בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

מסכי מדכאים מזהים אינטראקציות גנטיות שישפכו אור על תפקודי הגן המעניין, כמו גם על המסלולים והתהליכים הביולוגיים שבהם הם עשויים להיות מעורבים ב- vivo. טכניקה זו יכולה לזהות קשר גנטי בין שני תוצרי גנים שאולי לא הודגמו באמצעות גישות אחרות. ניתן להרחיב את התוצאות של מסכים כאלה בשמרים לאורגניזמים אאוקריוטים גבוהים, שכן רוב המסלולים והתהליכים הביולוגיים הבסיסיים נשמרים לאורך האבולוציה.

הצלחת התוכנית תלויה בזמינות, באיכות גבוהה וביעילות הגבוהה של הפיכתה לתאי שמרים. לפיכך, פרוטוקול טרנספורמציה עם הפלסמיד לפני גידול זן המחיקה של Schizosaccharomyces pombe ell1 ב-32 מעלות צלזיוס על צלחת בינונית YE. יש ליטול לולאה מלאה בזן מוטנטי ell1 מהצלחת, לחסן חמישה מיליליטר של תוסף YE בינוני, ולאחר מכן לדגור על הבקבוקון תוך כדי ניעור בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר הדגירה, יש לדלל את תרבית הגדילה של הלילה ב-100 מיליליטר של מדיום YE טרי המכיל את התוספים הרצויים כדי להשיג צפיפות אופטית של 0.3 ב-600 ננומטר. דגירה של המדיום ב-32 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות במהירות של 200 עד 550 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה לשלב אמצע העץ. לאחר חלוקת 100 מיליליטר של תרבית לשני צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר, גלולה את התאים ב 4, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שהסופרנאטנט מושלך, יש לתלות את כדור התא במיליליטר אחד של מים סטריליים. צנטריפוגה ולהשליך את supernatant פעם נוספת ולאחר מכן להשעות את כדור התא במיליליטר אחד של ליתיום אצטט TE. גלולה את התא על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש כל כדור תא ב-250 מיקרוליטרים של ליתיום אצטט TE. לאחר מכן, העבר 125 מיקרוליטרים של התאים המוסמכים לארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים שונים לשלבי הטרנספורמציה הבאים. מרתיחים דנ"א נשא מאשכי סלמון או זרע הרינג למשך דקה אחת ומניחים מיד את הצינור על קרח.

עבור כל טרנספורמציה, הוסף 10 מיקרוליטרים של DNA נשא חד-גדילי לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל 125 מיקרוליטרים של התאים המוסמכים וערבב בעדינות על ידי פיפטציה. לאחר מכן, להוסיף 50 מיקרוגרם של Schizosaccharomyces pombe cDNA הספרייה לצינור המכיל תאים מוכשרים ותערובת DNA נשא. לאחר דגירה של הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, להוסיף 260 microliters של פוליאתילן גליקול-ליתיום אצטט פתרון ומערבבים על ידי pipetting.

לדגום את הצינור המכיל את תערובת הטרנספורמציה ב 32 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ללא רעידות. הוסיפו לצינור 43 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד שחומם מראש וערבבו בעדינות. עכשיו, לחשוף את הצינור להלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

גלולה את התאים והשליכו את הסופרנטנט כפי שהוכח קודם לכן ולאחר מכן פיפטה החוצה את שאריות פוליאתילן גליקול ליתיום אצטט TE פתרון. יש לתלות את התאים ב-100 מיקרוליטרים של מים סטריליים ולצלחת אותם על צלחת EMM2 אחת המכילה את התוספים הנדרשים ו-0.2 מיקרוגרם למיליליטר של 4-NQO. לאחר מכן, אפשרו למושבות להופיע על הלוחות על ידי דגירה של הלוחות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך חמישה עד שישה ימים.

להקרנה נוספת, פסים את המושבות המתקבלות על אותה צלחת בינונית בנוכחות 0.2 מיקרוגרם למיליליטר של 4-NQO. עבור ניסוי טרנספורמציה בספרייה אחד, השתמש ב-500 מיקרוליטרים של תאים מוכשרים לטרנספורמציה ובצלחת 1 על 10 של תערובת הטרנספורמציה על צלחת EMM2 עם התוספות הנדרשות חסרות 4-NQO כדי לחשב את המספר הכולל של שיבוטי הספרייה שהתקבלו לאחר הטרנספורמציה ומסך עבור השיבוטים המדכאים. הוסף 100 עד 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים לכל באר של צלחת מיקרוטיטר סטרילית של 96 בארות.

באמצעות קיסם סטרילי או קצה מיקרופיפטה של 20 עד 200 מיקרוליטר, בחר כמות קטנה של אינוקולום מכל מושבה המתקבלת לאחר טרנספורמציה של ספריית cDNA על הצלחת המכילה 4-NQO. מוסיפים את האינוקולום מכל אחת מהמושבות השונות לכל באר בצלחת המכילה מים סטריליים ומערבבים היטב. זהה שלושה מיקרוליטרים של תרחיף התאים מכל באר על לוחות אגר EMM2 והוסף ריכוזים מתאימים של 4-NQO לצלחות.

