Name: מדידה של כלי דם תלויי אנדותל באבי העורקים החזי של העכבר באמצעות מיוגרפיה של תא נפח קטן טנסומטרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו מדידת תפקוד אנדותלי בכלי דם באמצעות מיוגרפיה טנסומטרית באבי העורקים החזי של עכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של תגובתיות כלי דם בתנאים פיזיולוגיים מבוקרים לחקר ביולוגיה וסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R15HL145646) ומהמכללה ללימודים מתקדמים של אוניברסיטת מידווסטרן.

<ol><li>Wenceslau, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+measurement+of+vascular+function+and+structure+in+isolated+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+Testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Lerman, A., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function%3A+Cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function: Cardiac events.</a> Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).</li>
<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li>
<li>Galley, H. F., Webster, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Physiology of the endothelium.</a> British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).</li>
<li>Orita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+phosphate%2C+bicarbonate%2C+and+Hepes+buffered+storage+solutions+on+hypothermic+injury+to+immature+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).</li>
<li>Liu, Y. H., Bian, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate-dependent+effect+of+hydrogen+sulfide+on+vascular+contractility+in+rat+aortic+rings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).</li>
<li>Griffiths, K., Madhani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+wire+myography+to+investigate+vascular+tone+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%3A+Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of wire myography to investigate vascular tone and function.</a> Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).</li>
<li>Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+by+NG-nitro-L-arginine+methyl+ester+%28L-NAME%29%3A+Requirement+for+bioactivation+to+the+free+acid%2C+NG-nitro-L-arginine%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine.</a> British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).</li>
<li>Bacon, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+in+systemic+vasculitis%3A+New+developments+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects.</a> Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).</li>
<li>Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+hypertension%3A+Current+concepts+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications.</a> Frontiers in Medicine. 8, 798958(2021).</li>
<li>Mikolajczyk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+important+role+of+endothelium+and+extracellular+vesicles+in+the+cellular+mechanism+of+aortic+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157(2021).</li>
<li>Vallance, P., Hingorani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+nitric+oxide+in+humans+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Endothelial nitric oxide in humans in health and disease.</a> International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).</li>
<li>Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nitric+oxide+on+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of nitric oxide on endothelial function.</a> Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).</li>
<li>Gibson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+aerobic+exercise+blocks+elastin+fiber+fragmentation+and+aortic+dilatation+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome+associated+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).</li>
<li>Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+initial+tension+for+rat+basilar+artery+in+wire+myography%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography.</a> Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).</li>
<li>Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+pharmacological+approaches+to+investigate+the+pathogenesis+of+Marfan+syndrome+in+the+abdominal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta.</a> Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+impairs+soluble+guanylyl+cyclase+function+in+mouse+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תחום הביולוגיה של כלי הדם מסתמך במידה רבה על כלים המסייעים לחוקרים להעריך את השלמות התפקודית והמבנית של דופן כלי הדם. היא גם דורשת תשומת לב מיוחדת לאינטראקציות הישירות והעקיפות בין שלוש שכבות כלי הדם: האינטימה, המדיה והאדוונטיטיה. בין שלוש השכבות הללו, האינטימה נוצרת על ידי מונולאייר של תאי אנדותל ויש לה תפקיד חשוב מאוד בוויסות בריאות כלי הדם והמוסטזיס.
זה מבוסס היטב כי כל נזק לשכבת האנדותל יכול להשפיע לרעה על יכולתו לשחרר NO וגורמים אחרים vasodilatory, המוביל dysregulation של תפקוד כלי הדם, א...

