Name: אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו בידוד וגידול אדיפוציטים ראשוניים מעכברים לחקר התנגודת לאינסולין. השיטה כוללת הפרדת תאים, הבחנה, וניתוח איתות באמצעות Western blot לבדיקת רגישות לאינסולין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לדניאל מונדרגון, אנטוניו פראדו, פרננדו לופז-בררה, מרטין גרסיה-סרבין, אלחנדרה קסטילה ומריה אנטונייטה קרבאג'ו על עזרתם הטכנית, ולג'סיקה גונזלס נוריס על העריכה הביקורתית של כתב היד. פרוטוקול זה נתמך על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (ל- Y.M).

כל ניסויי המכרסמים אושרו על ידי הוועדה לביואתיקה של המכון לנוירוביולוגיה של UNAM, פרוטוקול מספר 075.
1. בידוד של תאים מבשרי אדיפוציט עכבר
<ol><li>הרדימו עכברי C57BL/6 זכרים בני 8-10 שבועות (למשל, על ידי שאיפתCO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן) (ארבעה בעלי חיים בכל בידוד). לחטא את העכברים על ידי שפשוף עם 70% אתנול ולקבל את רקמת השומן מיד לאחר ההקרבה. הערה: לאחר המתת חסד של מכרסמים, בודד את רקמת השומן מיד ובצע את כל השלבים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית. עכברים מוחזקים תחת מחזורי אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.</li>
	<li>נתחו את רקמת השומן התת עורית המפשעתית מכל עכבר. הסר רק את רקמת השומן, הימנע מהסרת שריר, עור או כל רקמה אחרת, ואסוף אותה בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג 1 (1.5 מ"ג / מ"ל) על קרח. יש להמיס קולגנאז מסוג 1 באלבומין בסרום בקר (BSA) בעל גלוקוז גבוה-1% בסרום בקר (BSA) של Dulbecco ולסנן דרך מסנני מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר.</li>
	<li>חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות עם מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים את הדגימות על ידי דגירה עם תמיסת collagenase מסוג 1 ב 37 ° C בשייקר אורביטלי (150 סל"ד) במשך 30 דקות (מניחים את הצינור המכיל שומן ו collagenase במצב אופקי עבור משטח רעד גדול יותר). בדקו את העיכול כל 10 דקות כדי לוודא שהוא פועל (נראה לעין פירוק רקמות) וכדי למנוע עיכול יתר (ראו איור משלים S1).</li>
	<li>סנן באמצעות מזרק רשת 200 מיקרומטר (בעבר autoclaved) כדי לחסל רקמות לא מעוכל עם collagenase. העבירו את המסנן מעבר לקצה הצינור כדי לנקז כמה שיותר תאים לתמיסה. הוסף 15 מ"ל של DMEM-1% BSA קר כדי לעצור את העיכול וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לשאוף את השכבה העליונה המכילה אדיפוציטים בוגרים ואת רוב השכבה הנוזלית; הימנע מלגעת או להפריע לכדור. הוסף 20 מ"ל של סרום מלח חוצץ פוספט קר (PBS)-2% סרום בקר עוברי (FBS) והשהה מחדש את הכדורית. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant, שואף תחילה את השכבה העליונה כדי לחסל את האדיפוציטים והשומן הנותרים. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של אשלגן אמוניום כלורי (ACK) (לליז תאי דם אדומים) ולדגור על קרח למשך 5 דקות. הוסף 10 מ"ל של PBS-2% FBS, ערבוב וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-Fc (חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 מדוללת ב-PBS-2% FBS [1:150]) כדי להפחית את הקשירה בתיווך קולטן Fc על ידי נוגדנים בעלי עניין. דוגרים על קרח במשך 5 דקות. העבר את מתלה התא לצינור 5 מ"ל שמתאים למתלים המצוננים מראש של מפריד תאים מגנטי וצנטריפוגה ב 400 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לסלק את supernatant, להוסיף 200 μL של תערובת של CD31 (PECAM-1) נוגדן חד שבטי (390)-ביוטין (1:100) ונוגדן חד שבטי CD45 (30-F11)-ביוטין (1:100), לערבב היטב, לדגור על קרח במשך 15 דקות (להכין דילול נוגדנים בתמיסת אנטי Fc; ראה טבלה 1). הוסף 400 μL של PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הערה: CD31 ו- CD45 הם סמנים של תאי אנדותל ותאים המטופויטיים, בהתאמה.