שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי
5 במאי 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .
ה- PCLS תומך בהערכת פעילות תאי השריר החלקים של דרכי הנשימה וכלי הדם בסביבה של רקמה כמעט שלמה, ובכך מספק מודל ex vivo שלא יסולא בפז למחקר ריאתי. במונחים של מחקר שרירים חלקים, פרוסות הריאה החתוכות באופן מדויק משמרות את הפנוטיפ in vivo של תאי שריר חלקים ואת האינטראקציה שלהם עם המבנים הסובבים אותם, תוך מתן גישה לתאי שריר חלקים, החשובים למחקר מכניסטי ברמה התאית. כדי להתחיל, להניח את גוף העכבר על לוח דיסקציה במצב שכיבה.
הצמידו את הזנב, כפות הרגליים הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25G וחיטוי הגוף עם 70% אתנול. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת. לאחר מכן, כוון את קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה והסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניות הדו-צדדיות כדי לחשוף את הלב.
שימו לב שאונות הריאה קורסות כאשר חלל החזה נפתח. השתמש במספריים כדי להסיר רקמות רכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה. בקצה העליון של קנה הנשימה יוצרים חור קטן בקוטר 1.2 מילימטרים שאמור לאפשר מעבר של קצה צנתר IV בצורת 20G Y.
חברו יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מיליליטר ממולא מראש ב-0.5 מיליליטר אוויר והיציאה השנייה עם מזרק 3 מיליליטר הממולא מראש ב-2 מיליליטר של תמיסת אגרוז של 1.5% שחוממה ל-42 מעלות צלזיוס. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח לקנה הנשימה ל-5 עד 8 מילימטרים. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בקצב של 1 מיליליטר ל-5 שניות.
שימו לב שהריאה מתרחבת לאורך הציר הפרוקסימלי עד הדיסטלי. עצרו את ההזרקה כאשר קצה כל אונת ריאות מנופח. לאחר מכן, הזריקו 0.2 עד 0.3 מיליליטרים של אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את האגרוז השיורי לתוך דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.
קליפ סגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים. כדי למלא את כלי הדם הריאתיים, מלאו מזרק 1 מיליליטר בג'לטין חם של 6% וחברו אותו לצנתר וריד קרקפת מחט. ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.
דוחפים את המחט במשך 2 עד 3 מילימטרים לחדר הימני ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי. הזריקו כ-0.2 מיליליטרים של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים. יש לשמור את המחט במקומה במשך חמש דקות לאחר ההזרקה ולקרר את אונות הריאה על ידי שפיכת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות ולהניח את הגוף במקרר.
לאחר שלב זה, הסר את ריאת העכבר ואת הלב מרקמות החיבור שמסביב עם מספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח. קצצו את אונת הריאה וכיוונו אותה כך שכיוון החיתוך יהיה מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.
חברו אותו על גבי עמוד הדגימה עם דבק-על. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות הממולאות מראש בתמיסת HBSS קרה.
העבירו את הפרוסות לצלחות פטרי מלאות במדיום תרבות DMEM/F-12. מניחים את הכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס לילה לפני הניסויים. הניחו פרוסת ריאה אחת חתוכה במדויק בכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות מלאה ב-HBSS.
אתר את הפרוסה באמצע הבאר ולאחר מכן הסר את פתרון ה- HBSS עם פיפטה. תחת מיקרוסקופ, מצאו את נתיב הנשימה וכלי הדם של המטרה בפרוסה ולאחר מכן כסו אותה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש כדי לחשוף את אזור כלי הדם הממוקד. הניחו מכונת כביסה ממתכת חלולה על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן.
לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטרים של פתרון HBSS כדי להטביע את הפרוסות. לאחר 10 דקות, הקלט את תמונות הבסיס. כדי לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם, הסר בזהירות את תמיסת HBSS עם פיפטה והוסף 600 מיקרוליטרים של HBSS עם אגוניסט.