במשך העשורים האחרונים, מערכת המיוגרפיה הקאמרית הקטנה שימשה למדידת התגובה של שכבות שונות של דפנות כלי הדם בתגובה לחומרים פרמקולוגיים שונים ומוליכים עצביים בסביבה ex vivo, בזמן אמת. תגובתיות כלי דם היא מרכיב מרכזי בכלי דם מתפקדים בריאים והיא קריטית לוויסות זרימת הדם וזליפה בכלי הדם ההיקפיים והמוחיים1. בתוך דופן כלי הדם, האינטראקציה בין שכבות האנדותל והשריר החלק היא גורם מכריע בטונוס כלי הדם, אשר מושפע כל הזמן גם משינויים מבניים בשכבת רקמת החיבור המקיפה את דופן כלי הדם (אדוונטיטיה).
שכבת האנדותל שולטת בתנועת כלי הדם על ידי שחרור מספר גורמים מרחיבי כלי דם, כולל תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGI2) וגורם היפר-קוטבי שמקורו באנדותל (EDHF), או על ידי ייצור חומרים וזוקונסטרוקטיביים כגון אנדותלין-1 (ET-1) ותרומבוקסאן (TXA2)2,3,4. בין הגורמים הללו, NO נחקר בהרחבה, ותפקידיו הרגולטוריים החשובים בתפקודים תאיים קריטיים אחרים כגון דלקת, נדידה, הישרדות והתפשטות צוטטו רבות בספרות המדעית 2,5.
בתחום הביולוגיה של כלי הדם, מיוגרפיה קאמרית סיפקה לפיזיולוגים של כלי הדם ולפרמקולוגים כלי יקר ואמין למדידת תפקוד האנדותל במערכת סמי-פיזיולוגית מבוקרת היטב1. כיום, ישנן שתי מערכות מיוגרף שונות העומדות לרשות המדענים: מיוגרפיה טנסומטרית (או פין) טנסומטרית (איזומטרית) ומיוגרפיה בלחץ. במערכת מיוגרפיה של חוטים, כלי הדם נמתח בין שני חוטים או פינים, מה שמאפשר מדידה איזומטרית של כוח או התפתחות מתח בדופן כלי הדם, בעוד שמיוגרפיה של לחץ היא פלטפורמה עדיפה למדידות של תגובתיות כלי הדם בעורקי התנגדות קטנים, שבהם שינויים בלחץ הדם נחשבים לגירוי העיקרי לשינויים בטונוס כלי הדם ובתנועת כלי הדם. קיימת הסכמה כללית כי עבור עורקי התנגדות קטנים כגון עורקים מזנטריים ומוחיים, מיוגרפיה בלחץ יוצרת מצב הקרוב יותר לתנאים הפיזיולוגיים בגוף האדם. ניתן להשתמש במיוגרף התא הקטן לכלי דם בקטרים קטנים מאוד (200-500 מיקרומטר) לכלי שיט גדולים בהרבה כמו אבי העורקים.
בעוד שמיוגרף התיל הוא מערכת רבת עוצמה לרישום מתח כלי הדם בתנאים איזומטריים, מיוגרף הלחץ הוא מערכת מתאימה יותר למדידת שינויים בקוטר כלי הדם בתגובה לשינויים בתנאים איזובריים. שינויי הקוטר בכלי הדם בתגובה לשינויים בלחץ או בזרימה גדולים בהרבה בעורק שרירי קטן (עורקי) בהשוואה לעורקים אלסטיים גדולים כמו אבי העורקים. מסיבות אלה, מיוגרף הלחץ נחשב כלי טוב יותר עבור כלי דם קטנים עם vasoreactivity משמעותית1. אחת החוזקות המעשיות האחרות של מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן רב-תאי היא שניתן להבחין בתרומתם של מנגנונים שונים לתגובתיות כלי הדם על ידי לימוד מקטעים מרובים (עד ארבעה) של אותו עורק ומאותו בעל חיים כדי להפחית את השונות ולייצר נתונים חזקים וחד-משמעיים. הוא גם קל יחסית להתקנה ולתחזוקה טכנית. כלי כמעט בכל גודל ניתן ללמוד עם מיוגרף חוט. זהו פתרון חסכוני יותר להערכת תפקוד כלי הדם והוא חלופה טובה למיוגרפיה בלחץ בניסויים שבהם אורך כלי הדם המנותח קצר מדי לפרוטוקול מיוגרף הלחץ.
דו"ח זה מספק פרוטוקול מפורט להערכת תפקוד האנדותל בטבעת אבי העורקים החזה המבודדת של העכבר באמצעות פיני הרכבה בטכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית של תא נפח קטן באמצעות מערכת המיוגרפיה הרב-תאית DMT-620 (DMT-USA). פרוטוקול זה משתמש בעכבר C57BL6 זכר בן 6 חודשים עם משקל ממוצע בין 25-35 גרם. למרבה המזל, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים שונים של בעלי חיים ומשקולות, בהתחשב במגוון הרחב של סוגי כלי שיט וקטרים כי פרוטוקול זה יכול לשמש.