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט ודגרו ב-100 מיקרו-ליטר מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין (1:5) במשך 15 דקות על קרח (הכינו דילול נוגדנים בתמיסת אנטי-Fc, ראו טבלה 1). הוסף 400 μL של PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של PBS-2% FBS. הסר צברי תאים או חלקיקים גדולים מהמתלים של תא בודד באמצעות מסנן קדם-הפרדה (70 מיקרומטר). ראשית, הפעל את המסנן עם 100 μL של PBS-2% FBS, להעביר את השעיית התא דרך המסנן (לאסוף בצינור נקי), ולבסוף לשטוף את המסנן עם 100 μL של PBS-2% FBS.</li>
	<li>בצע הפרדה מגנטית של תאים באמצעות אסטרטגיית הפרדה שלילית עם מפריד תאים מגנטי.<ol><li>הניחו את הדגימה במיקום A של מדף הקירור (ודאו שהמדף מקורר מראש) ובשתי שפופרות ריקות במיקום B ו-C כדי לשחזר את התאים שאינם מסומנים ומסומנים, בהתאמה.</li>
		<li>טען את מאגר הכביסה ואת מאגר ההפעלה לבקבוקים המתאימים לפני הפעלת הציוד. תכנת את הציוד לביצוע ההפרדה המגנטית של תאים באמצעות פרוטוקול DEPLETE . הערה: פרוטוקול זה מיועד לדלדול במצב רגיל להסרת תאים עם ביטוי אנטיגן רגיל (במקרה זה, תאים המסומנים עם anti-CD31 ו- anti-CD45), אם ההתאוששות היא בעדיפות הגבוהה ביותר.</li>
		<li>במקטע ההפרדה , בחר את מספר הדגימות שיש להפריד ובחר בפרוטוקול DEPLETE . לחצו על 'הפעל' והתחילו את ההפרדה. בסוף התוכנית, לשחזר את התאים unlabeled צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב- 500 מיקרוליטר של מדיום צמיחה (טבלה 1).</li>
	<li>זרעו את הנגמ"שים בבאר אחת מתוך צלחת בת 12 בארות שצופתה בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5% (מתקבלים כ-50,000-75,000 תאים). הוסף 400 μL של 2.5% מטריצת קרום מרתף כדי לכסות את כל פני השטח של כל באר. מיד לאחר הסרת התמיסה העודפת והשארת שכבה קטנה בלבד, הניחו לצלחת להתייבש (ללא מכסה) בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך שעה אחת לפחות. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 . שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.</li>
	<li>במפגש של 80%, יש להסיר את המדיום לחלוטין ולשטוף עם 350 μL של PBS-2% FBS. קצור את התאים עם 350 μL של 0.05% trypsin-EDTA במשך 2 דקות ב 37 ° C. הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה ולאסוף את התאים בצינור חרוטי חדש 50 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>מעבירים את הנגמ"שים ללוחות של 12 בארות (10,000-20,000 תאים לבאר) שצופו בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%. יש לדגור ב-37°C עם 5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. הערה: ניתן לעבור בנגמ"שים פעם אחת. לאחר מכן, הם מאבדים את יכולתם להתרבות ולהבדיל. ראה את זרימת העבודה עבור תהליך בידוד הנגמ"שים באיור משלים S2.</li>
</ol>2. התמיינות אדיפוציט ואינדוקציה של עמידות לאינסולין
הערה: לשמור על תאים בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 ולבצע שלבים הכוללים שינוי מדיום וטיפולים עם TNF-α ואינסולין בתוך מכסה מנוע סטרילי.
