוכז CFP retentate או 100R, על פי מפרט מכשיר ultrafiltration. שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1X PBS לפחות שלוש פעמים, ומשכו את הכביסה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות. השתמש במספר דילול של דגימות ב- PBS וכמות החומר 100R עם בדיקה bicinchoninic.בדוק את המדגם במשולש. אפשר לכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל, או עמודת ה-SEC, להתאזן לטמפרטורת החדר. הפעל את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בגב יחידת המגדל ולחץ על Setup במסך המגע של התפריט הראשי במידת הצורך כדי להתאים את ההגדרות עבור תא הטעינה.ממסך ההתקנה, יישר את הקרוסלה על-ידי בחירת קרוסלה ואחריה כיול. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה לתוך מגדל AFC וכוונן את הקרוסלה על ידי לחיצה על כפתורי המינוס או הפלוס כך שהזרבובית הנוזלית תהיה ישירות מעל מיקום הסומק. הסר את האותיות הקטנות מעמודת ה- SEC המאוזנת והחלק את עמודת ה- SEC לתוך תושבת העמודה המתאימה.התקן אותו בזהירות על מגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו בעמודה פונה ל-AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. הניחו את צינורות שקע הפסולת במיכל איסוף.ממסך ההתקנה, בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מיליליטר על ידי לחיצה על לחצני המינוס או הפלוס. השאר את הגדרת עוצמת הקול של המאגר כברירת המחדל של 2.7 מיליליטר ולאחר מכן סגור את חלון לוח הזמנים לאיסוף. בחר התחל איסוף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה באפשרות כן.טען 13 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר עם המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה. קדם את AFC על-ידי בחירה באפשרות אישור, ולאחר מכן טען את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לרוקן את העמודה על-ידי הקשה על כן, והוסף נפח עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת הסומק, קדם את ה- AFC על ידי לחיצה על OK. הנח את כיסוי הקרוסלה מעל AFC ולחץ על OK. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף מהעמודה.הביאו שלושה מיליגרם של דגימת 100R ל-500 מיקרוליטרים עם 1X PBS והוסיפו את הדגימה לראש העמודה. הכן נפח עמודה אחת של PBS מסונן 0.2 מיקרומטר. קדם את ה- AFC ואפשר לדגימה לרוץ לתוך הדאגה.לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את ה- PBS שהוכן קודם לכן למאגר. עקוב אחר ההפעלה של AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את אמצעי האחסון הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר שהריצה מסתיימת והקרוסלה חוזרת למצב הפסולת, הסר את הכיסוי ואת צינורות השבר מהקרוסלה.עבור שברים של 0.5 מילימטרים שנאספו משלושה מיליגרם של 100R Mtb CFP, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות מיקרו-BCA עם דילול של 1:3 עבור שברים הממוספרים 1 עד 7 מכל דגימה במשולש. עבור שברים של 0.5 מיליליטר הממוספרים 5 עד 13, השתמש ב- BCA ללא דילול עבור כל דגימה במשולש. הוסף מאגר דגימת SDS ל-10 מיקרוליטרים מכל שבר וחמישה מיקרוגרם של CFP ו-100R.מרתיחים במשך חמש דקות ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען על ג'ל 4 עד 12% Bis-Tris עם סולם משקל מולקולרי עבור אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, או PAGE. הפעל ג'ל SDS-PAGE באמצעות מאגר פועל 1X MES וזרם של 200 וולט למשך 35 דקות.הסר את הג'ל מן הקלטת ולהחיל זרם 50 וולט במשך שעה אחת לפחות כדי להעביר את החלבונים נפתרו לקרום ניטרוצלולוז 0.2 מיקרומטר. לבסוף, בצע את ניתוח הכתם המערבי כדי להעריך את החלבונים. ג'ל SDS-PAGE המוכתם בכסף מדגים את פרופיל החלבון הכולל עבור כל שבר.הנתונים מראים כי השברים המאוחרים יותר מכילים יותר חלבון ודומים לחומר 100R. כתמים מערביים המזהים LAM, LpqH ו-GroES מראים כי סמן החלבון משתנה על פני השברים. מיקרוסקופיית אלקטרונים של הולכה, או תמונות TEM, של שברים SEC 1 עד 3 שנמשכו לפני הקיבוע מוצגות כאן.האולטרה-צנטריפוגציה של מעבר הצפיפות של כלי רכב חשמליים Mtb הוכתמה באופן שלילי עבור הדמיית TEM. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או התפלגות NTA, של שברים SEC 1 עד 3 מוצג כאן. כלי הרכב החשמליים מסוג Mtb של אולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע צפיפות נותחו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, והתפלגות הגודל מוצגת כאן.פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לטיהור EV משלושה מיליגרם של 100R. אם עומס החלבון מגוון, אסטרטגיית הדילול וה-BCA המומלצים על שברים המתקבלים עשויים לדרוש התאמה. רכבים חשמליים Mtb שהוכנו בטכניקה זו יכולים לשמש למחקרים מבוססי קומפוזיציה במורד הזרם ומבוססי אומיקה.הם מתאימים גם לניסויים in vitro ו- in vivo. טכניקה זו מספקת דרך יעילה ויעילה לייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה, וסוללת את הדרך לשכפול מוגבר בניסויים עתידיים של Mtb EV.