<table><tbody><tr><td>אצטילכולין</td><td>SigmaAldrich</td><td>A6625-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>גז קרבוגן</td><td>Matheson</td><td>H103847</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לחיתוך</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMT 620 מערכת מיוגרף רב קאמרית</td><td>DMT</td><td>DMT 620</td><td>מערכת</td></tr> <tr>מיוגרף רב קאמרית<td>מלקחיים של דומונט</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SigmaAldrich</td><td>E5134-10G</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמאאולדריץ'</td><td>G8270-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LabChart</td><td>מכשירי ADI</td><td></td><td>תוכנה לרכישת נתונים</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Volpi</td><td>14363</td><td></td></tr><tr><td>L-Name</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-200-7725</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td>מיקרוסקופ זום סטריאו</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אמבט איברים</td><td>DMT</td><td>720MO</td><td></td></tr><tr><td>פנילפרין</td><td>סיגמאAldrich</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>משאבת</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>מכשירי ADI</td><td>LabChart 8.1.20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיצים</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית שירותי מיקרוסקופיה</td><td>24236-10</td><td>ערכת אלסטומר סיליקון</td></tr><tr><td>ווסת טנק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10575147</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-462-10</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של כלי דם תלויי אנדותל באבי העורקים החזי של העכבר באמצעות מיוגרפיה של תא נפח קטן טנסומטרי

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן היא טכניקה נפוצה להערכת התכווצות כלי הדם של כלי דם קטנים וגדולים בחיות מעבדה ובעורקים קטנים המבודדים מרקמה אנושית. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לשמור על כלי דם מבודדים בסביבה מבוקרת וסטנדרטית היטב (כמעט פיזיולוגית), עם אפשרות להתאמה לגורמים סביבתיים שונים, תוך קריאת תיגר על כלי הדם המבודדים עם חומרים פרמקולוגיים שונים שיכולים לגרום להתכווצות כלי דם או להרחבת כלי דם. תא המיוגרף מספק גם פלטפורמה למדידת תגובתיות כלי הדם בתגובה להורמונים, מעכבים ואגוניסטים שונים שעשויים להשפיע על תפקוד שכבות השריר החלק והאנדותל בנפרד או בו זמנית. דופן כלי הדם היא מבנה מורכב המורכב משלוש שכבות שונות: האינטימה (שכבת האנדותל), המדיה (שריר חלק וסיבי אלסטין) ואדוונטיטיה (קולגן ורקמות חיבור אחרות). כדי לקבל הבנה ברורה של התכונות הפונקציונליות של כל שכבה, חיוני שתהיה גישה לפלטפורמה ומערכת ניסיונית שתאפשר גישה משולבת לחקר כל שלוש השכבות בו זמנית. גישה כזו דורשת גישה למצב פיזיולוגי למחצה המחקה את סביבת ה- in vivo בסביבה ex vivo . מיוגרפיה טנסומטרית של תאים קטנים סיפקה סביבה אידיאלית להערכת ההשפעה של רמזים סביבתיים, משתנים ניסיוניים או אגוניסטים ואנטגוניסטים פרמקולוגיים על תכונות כלי הדם. במשך שנים רבות, מדענים השתמשו בטכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית כדי למדוד את תפקוד האנדותל ואת התכווצות השרירים החלקים בתגובה לגורמים שונים. בדו"ח זה, מערכת מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן משמשת למדידת תפקוד האנדותל באבי העורקים של העכבר המבודד. דו"ח זה מתמקד באופן שבו ניתן להשתמש במיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן כדי להעריך את השלמות התפקודית של האנדותל במקטעים קטנים של עורק גדול כגון אבי העורקים החזי.