<ol><li>במפגש של 80%, התחל את תהליך הבידול; יש לשאוף מכל מצע גידול ולהחליף אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות (טבלה 1) המכיל 3.3 ננומטר חלבון מורפוגנטי עצם (BMP4) בכל באר.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, החלף את המדיום בתווך הבידול (500 מיקרוליטר לבאר) ובקוקטייל הבידול (טבלה 1).</li>
	<li>הסר את המדיום 72 שעות מאוחר יותר והוסף 100 ננומטר של אינסולין ב 500 μL של מדיום התמיינות טרי. הערה: תאים מתחילים להראות מראה עגול עם טיפות שומנים קטנות בפנים.</li>
	<li>שאפו מכל אמצעי בידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של FBS בינוני-2% פשוט (טבלה 1) 48 שעות מאוחר יותר. יש לגרום לתנגודת לאינסולין עם 4 נ"ג/מ"ל של TNF-α. כלול בארות בקרה ללא טיפול TNF-α.</li>
	<li>לאחר 24 שעות של דגירה, הוסף 4 ננוגרם/מ"ל TNF-α ב-FBS פשוט בינוני-0% (טבלה 1). שמור על בארות בקרה ללא טיפול TNF-α.</li>
	<li>הפעל את מסלול איתות האינסולין 24 שעות מאוחר יותר על ידי הוספת אינסולין 100 ננומטר ודגור במשך 15 דקות ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2 . הסר את המדיום ולשטוף עם 500 μL של PBS. כלול בארות בקרה ללא טיפול באינסולין.</li>
</ol>3. הערכת מסלול איתות אינסולין על ידי כתם מערבי
<ol><li>מיצוי וכימות חלבונים<ol><li>שטפו כל באר של תאים עם 500 מיקרוליטר של PBS ושמרו על קרח כדי לשכך את התאים ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA (טבלה 1) המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 1% שנוסף ממש לפני בידוד הדגימה. מגרדים את כל פני השטח של הבאר עם קצה ומעבירים את הליזט לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל (לשמור על קרח).</li>
		<li>יש לדגור במשך שעה אחת ב-4°C בשייקר מסתובב, לערבב באמצעות מערבולות ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C ולשחזר את הסופרנאטנט (לשמור על קרח).</li>
		<li>קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד (אין לדלל את הדגימה כדי לכמת).</li>
		<li>קח את הנפח הדרוש המתאים ל 40-60 מיקרוגרם ו denature עם חיץ Laemmli 6x (טבלה 1) על ידי דגירה ב 97 ° C במשך 15 דקות תוך כדי רעד ב 550 סל"ד. מקפיאים עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה ג'ל SDS-polyacrylamide<ol><li>ביצוע אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) עם ג'ל פוליאקרילאמיד 7.5% בעובי 1.5 מ"מ. הכניסו את הג'ל למיכל ומלאו בחיץ ריצה (טבלה 1).</li>
		<li>הוסף 3 μL של תקן חלבון prestained לבאר הראשונה של הג'ל ולטעון כל דגימה לתוך הבארות הבאות.</li>
		<li>הפעל את הג'ל ב 80 V במשך כ -15 דקות כדי להבטיח את הדגימה נכנסת מטריצת ג'ל רכז פוליאקרילאמיד. לאחר מכן, הגדל את המתח ל 90 V למשך 2.5 שעות או עד שניתן לראות את סמן המשקל המולקולרי של 37 kDa בקצה התחתון של הג'ל.</li>
		<li>מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום ניטרוצלולוז בתא חצי יבש למשך 35 דקות במתח של 25 וולט. לפני כן, טבלו את הג'ל, הקרום והמסננים במאגר העברה (טבלה 1) למשך מספר דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>כתם מערבי<ol><li>לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה במי מלח חוצצים (TBS) המכילים 0.1% Tween 20 (TBS-T 0.1%) (טבלה 1) למשך 3 דקות עם טלטול ב-30 סל"ד.</li>
		<li>חסום את הממברנה בתמיסת חסימה (טבלה 1) ב- 4 ° C למשך שעה אחת בסיבוב קבוע.</li>
		<li>חתכו את הממברנה לשלושה חלקים על פי סמן המשקל המולקולרי כדי לדגור לילה עם נוגדנים ראשוניים שונים (מדוללים בתמיסה חוסמת) ב 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קבוע: נוגדן פוספו-IRS1 (Tyr608) (1:1,000), רצועה צפויה ב 180 kDa; נוגדן לקולטן פוספו-אינסולין β (Tyr1150/1151) (1:1,000), רצועה צפויה ב-95 kDa; נוגדן פוספו-אקט (Ser473) (1:1,000), רצועה צפויה ב-60 kDa.</li>
		<li>שטפו את הממברנות 5x במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T 0.1%.</li>
		<li>דוגרים על הממברנות עם הנוגדן המשני המקביל המצומד לפרוקסידז (מדולל בתמיסת חסימה) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בסיבוב קבוע: peroxidase affiniPure חמור נגד ארנב IgG (H+L) (1:5,000).</li>