כדי להכין את מאגר טעינת צבע הסידן, תחילה להמיס 50 מיקרוגרם של צבע עם 10 מיקרוליטרים של DMSO ו 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית ב 1 מיליליטר של DMSO. ערבבו 10 מיקרוליטרים של תמיסת פלורוני עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת צבע סידן. הוסיפו את התערובת הזו ל-2 מיליליטרים של תמיסת HBSS המכילה 200 מיקרומולר של סולפובירומופתליין.
לאחר מכן, מניחים 15 פרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק ב-2 מיליליטרים של מאגר העמסת סידן ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן דגירה ב-HBSS המכילה 100 מיקרומולאר סולפובירומופתליין למשך 30 דקות. לאחר מכן, מניחים פרוסות טעונות צבע סידן על כיסוי גדולה. מלאו שומן סיליקון בוואקום גבוה במזרק 3 מיליליטר המחובר למחט קהה 18G או לקצה פיפטה 200 מיקרוליטר וציירו שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי, מעל ומתחת לפרוסה.
מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. מניחים את זכוכית הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך החדר מקצה אחד עם פיפטה.
הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו. תא הפרוסה מוכן כעת להדמיית הסידן עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר במהירות גבוהה. צרורות עורקי דרכי הנשימה הריאתיים נצפו בפרוסות ריאה חתוכות במדויק בעובי 150 מיקרומטרים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
במצב מנוחה, זוהתה דרכי הנשימה על ידי תאי אפיתל קובידליים עם עורק ריאתי סמוך. בעקבות חשיפה למתכולין, האזור הלומינלי הצטמצם ואילו עורק הריאה לא הראה תגובה לגירויים. תגובות התכווצות דרכי הנשימה כומתו על ידי אחוז הירידה באזור הלומינלי והראו תגובות תלויות מינון דומות בתרביות של יום אחד וחמישה ימים.
עם ההגעה לשדה הריאה ההיקפי, דרכי הנשימה המוליכות מסתעפות לצינורות נשימה ושקים המקיפים את העורקים התוך-אסינאריים הקטנים. כאשר נחשפים לאנדותלי הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים מתכווצים, ולאחר מכן הרפיה המושרה על ידי NOC-5. במצב המנוחה, פרוסות טעונות צבע הסידן הראו פלואורסצנטיות נמוכה בתאי השריר החלקים של דרכי הנשימה ומערכת כלי הדם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.
עם החשיפה לאגוניסטים, עוצמת הפלואורסצנציה של הסידן עלתה בתאים והתפשטה לתא כולו, אשר תאם את האותות המתנדנדים. טכניקה חכמה, זה חיוני כדי לנפח את הריאה עם agarose באופן הומוגני ולהימנע הזרקת אגרוז מהירה או מוגזמת. תמיד לדחוף אוויר בקצה כדי לשטוף את האגרוז מדרכי הנשימה המוליכות אל חלל הנאדיות הדיסטליות.
לסיכום, באמצעות תרבית פרוסות הריאה החתוכה באופן מדויק, ניתן לספק מגוון מיוחד של תפקודי שרירים חלקים ריאתיים ולדגום את דה-ויסות השרירים החלק במבחנה. הוא גם מספק פלטפורמה אידיאלית לסינון תרופות נובו vasodilatory או ברונכודילטור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מפרט פרוטוקול להכנת פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) מעכברים, במטרה לחקור את יכולת התכווצות השריר החלק בסביבה הדומית לתנאי in vivo. באמצעות שימור הפנוטיפ של in vivo, פרוסות אלו מאפשרות חקירה מפורטת של תפקוד תאי השריר החלק במחקרים ריאתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- פיזיולוגיה ריאתית
- מודלים ex vivo
- תפקוד שריר חלק
רקע
- PCLS מהווים כלי למחקרים מכניסטיים.
- שימור האינטראקציות התאיות הוא מפתח להערכות מדויקות.
- שיטה זו מאפשרת גישה לסוגי תאים ספציפיים לצורך ניתוחים נוספים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פרוסות ריאה בחיתוך מדויק מריאות עכבר.
- שימוש בדימיג חי ובסוכנים פרמקולוגיים להערכת התכווצות שרירים.