פרוטוקול המיוגרפיה של חדר קטן טנזומטרי המוסבר כאן הוא השיטה הסטנדרטית למדידת תגובתיות כלי דם בעורקים קטנים וגדולים ומאפשר מדידות סימולטניות של תגובתיות כלי הדם בעד ארבעה מקטעי כלי דם מאותה חיית מעבדה קטנה ניסיונית. בדוח הזה אנו משתמשים באופן ספציפי במערכת כדי למדוד את תפקוד האנדותל באבי העורקים של העכבר המבודד (איור 1). בפרוטוקול זה, מקטעי אבי העורקים המבודדים מותקנים על תא איברים קטן (איור 2) בין שני סיכות נירוסטה קטנות (איור 3). ת...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המושגים והיישום הטכני של טכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית באמצעות מערכת מיוגרף רב-תאית בהערכת ex vivo ניסיונית של תפקוד אנדותל אבי העורקים של עכבר.

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in ...

אנו מדגימים את המיוגרפיה האיזומטרית או הטנסומטרית כפרוטוקול תקן הזהב למדידת תגובתיות של התנגדות קטנה או כלי דם צינוריים גדולים במצב פיזיולוגי מבוקר היטב. המדידות ניתנות לשחזור ואמינות מאוד. לטכניקה יש ערך רב בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור שכבות שונות של כלי דם בנפרד או לחקור אינטראקציה בין שכבות שונות של דופן כלי הדם בו זמנית.מי שידגים את ההליך יהיה רוברט פולק, מומחה מעבדת המחקר מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפעלת אמבט המים והגדרתו ל 37 מעלות צלזיוס. הכניסו לאמבט המים שתי כוסות המסומנות כראוי, אחת עם 600 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS ואחת עם 150 מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה.אוורר המכילה 300 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS עם גז קרבוגן למשך 10 דקות לפחות. הוסף 30 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS aerated לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, תייג כראוי והנח אותו על קרח. שמור את תמיסת HEPES-PSS הנותרת על הקרח לשימוש במהלך תהליך הדיסקציה של אבי העורקים.הפעל את יחידת המיוגרף בעלת ארבעת התאים ב-5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS לכל תא מיוגרף והגדר את החום ל-37 מעלות צלזיוס. אפשרו לתמיסה בכל תא לאוורר במשך 30 דקות ובדקו שהתאים הגיעו ל-37 מעלות צלזיוס הרצויות. הפעל את החומרה והמחשב לאיסוף נתוני מיוגרף.מעבירים את כלוב בית החזה שנכרת מהעכברים שהומתו לצלחת פטרי שקופה מצופה אלסטומר מסיליקון מלאה בחיץ HEPES-PSS קר כקרח והצמידו אותו משני הצדדים. מתחת למיקרוסקופ, חותכים ומסירים בעדינות את הלב ואת אבי העורקים המחובר מכלוב הצלעות ומעבירים לצלחת נקייה מצופה אלסטומר מסיליקון, ואז מסירים בעדינות רקמת חיבור שומן ודם קרוש מאבי העורקים. בעזרת מספריים קטנים וחדים, מנתחים ומבודדים את כל אבי העורקים החל מאזור הקשת ועד לתחתית אבי העורקים היורד.