		<li>שטפו את הממברנות 5x במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T 0.1%.</li>
		<li>זהה את החלבונים באמצעות מערכת זיהוי chemiluminescence. הכינו את המצע בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>מניחים את הכתם בשקית ניילון ומוסיפים 200 μL של מצע chemiluminescent כדי לכסות לחלוטין את הממברנה. יש לנקז את עודפי המצע ולהסיר בועות אוויר.</li>
		<li>חשוף כל כתם במשך 30-60 שניות במערכת הדמיה בעלת ביצועים גבוהים התואמת לכימילומינסנציה.</li>
		<li>הפשיט את הממברנות (שלבים 10-13 של החלק המערבי של הכתם) כדי לשבור את אינטראקציות נוגדן-אנטיגן ובכך לאפשר ניפוח מחדש של קרום הניטרוצלולוז. לשחזר את הממברנות ולשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBS-T 1% ב 50 סל"ד.</li>
		<li>דגירה במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של 0.2 מ 'NaOH ב 50 סל"ד.</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד במי ברז ב-50 סל"ד.</li>
		<li>שטפו במשך 10 דקות עם TBS-T 1% ב-50 סל"ד.</li>
		<li>חזור על שלבים 2-9 של קטע הכתם המערבי כדי לדגור על הממברנה עם אנטי בטא טובולין (55 kDa) כבקרת העמסה באמצעות דילול 1:1,000.</li>
		<li>בצע ניתוח דנסיטומטרי25 עבור כל חלבון באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li>
<li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95%2C000-dalton+subunit+of+its+own+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li>
<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li>
<li>Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnamuno%2C+X+%22Encyclopedia+of+Endocrine+Diseases.+Second+edition%22">Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition</a>. , Academic Press. 370-384 (2019).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li>
<li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li>
<li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li>
<li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li>
<li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li>
<li>James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li>
<li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrime+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li>
<li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li>
<li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+obesity+cause+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li>
<li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li>
<li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-%CE%BAB+activation+by+TNF-%CE%B1+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li>
<li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine%2Fthreonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+western+blots%3A+pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells%3A+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+white+adipocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li>
<li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+aging%3A+does+aging+make+fat+go+MAD%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Geronotology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes%3A+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is%2C+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a%2Coverexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li>
<li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מאמר זה מספק שיטה לחקר עמידות לאינסולין המשתמשת באדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלת ב-TNF-α. למודל זה יש יתרון בכך שניתן לגדל בתרבית אדיפוציטים ראשוניים בתנאים מוגדרים לפרקי זמן ארוכים עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים26. משך הבדיקה הוא 15-20 ימים, אם כי שינויים באחוז האדיפוציטים המובחנים יכולים להתרחש בין ניסויים. לאדיפוציטים ראשוניים יש יתרונות על פני קווי תאים מכיוון שהם לא הורחבו ברציפות בתרבית והם לוכדים באופן הדוק יותר את מגוון הרקמה שממנה הם נגזרים27. יתר על כן,...