לאחר גידול התאים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, זהה את המושבות המראות צמיחה בריכוזים שונים של 4-NQO כמדכאות פוטטיביות. כדי לאמת עוד יותר את המדכאים, הגדילו את המדכאים הנבחרים ואת זני הבקרה המתאימים בתווך EMM2 המכיל 225 מיקרוגרם למיליליטר של אדנין ואורציל בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם רעידות. לאחר סיום הדגירה, דיללו את התאים לצפיפות אופטית של 0.3 במדיום EMM2 טרי והגדילו אותם תוך כדי רעידות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עד לשלב אמצע העץ.

זהה דילולים סדרתיים מתאימים של תרביות על צלחות EMM2 עם תוספי מזון נדרשים המכילים 0.4 מיקרומולר 4-NQO או 0.01% MMS. לשליטה, אתרו את הזנים על צלחת EMM2 עם תוספי התזונה הנדרשים, אך ללא כל חומר המזיק לדנ"א. לדגור את הצלחות ב 32 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד חמישה ימים כדי לעקוב אחר הצמיחה.

זהה את הזנים המוטנטים שעברו טרנספורמציה עם הגן באורך מלא או וקטור ריק כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה, יחד עם הטרנספורמטורים של הספרייה. לחסן מושבת שמרים אחת במדיום EMM2 המכילה 225 מיקרוגרם למיליליטר של אדנין ואורציל ולגדל את התאים ב-32 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם רעידות ב-200 עד 250 סל"ד. בסוף הדגירה, קציר 10 מיליליטר תרבות של צפיפות אופטית 0.5 על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את supernatant ו להשהות את גלולת התא ב 0.2 מיליליטר של חיץ תזה. הוסף 0.2 מיליליטר של אלכוהול פנול כלורופורם איזואמיל ו -0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה לצינור המיקרוצנטריפוגה. מערבבים על ידי מערבולת הצינור במשך שתי דקות, ולאחר מכן דגירה על קרח במשך דקה אחת.

צנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את השכבה המימית העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול. לאחר צנטריפוגה שוב ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות, להעביר את השכבה המימית העליונה לצינור טרי.

לאחר מכן, הוסף שני כרכים של 100% אתנול ונפח 1 על 10 של נתרן אצטט לצינור ודגרה במינוס 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לזרז את הדנ"א על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. יש לשטוף את גלולת הדנ"א ב-70% אתנול ולייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

החזירו את הדנ"א ל-20 מיקרוליטרים של מים סטריליים והשתמשו בשלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דנ"א פלסמיד כדי להפוך תאי Escherichia coli מוכשרים. באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי, הפוך את פלסמידי השמרים המבודדים לזן Escherichia coli TOP10 ופזר את התאים על צלחות LB עם אנטיביוטיקה נדרשת. לאחר בידוד הפלסמיד מטרנספורמטורים של Escherichia coli באמצעות פרוטוקול ליזיס אלקליין סטנדרטי, בצע את השילובים המתאימים של אנזימי הגבלה כדי לבדוק את שחרורו של מקטע ה- DNA המכניס על ידי עיכול הגבלה.

לאחר מכן, הפוך מחדש את הפלסמידים המראים שחרור הכנסה לאחר עיכול הגבלה בזן המחיקה ell1 כדי לבדוק את יכולתם להציל את הפנוטיפ הרגיש ללחץ גנוטוקסי של זן המחיקה ell1. זן ה-Schizosaccharomyces pombe שנמחק הראה רגישות כלפי 4-NQO בהשוואה לזן מסוג בר. מספר רב של מושבות מתקבלות על הצלחת חסר 4-NQO.

עם זאת, פחות טרנספורמנטים התקבלו על צלחת 4-NQO מכיוון שהם פועלים כמדכאי עונשין של רגישות 4-NQO של מוטנט האפס ell1. מתוך 620 הטרנספורמטורים, 74 הראו צמיחה ב-0.4-מיקרומולאר 4-NQO. נצפה כי רק 16 מתוך 74 הראו צמיחה בנוכחות 0.8-micromolar 4-NQO.

זן המחיקה ell1 התהפך עם וקטור ריק וכל 16 הטרנספורמטורים הראו צמיחה על הצלחת חסר 4-NQO. מוטציית המחיקה ell1 המכילה רק את הווקטור הריק לא הראתה צמיחה ב-0.8-micromolar 4-NQO ושישה טרנספורמטורים הציגו צמיחה ב-0.8-micromolar 4-NQO, מה שמרמז על כך ששיבוטי הספרייה שנמצאים בהם יכולים לדכא את פנוטיפ הלחץ הגנוטוקסי של מוטציית האפס ell1. עיכול מוגבל של פלסמיד מדכא 84 ו -104 שחרר תוספת של קילו-בסיס אחד ו-800 זוגות בסיסים, בהתאמה.

החדרה מחדש של שיבוטי הפלסמיד המדכאים לתוך מוטציית האפס ell1 הביאה לדיכוי רגישות הצמיחה הקשורה ל-4-NQO. עם זאת, בנוכחות MMS, פלסמידים מדכאים המכילים מוטציה מחיקה ell1 הראו צמיחה רבה יותר מאשר אלה עם וקטור ריק. הבדיקות הגנטיות האלה יכולות להגדיר מנגנוני עמידות פוטנציאליים ולזהות מטרות חלבוניות של תרכובות אנטי-בקטריאליות, אנטי-פטרייתיות, אנטי-פרזיטיות או אנטי-סרטניות חדשניות.

הם יכולים גם לזהות את מנגנון הפעולה של תרופות תרופתיות.