חותכים את אבי העורקים המנותק לארבעה מקטעים של 2 מילימטרים כל אחד. השתמש בסרגל הקטן בתוך המנה כהפניה. בתאים שכבר מכילים 5 מיליליטר של חיץ HEPES-PSS מחומם ומאוורר, החליקו בזהירות כל אחד מקטעי אבי העורקים בקוטר 2 מילימטרים על שני פיני ההרכבה באמצעות מלקחיים.בעת הנחת התא בחזרה ביחידת המיוגרף, הזיזו באיטיות את הפינים זה מזה על ידי סיבוב המיקרומטר נגד כיוון השעון כך שמקטע אבי העורקים לא יחליק מהפינים. החזירו כל תא מיוגרף ליחידה והתחילו לאוורר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מסננים את התאים ומוסיפים 5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS טרייה, חמה ומאווררת לכל תא.במידת הצורך, התאימו מחדש את מדידות הכוח כדי לקרוא את המתח האופטימלי של 6 מילי-ניוטון. לנוח את הרקמה עוד 15 עד 20 דקות. פתח את התוכנה לאיסוף נתונים.שנה את מספרי המעקב מ- 50 ל- 1 ל- 500 ל- 1 ולחץ על התחל. לפני תחילת ניסוי חדש, הקפד להוסיף את התווית המתאימה על תוכנת רכישת הנתונים. מסננים את התאים פעם נוספת לפני שמוסיפים 5 מיליליטר של תמיסה עשירה באשלגן לכל תא.מסננים את התאים שוב ברגע שהתגובה המתכווצת לתמיסת האשלגן הגבוהה מגיעה לרמה ליצירת כוח. לשטוף את הרקמה עם תמיסת HEPES-PSS שלוש פעמים. הוסף 5 מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה לכל תא.מסננים את התאים ברגע שהתגובה המתכווצת לתמיסת אשלגן גבוהה מגיעה לרמה ליצירת כוח ושוטפים את הרקמה שלוש פעמים עם HEPES-PSS, ואז מניחים את הרקמה למשך 15 עד 20 דקות. התכווצו מראש של מקטעי אבי העורקים עם סוכן vasoconstrictor PE במינון תת-מקסימלי. אפשר לעקומת הכיווץ המושרה על ידי PE להגיע לרמה להתפתחות מתח.הוסף רמה של פיתוח מתח ל- PE ב 5 מיקרוליטרים של מינונים הולכים וגדלים של תמיסות מלאי עבודה של אצטילכולין במרווחים של 3 דקות כדי לקבוע ריכוזים סופיים של אצטילכולין מ 50 picomolar ל 10 micromolar בתא מיוגרף כפי שמתואר בכתב היד טקסט. לאחר השלמת ניסוי תגובת המינון, יש לנקז את התאים, לשטוף את מקטעי אבי העורקים בתמיסת HEPES-PSS חמה ואוורירית שלוש פעמים ולנוח את הרקמות למשך 30 דקות. לאחר מנוחה של מקטעי אבי העורקים במשך 30 דקות, מסננים את התאים ומוסיפים תמיסת אשלגן גבוהה טרייה וחמה לכל תא, ולאחר מכן מסננים את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS כאשר תגובת ההתכווצות לתמיסת אשלגן גבוהה מגיעה לרמת F כפי שהודגם קודם לכן.הדגירה מראש של מקטעי אבי העורקים עם L-NAME על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי העבודה המוכנה של 100 מילימולאר כדי להעריך את התרומה של ייצור תחמוצת החנקן לווזורגנציה הנגרמת על ידי אצטילכולין. מבלי להסיר את השם L, הוסף את המינון התת-מקסימלי של PE לתא כדי לגרום להתכווצות אבי העורקים. המתן עד שעקומת הכיווץ המושרה על ידי PE תגיע לרמה להתפתחות מתח, ולאחר מכן הוסף אצטילכולין לתא המיוגרף כדי להשיג ריכוז סופי של 500 ננו-מולר.