אינסולין הוא הורמון אנבולי המיוצר על ידי תאי β של איון הלבלב והרגולטור העיקרי של מטבוליזם של גלוקוז ושומנים. בין תפקידיו הרבים, אינסולין מווסת את ספיגת הגלוקוז, סינתזת גליקוגן, גלוקונאוגנזה, סינתזת חלבונים, ליפוגנזיסוליפוליזה 1. האות המולקולרי הראשוני לאחר אינטראקציה של אינסולין עם הקולטן שלו (IR) הוא הפעלת הפעילות הפנימית של חלבון טירוזין קינאז של IR2, וכתוצאה מכך אוטופוספורילציה3 שלו והפעלה לאחר מכן של משפחה של חלבונים הידועים בשם מצעי קולטן אינסולין (IRS), אשר נקשר חלבונים מתאמים המוביל להפעלת מפל של קינאזות חלבון4 . אינסולין מפעיל שני מסלולי איתות עיקריים: פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)-חלבון קינאז B (AKT) וחלבון קינאז המופעל על ידי ראס-מיטוגן (MAPK). הראשון מהווה נקודת הסתעפות או צומת4,5 עיקריים להפעלת גורמים רבים במורד הזרם המעורבים בתפקודים פיזיולוגיים מגוונים, כולל ויסות הומאוסטזיס דלק, ואילו האחרון מווסת את גדילת התאים והתמיינותם 4,6. פעולות אינסולין תלויות בסופו של דבר בסוג התא ובהקשר הפיזיולוגי7.
אחת הרקמות המטבוליות העיקריות המגיבות לאינסולין היא רקמת השומן. רקמת השומן הלבן היא סוג השומן הנפוץ ביותר בבני אדם ובמכרסמים, המופץ בתוך שומן תת עורי (בין העור לשרירים) ושומן ויסצרלי (סביב האיברים בחלל הבטן). בהתחשב בנפח הגדול שלהם, אדיפוציטים או תאי שומן הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמת השומן. תאי שומן אלה יכולים להיות חומים/בז' (תרמוגניים), ורודים (בבלוטת החלב) ולבנים 8,9. אדיפוציטים לבנים שומרים על עתודות האנרגיה העיקריות בגוף בצורה של טריגליצרידים, תהליך תלוי אינסולין. אינסולין מקדם הובלת גלוקוז וליפוגנזיס, בעוד שהוא מעכב ליפוליזה או פירוק שומנים 7,10. זה גם מקל על התמיינות של preadipocytes לתוך אדיפוציטים - תאים בוגרים אוגרים שומן11.
תנגודת לאינסולין מתרחשת כאשר רמת אינסולין נורמלית מייצרת תגובה ביולוגית מוחלשת, וכתוצאה מכך היפראינסולינמיה מפצה12. עמידות לאינסולין היא מצב הקשור לעודף משקל והשמנת יתר5, שבשילוב מוביל לסוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות מטבוליות אחרות13. היפראינסולינמיה מפצה תנגודת לאינסולין ברקמות היקפיות כדי לשמור על רמות גלוקוז תקינותבדם 14. עם זאת, אובדן או תשישות של תאי β בסופו של דבר, יחד עם עמידות מחמירה לאינסולין, מובילים לרמות גלוקוז גבוהות בדם התואמות לסוכרת סוג2 5. לכן, עמידות לאינסולין והיפראינסולינמיה יכולות לתרום להתפתחות מחלות מטבוליות הנגזרות מהשמנת יתר15. יתר על כן, השמנת יתר עלולה לגרום לדלקת מקומית כרונית בדרגה נמוכה המקדמת עמידות לאינסולין ברקמת השומן15,16,17. בנוסף, שינויים שמקורם בהשמנת יתר ברקמת השומן, כגון פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה מופחתת ואדיפוגנזה, מובילים לרמות נמוכות יותר בסרום האדיפונקטין (רגיש לאינסולין) ולהפרשת גורמים כגון מעכב מפעיל פלסמינוגן 1 (PAI-1), חומצות שומן חופשיות ואקסוזומים לזרם הדם, המחריפים את התנגודת לאינסולין17.
