ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים ליצור רשתות כלי דם היררכיות בתוך דש מהונדס ומושתל לחלוטין, מה שסלל את הדרך למחקרים חדשים על התנהגות כלי הדם תחת אינטגרציה in vivo. טכניקה זו שילבה את הרבגוניות של שתי טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד כדי ליצור ולהרכיב כלים על המיקרו והמזוקל שניתן לפענח ישירות באמצעות כלי שיט מארחים באמצעות מיקרו-כירורגיה. ניתן להשתמש בדשים וסקולריים מהונדסים במלואם לטיפול בפגמים גדולים ברקמות, כמו גם כדי לספק פלטפורמה לחקר התפתחויות ואינטגרציה של רקמות.

ניתן להרחיב את השיטות המוצעות כדי לחקור את שילובם של תאים ספציפיים לרקמות, כמו גם כדי להעריך את השימוש בחומרים ביולוגיים ותומכים שונים. התחילו במילוי תבנית BVOH ב-30 מיקרוליטרים של תמיסת הפולימר. צנטריפוגה התבנית ב 100 פעמים גרם במשך 2 דקות ולמלא את התבנית עם 20 מיקרוליטרים נוספים של תמיסת הפולימר כדי להבטיח מילוי מלא.

הקפיאו את התבניות המלאות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שכל תמיסת הפולימרים תקפא. הסר את הממס מן התבניות על ידי lyophilizing אותם לילה. כדי להסיר את חומר התבנית הקורבן, מעבירים את התבניות לאחר תהליך הייבוש בהקפאה לאמבטיית מים שעברה דה-יוניזציה של 5 ליטרים תחת ערבוב עדין.

החליפו את המים באמבטיה כשהם מתעננים. כאשר כל ה-BVOH מתמוסס, מייבשים את הפיגומים באוויר ומאחסנים אותם בתא ואקום עד לשימוש. מעבירים כ-4 מיליליטרים של חומר התמיכה המוכן והדחוס לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות באמצעות פיפטת תזוזה חיובית.

הקש על צלחת הבאר על משטח קשה כדי לאלץ את חומר התמיכה להתפשט באופן שווה בבאר. הכינו תרחיף המכיל 2 מיליון תאי גזע של HAMEC-ZsGreen ו-6 מיליון תאי גזע של עיסת דנטלית ב-10 מיליליטרים של מדיום תאי האנדותל. צנטריפוגה של תרחיף התא ב 200 פעמים g במשך 4 דקות כדי לקבל גלולת תא, ולאחר מכן לשאוף את התווך supernatant ולהחיות את גלולת התא ב 1 מיליליטר של rhCollMA bioink כדי לקבל bioink עם ריכוז תאים כולל של 8 מיליון תאים לכל 1 מיליליטר של bioink.

התאם מחט בקוטר פנימי של 0.22 מילימטר למחסנית הדפסה ענברית של 3 מיליליטר והנח את המחסנית בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. העבר 1 מיליליטר של תערובת התאים-ביואינק למחסנית ההדפסה על ידי מילויה מלמעלה באמצעות פיפטת תזוזה חיובית להפחתת בועות. התקן את מחסנית ההדפסה בכלי המתאים בביו-פרינטר.

שרטטו תבנית דו-ממדית של ריבוע 4 מילימטרים המכיל במרכזו תעלה מעגלית בקוטר 2 מילימטרים. הוציאו את הסקיצה ב-4 מילימטרים כדי לקבל קוביית 4 מילימטרים עם ערוץ מרכזי. ייצא אובייקט זה כקובץ STL.

ייבא תבנית STL של צלחת בעלת 12 בארות ללשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter והנח אותה באזור המיועד של מיטת ההדפסה הווירטואלית. ייבא את קובץ STL של צורת הקובייה ללשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter. לחץ על תיבת הסימון השתמש בחותך חיצוני ולאחר מכן קביעת התצורה של slicer תחת המקטע מאפיין האובייקט.

בחלון המוקפץ, בחר תבנית rectilinear עבור תבנית המילוי והקלד 30% בצפיפות המילוי, לחץ על קבל. לחץ על הקובייה והזיז אותה באמצעות העכבר כדי למקם עותק של צורת הקובייה בכל באר וירטואלית רצויה. לחץ על כפתור הוספת החומר בכרטיסיית החומרים של תוכנת חיתוך הביו-פרינטר כדי ליצור הגדרות חומר חדשות עבור ביואינק rhCollMA.