המתן מספר דקות כדי לרשום כל שינוי אפשרי בפיתוח הכוח עד שהרמה שנוצרה תהיה יציבה. מסננים את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS חמה שלוש פעמים. מקם את תא המיוגרף מתחת למיקרוסקופ והעביר בעדינות חוט קטן דרך לומן של אבי העורקים.בעדינות להעביר את החוט דרך לומן לתקופה קצרה. חותכים את אבי העורקים לטבעות אבי העורקים בקוטר 2 מילימטרים ומרכיבים טבעות אלה על תא המיוגרף. הגדר את המתח האופטימלי על 6 מיליניוטון ואפשר לרקמה לנוח במשך 30 דקות בחיץ HEPES-PSS חם ואוורירי, ולאחר מכן לנקז את התאים ולהוסיף 5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS חמה ורעננה לכל תא.אפס את הכוח עבור כל תאי המיוגרף וסובב באיטיות את המיקרומטר נגד כיוון השעון כדי להגדיל את המרחק בין הפינים עד שהכוח הרשום מגיע למתח האופטימלי הרצוי עבור אבי העורקים של העכבר. לחץ על הרקמה במשך 15 עד 20 דקות נוספות במתח האופטימלי, ולאחר מכן לנקז את התאים פעם נוספת לפני הוספת 5 מיליליטר של תמיסה אשלגן גבוהה לכל תא. מסננים שוב את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS שלוש פעמים לאחר שתגובת ההתכווצות לתמיסת היונים עתירת האשלגן מגיעה למישור.לנוח את הרקמה במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן מראש חוזה את קטעי אבי העורקים עם PE, סוכן vasoconstrictor. כאשר הכוח המושרה על ידי PE מגיע לרמה, הוסף את הריכוז התת-מקסימלי של אצטילכולין לתא המיוגרף כדי להשיג ריכוז סופי של 500 ננו-מולר. המתן 3 דקות כדי לוודא שהרמה הרשומה לפיתוח כוח המושרה על-ידי PE אינה משתנה לפני סיום הניסוי.שלמותו וכדאיותו של כל כלי שיט מבודד הוערכו על ידי רישום ייצור הכוח המתכווץ. שיא הכוח המוקלט שימש מאוחר יותר כדי לנרמל את ייצור הכוח לאותו קטע בתגובה לאגוניסטים. מדידות כלי הדם בתיווך האנדותל תיארו כיווץ בתיווך שרירים חלקים ויצירת כוח.כאשר ההתכווצות המושרה על ידי PE הגיעה לרמה, מינונים הולכים וגדלים של אצטילכולין השיגו את vasorelaxation מקסימלית במגזר מבודד. מעכב תחמוצת החנקן L-NAME חסם לחלוטין את כלי הדם המושרה על ידי אצטילכולין באבי העורקים שנדבק מראש, מה שמצביע על כך שאצטילכולין משרה את כלי הדם של אבי העורקים באמצעות הגדלת ייצור תחמוצת החנקן. יתר על כן, הסרת שכבת האנדותל ממקטעי אבי העורקים גם חסמה את כלי הדם הנגרמים על ידי אצטילכולין ומדגישה את תפקיד האנדותל בהרפיית כלי הדם.הקפידו להיות עדינים בזמן הטיפול, הניקוי והניתוח של כלי הדם. חשוב להוסיף את האגוניסטים והמעכבים הפרמקולוגיים בזהירות כדי לא להפריע לטבעות כלי הדם המותקנות על תאי המיוגרף. המידע יכול לסייע בתכנון ניסויים כדי לחקור גישות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בתפקוד לקוי של שכבות כלי דם מסוים.