היבטים רבים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין עדיין אינם ידועים. מודלים In vitro ו-in vivo פותחו כדי לחקור את המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמות מטרה עיקריות, כולל רקמת שומן. היתרון של מודלים במבחנה הוא שלחוקרים יש שליטה רבה יותר על תנאי הסביבה והם יכולים להעריך עמידות לאינסולין בסוגי תאים ספציפיים. בפרט, לתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) יש את הפנוטיפ האינדיבידואלי של הרקמה התורמת, אשר עשוי לשקף פיזיולוגיה טוב יותר מאשר קווי תאי אדיפוציט. גורם עיקרי הגורם לתנגודת לאינסולין במבחנה הוא גורם נמק גידולי α (TNF-α). TNF-α הוא ציטוקין מעודד דלקת המופרש על ידי אדיפוציטים ומקרופאגים ברקמת השומן18. בעוד שהוא נדרש לשיפוץ והרחבה תקינים של רקמת השומן19, חשיפה ארוכת טווח ל-TNF-α גורמת לתנגודת לאינסולין ברקמת השומן in vivo ובאדיפוציטים במבחנה20. טיפול כרוני ב-TNF-α במספר סוגי תאים מוביל לזרחן סרין מוגבר הן של IR והן של IRS-1, ובכך מקדם ירידה בזרחון טירוזין21. זרחן מוגבר של IRS-1 על שאריות סרין מעכב את פעילות IR טירוזין קינאז ועשוי להיות אחד המנגנונים העיקריים שבאמצעותם טיפול כרוני ב- TNF-α פוגע בפעולת האינסולין22,23. TNF-α מפעיל מסלולים המערבים מעכב סרין/תראונין קינאז של גורם גרעיני ĸB קינאז β (IKKβ) ו-c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK משרה תוכנית שעתוק פרו-דלקתית מורכבת אך גם זרחן ישיר IRS-16.
הבנת הפתוגנזה של תנגודת לאינסולין הפכה חשובה יותר ויותר כדי להנחות את הפיתוח של טיפולים עתידיים נגד סוכרת סוג 2. נגמ"שים הוכיחו את עצמם כמודל מצוין לחקר הביולוגיה של תאי השומן, כולל הרגישות והעמידות לאינסולין, ולזיהוי התכונות הפנימיות של אדיפוציטים ללא תלות בסביבה המערכתית. נגמ"שים ניתן להשיג בקלות ממחסני שומן שונים, ובתנאים המתאימים, להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. בשיטה זו ניתן להעריך השפעות ישירות על התנגודות/רגישות לאינסולין באדיפוציטים.