בחר את הגדרות החומר להדפסה. עבור לחץ, סוג 2 psi, ועבור סוג מהירות 20 מילימטרים לשנייה בתיבות המתאימות. הקצה את ערכי רוחב הקו וגובה הקו ל- 0.24 מילימטרים, ואת ערך התאוצה ל- 400 מילימטרים לשנייה מרובעת.

בכרטיסייה מידול מוצק, לחץ על אובייקט הקובייה ולאחר מכן לחץ על חומר rhCollMA ממקטע החומר כדי להקצות אותו לצורת הקובייה. בכרטיסייה bioassembly, לחץ על שלח עבודה הדפסה כפתור כדי לשלוח את משימת ההדפסה לפריפרינטר הביולוגי. טען את מחסנית ההדפסה העמוסה בביואינק התאי לתוך כלי ההפצה הפנאומטי של הסביבה 3 מיליליטר של הביופרינטר מבוסס ההבלטה התלת-ממדית.

לחץ על כפתור Cool תחת הכרטיסיה חימום בקרה או קירור במסך ממשק bioprinter כדי להגדיר את טמפרטורת מיטת ההדפסה ל-4 מעלות צלזיוס. טען את הצלחת עם אמבט התמיכה על מיטת המדפסת. בכרטיסיה הדפסה במסך ממשק bioprinter, לחץ על משימת ההדפסה ולאחר מכן לחץ על התחל, ואחריו GO כדי להתחיל את עבודת ההדפסה.

לאחר ההדפסה, חשוף את לוחית הבאר למקור אור של 405 ננומטר בעוצמה של 3 מילי-וואט לסנטימטר מרובע למשך 30 שניות כדי ליזום את הקישור ההצלבה של הביואינק rhCollMA. לאחר ההצלבה, דגירו את צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 דקות לפחות עד שכל אמבט התמיכה נמס. יש לשאוף בעדינות את אמבט התמיכה הנוזלי ולהחליפו אותו במדיום תאי האנדותל.

דגירה של המבנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. מיד לאחר הסרת חומר התמיכה של הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית, הניחו פיגום כלי דם מצופה PLLA:PLGA מצופה פיברונקטין ליד המבנה המודפס ביולוגית. הכנס את פיגום כלי הדם בערוץ הראשי של המבנה המודפס ביולוגית.

דגירה של המבנים המורכבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך יומיים. הכינו תרחיף תאי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי המבטא tdTomato בריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר. הניחו טיפה של 20 מיקרוליטר של תרחיף תא זה על משטח הידרופובי.

מניחים בעדינות את פיגומי כלי הדם על גבי הטיפות כך שהלומן של הפיגום בקצה אחד יוצר מגע עם טיפת התא. שאפו את הטיפה מהקצה הנגדי של הפיגום ומילאו את לומן שלה בתרחיף התא. מניחים את הפיגום היושב בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומכניסים אותו לסיבוב בתוך אינקובטור לח למשך 60 דקות.

לבסוף, מעבירים את הפיגום לצלחת של 12 בארות ומוסיפים 2 מיליליטרים של מדיום תאי האנדותל. מבט מהצד של דש מהונדס מייצג שצולם ארבעה ימים לאחר בטנת האנדותל של פיגום כלי הדם מוצג כאן. המיקרו-וסקולטורה המודפסת ביולוגית מוצגת בירוק, ואילו רירית האנדותל מוצגת באדום.

התמונה הייצוגית מציגה את האנסטומוזות בין כלי הדם המודפסים ביולוגית לבין רירית האנדותל. חיסון לאקטין השריר החלק, גרעינים ותאי אנדותל לאחר שבעה ימים של דגירה מוצג כאן. התמונה הייצוגית מציגה אנסטומוזות שהושלמו של הדש המהונדס עם עורק הירך של חולדה לפני הסרת המהדק ולאחר הסרת המהדק.

טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההבשלה והאינטגרציה של כלי דם מודפסים בתלת-ממד in vivo ולנטר את הזלוף של השתל באיבר האחורי כדי לבסס את הפוטנציאל והבטיחות לשימוש בו לטיפול בפגמים ברקמות.