measurement-endothelium-dependent-vasorelaxation-mouse-thoracic-aorta

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה myography אוטומטית עבור מדידות כוח בעורקים mesenteric מבודד מתואר. היא מעסיקה Mulvany-Wire הלפרן כפול אוטומטי Myograph 510A לקבוע התגובות phenylephrine וסידן תאיים. השיטה מאפשרת קביעת עקבית של תגובות איזומטרי כדי אגוניסטים בכלי קטן של קטרים ​​של 6-30 מיקרומטר, באופן עצמאי.

התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית

בmyography לחץ, קטע קטן בשלמות של כלי הוא רכוב על גבי שני cannulas קטן ודחוס כדי luminal לחץ מתאים. כאן, אנו מתארים את השיטה כדי למדוד את התגובה של vasorelaxation העכבר...

הערכת תפקוד עורקי התנגדות Murine באמצעות לחץ Myography

myography לחץ משמש כדי להעריך vasoactivity של עורקים קטנים המתפתחים התכווצות מתמשכת כאשר לחץ. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט להעריך במגזרים בודדים של עורקי mesenteric קטנים מחולדות, vasoactivity ואת ההשפעה של לחץ intraluminal על קוטר כלי דם.

הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

תפקוד לקוי של האנדותל קשור למצבי מחלה רבים והוא ניבוי של אירועי לב וכלי דם שליליים בבני אדם. הרחבת כלי דם בתיווך זרימה (FMD) היא שיטת אולטרסאונד לא פולשנית של הערכת תפקוד האנדותל. אפשרויות המתודולוגיות וניסיון מפעיל עשויות להשפיע על תוצאות. גישה שיטתית לFMD במחקרים בבני אדם נדונה כאן.

אולטראסאונד הערכה של האנדותל-Dependent זרימה בתיווך התרחבות של עורק הזרוע במחקר קליני

אנו מתארים טכניקה למדידת נוקשות אבי העורקים מיחסי הלחץ-קוטר שלו in vivo בעכברים. קוטר אבי העורקים נרשם על ידי אולטרסאונד ולחץ אבי העורקים נמדד באופן פולשני עם צנתר לחץ במצב מוצק. לחץ הדם משתנה בהדרגה ונמדד הקוטר המתקבל.

מדידה עולה אבי העורקים נוקשים In vivo בעכברים באמצעות אולטראסאונד

Videomicroscopy מערכות משמשות כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של רקמת שומן מבודדת רבים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ולא תרופתי. טכניקה זו ניתן לבחון פנוטיפים microvascular בתחומים שונים רקמת שומן בבני מהשמנת יתר.

הערכה של רקמת שומן אנושי הפונקציה Microvascular באמצעות Videomicroscopy

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

הטכניקה myograph החוט משמש כדי לחקור פונקציות השריר החלק בכלי הדם, תרופות חדשות מסך. אנחנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור מודדים את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר, הקרנת מרפה החדש של השריר החלק בכלי הדם.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

אימון בעצימות גבוהה ב היפוקסיה הוא פרוטוקול כי הוכח לזירוז שעשוי להיות מועיל אצל חלק מהחולים וסקולרית עיבודים וכדי לשפר ספורטאים חזר על יכולת הריצה. כאן, אנו לבחון את הכדאיות של עכברים הדרכה באמצעות פרוטוקול, לזהות את אלה עיבודים לכלי הדם באמצעות ex-vivo הערכת תפקוד כלי הדם.

Supramaximal פעילות גופנית בעצימות ובשפתיים והערכת תפקוד כלי הדם בעכברים

הפרוטוקול מתאר את השימוש במיגרפיה תיל כדי להעריך את המתח האיזוגרפי של העורקים המסריים מבודדים מעכברים, עם שיקול מיוחד של האפנון על ידי גורמים שפורסמו מתאי האנדותל ורקמות השומן הפריסקולרית.

הערכה של תגובתיות וסקולרית באמצעות העורקים המבודדים הבודדים באמצעות התמקדות באפנון על ידי פריסקולרית של הרקמות

למדו מדידת תפקוד אנדותלי בכלי דם באמצעות מיוגרפיה טנסומטרית באבי העורקים החזי של עכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של תגובתיות כלי דם בתנאים פיזיולוגיים מבוקרים לחקר ביולוגיה וסקולרית.

מדידה של כלי דם תלויי אנדותל באבי העורקים החזי של העכבר באמצעות מיוגרפיה של תא נפח קטן טנסומטרי

גלה סרטונים נוספים