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: גופטה, ס., מרסלה רודריגז, ג. בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הבידוד ההדרגתי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Mycobacterium tuberculosis שגודלו בתנאים מגבילים של ברזל המחקים את הסביבה המארחת. הוא מתאר את השימוש באולטרה-סינון, צנטריפוגה דיפרנציאלית והפרדת שיפוע צפיפות כדי להעשיר ולזהות שברים המכילים EV.

בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות המכילות סידרופור מ-Mycobacterium tuberculosis

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

מקור: ווטסון, די.סי., ואחרים. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם חרוזי שרף נקבוביים כדי לבודד שלפוחיות חיידקים חוץ-תאיות (EVs) מתסנין תרבית חיידקים. EVs גדולים יותר נפלטים מוקדם על ידי עקיפת נקבוביות השרף, בעוד שחלבונים קטנים יותר נכנסים לנקבוביות ונפלטים מאוחר יותר.

בידוד שלפוחיות חיידקיות חוץ-תאיות באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל 

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה – כרומטוגרפיית אי הכללת גודל – להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות קרום חיצוני או OMV שמקורו בחיידקים. שלפוחיות אלה הן מבנים כדוריים בגודל ננומטרי ומופרדות לתת-אוכלוסיות גדולות וקטנות בהתבסס על גודלן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

אי הכללת גודל הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה של שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות: טכניקה להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של בועיות קרום חיצוני של חיידקים גראם-שליליים בהתבסס על גודלן

סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של חלבוני סינון תרבית חיידקים, הכוללים שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות, באמצעות אולטרה-סינון. השלפוחיות החוץ תאיות המרוכזות משמשות כסמנים אבחוניים לגילוי מחלות.

תרבית חיידקים מסננת ריכוז חלבונים באמצעות מכשיר אולטרה-סינון

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (EVs) מסנין התרבית של Mycobacterium tuberculosis (Mtb). הטכניקה משתמשת בעמוד שרף נקבובי כדי להשיג שברים מטוהרים של כלי רכב חשמליים. החלקיקים הנקבוביים מאפשרים באופן סלקטיבי לחלבונים קטנים יותר להיכנס לנקבוביות, וכתוצאה מכך ההדבקה איטית יותר. במקביל, כלי רכב חשמליים אינם נכנסים לנקבוביות בשל גודלם הגדול יותר והם מדוללים ראשונים.

טכניקת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

שלל חיידקים ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה ויש להם יישומים ביוטכנולוגיה מבטיחים. ההטרוגניות של שלטי של שלל מסבכת ניתוח ושימוש; לכן, יש צורך בשיטה פשוטה לשחזור כדי להפריד בין גדלים שונים של שלשלות. כאן, אנו מדגימים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להפריד שלפוחיות הטרוגניות המיוצרות על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל לניתוח הטרוגניות ארסית קרום החיצוני של חיידקים

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למדו שיטה פשוטה להעשרת שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Mycobacterium tuberculosis באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. הפרוטוקול מספק תפוקה גבוהה עם מינימום זיהום חלבונים ומפשט את התהליך בהשוואה לשיטות מסורתיות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

גלה סרטונים נוספים