- טכניקות של דימיג סידן לניטור פעילות תאית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול משמר בהצלחה את השלמות המבנית של הריאה לצורך מחקרים תפקודיים.
- נצפתה התכווצות מוגברת בתגובה לאגוניסטים, מה שמעיד על התגבּרות של תאי שריר חלק.
- הממצאים תומכים ברלוונטיות של PCLS להבנת המכניקה של שריר חלק ריאתי.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את היעילות של PCLS כמודל מחקר ex vivo לניתוח שריר חלק ריאתי.
- הפרוטוקול מספק תובנות שעשויות לסייע בהבנת מחלות נשימה ובפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) מאפשרות בחינה ex vivo של כושר התכווצות שריר חלק בדרכי הנשימה ובעורקים התוך-ריאתיים בהקשר של רקמה קרובה למצב טבעי, ובכך הן תומכות בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת הנשימה. פלטפורמה זו משמרת פנוטיפים תאיים ואינטראקציות של מיקרו-סביבה in vivo, ומספקת ביטחון ניבויי עבור תיקוף מטרות וסריקה תפקודית. מודלי PCLS ממוקמים באופן אסטרטגי כדי לגשר בין ביולוגיה של גילוי למחקר תרגומי בתיקי מחלות ריאה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של הבקרה על התכווצות השריר החלק ברקאה ריאתית שלמה.
- תומך במחקרים מכניסטיים של מסלולי איתות המתווכים על ידי Ca2+ הרלוונטיים לפתוגנזה של מחלות.
- מקליט תיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שימור אינטראקציות טבעיות בין תאים לבין תאים ובין תאים למטריקס.
- מספק פלטפורמה לבחינה מבוססת היפותזה של תגובות כלי דם ודרכי נשימה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאות כמותיות הניתנות לשחזור של התכווצות דרכי הנשימה וכלי הדם לצורך הערכת תרכובות.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ביולוגיות (bioassays) לסריקת תרופות מרחיבות סימפונות ומרחיבות כלי דם.
- מאפשר סקליביליות למחקרים השוואתיים על פני תנאים מרובים או מודלים גנטיים.
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לבדיקות פרמקולוגיות המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים הרלוונטיים למחלה במודלים של אסטמה ויתר לחץ דם ריאתי.
- שומר על רצף תרגומי על ידי מידול של כיווצות שריר חלק לא מווסתות ex vivo.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת ראיות תפקודיות למעורבות המטרה.
- מסייע בגילוי סממנים ביולוגיים באמצעות דימות כמותי של תגובות כיווץ ואיתות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
טכנולוגיית PCLS משולבת משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי המולקולות המובילות ועד לתיקוף פרה-קליני בתהליכי העבודה של פיתוח תרופות למערכת הנשימה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי בקרה על התכווצות ומעורבות של מסלולים ברקמות ריאה.
- סריקה: מספקת מודלים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה להערכת מודולציה פרמקולוגית של שריר חלק.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של הפחתת שטח הלומן ודינמיקת איתות של Ca2+.
- מחקר תרגומי: מקשרת between ממצאים ex vivo למודלים של מחלות in vivo לצורך רציפות מכניסטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה לצרכים מגוונים של מחקר על מחלות נשימה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות תפקודיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך התקדמות (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות נשימתיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמת ריאה ובטכניקות של דימות חיים.
- מחייב גישה לחיתוך באמצעות ויברטום, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותשתית לדימות כמותי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת פרוסות ובדיקות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מינים שונים או מודלים של מחלות.
- מגבלות מעשיות כוללות את משך החיוניות של הפרוסות ושונות פוטנציאלית באיכות הרקמה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Inflation of Mouse Lungs
3:25
Sectioning of Lung Lobes
4:09
Analyzing Contractile Responses of Intrapulmonary Airways and Arteries
5:08
Analyzing Ca2+ Signaling of Airway or Vascular Smooth Muscle Cells
6:45
Results: Analyses of Airways and Pulmonary Arteries in Mouse Precision-Cut Lung Slices
8:07
Conclusion