<table><tbody><tr><td><חזק>1. בידוד תאי מבשר אדיפוציטים של עכבר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזה&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>מפריד AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנת מרתף (מטריג'ל)</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>גורם גדילה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11) - ביוטין&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג 1</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז נמוך</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>גורם גדילה</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>תערובת ITS</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית 2-פוספט</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>גורם גדילה</td></tr><tr><td>חומצה לינולאית-אלבומין</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 בינוני</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>נורמוצין</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>גורם גדילה</td></tr><tr><td>Peniciline-Streptomycine</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>מסנני טרום הפרדה (70 ומיקרו; מ)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td><חזק>2. התמיינות אדיפוציטים ואינדוקציה של עמידות לאינסולין</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>קוקטייל בידול</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>קוקטייל בידול</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא</td><td>D1756</td><td>קוקטייל בידול</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>רוזיגליטזון</td><td>קיימן</td><td>71742</td><td>קוקטייל בידול</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>מו"פ די סיסטמס</td><td>210-ת"א-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><חזק>3. הערכת מסלול איתות אינסולין על ידי נוגדן כתם מערבי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי בטא טובולין</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>מאגר Laemmli</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>מאגר RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>RIPA מאגר</td></tr> <tr><td></td><td>מערכת FluorChem EProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>מאגר הפעלה והעברה</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA</td></tr><tr><td>buffer 2- מרקפטואתנול</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>מאגר העברה</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>מאגר RIPA</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA</td></tr><tr><td>מאגר ניטרוצלולוזה&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>BioRad</td><td>תמיסה חוסמת</td><td>1706404</td></tr><tr><td>תקן חלבון צבוע מראש&nbsp;</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-קולטן אינסולין ובטא; &nbsp;</td><td>איתות תאים</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-IRS1 (Tyr608) נוגדן</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>מאגר ריצה ו-laemmli</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS מצע כימילומינסנט</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>מאגר הפעלה, העברה ו-laemmli</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>RIPA buffer - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>סיגמא</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

תנגודת לאינסולין היא השפעה מופחתת של אינסולין על תאי המטרה שלו, שמקורה בדרך כלל בירידה באיתות קולטני האינסולין. תנגודת לאינסולין תורמת להתפתחות סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות אחרות הנובעות מהשמנת יתר בשכיחות גבוהה ברחבי העולם. לכן, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין היא רלוונטית מאוד. מספר מודלים שימשו לחקר עמידות לאינסולין הן in vivo והן in vitro; אדיפוציטים ראשוניים מייצגים אפשרות אטרקטיבית לחקור את מנגנוני התנגודת לאינסולין ולזהות מולקולות המנטרלות מצב זה ואת המטרות המולקולריות של תרופות רגישות לאינסולין. כאן, ביססנו מודל עמידות לאינסולין באמצעות אדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלים בגורם נמק גידולי α (TNF-α).
תאים מבשרי אדיפוציט (APCs), שבודדו מרקמת שומן תת-עורית של עכבר המעוכל בקולגנאז על ידי טכנולוגיית הפרדת תאים מגנטית, מתמיינים לאדיפוציטים ראשוניים. לאחר מכן נגרמת תנגודת לאינסולין על ידי טיפול ב-TNF-α, ציטוקין מעודד דלקת המפחית את הזרחון/הפעלה של טירוזין של חברי מפל איתות האינסולין. ירידה בזרחון של קולטן אינסולין (IR), מצע קולטן אינסולין (IRS-1) וחלבון קינאז B (AKT) מכומתים על ידי כתם מערבי. שיטה זו מספקת כלי מצוין לחקר המנגנונים המתווכים תנגודת לאינסולין ברקמת השומן.

במהלך השנים האחרונות, השכיחות המוגברת של השמנת יתר וסוכרת סוג 2 הובילה לחיפוש אינטנסיבי אחר המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמת השומן. בעזרת הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן להתמיין בין APCs לאדיפוציטים בוגרים כדי להעריך עמידות ורגישות לאינסולין. ברגע שה-APCs מגיעים למפגש, לוקח להם 10 ימים להשלים את ההתמיינות שלהם לאדיפוציטים בוגרים ואת השראת TNF-α שלהם לתנגודת לאינסולין (איור 1).
נגמ"שים מראים מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, המאופיינת בצורתם השטוחה והמוארכת ובהיצמדות...

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

ניתן להעריך עמידות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים, המאפשרים מחקר של תורמים בהקשרים פיזיולוגיים שונים, כגון רזים לעומת שמנים, או תאים ממאגרי שומן שונים. אדיפוציטים ראשוניים שומרים על רבות מהתכונות המהותיות שלהם וניתן לגדל אותם בתרבית בתנאים מוגדרים למשך תקופת זמן ארוכה, עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים. כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות, התאים חייבים להיות במפגש של 80%.אם ההתמיינות מתחילה במפגש נמוך או גבוה יותר, התאים יתמינו פחות או יאבדו את יכולת ההתמיינות שלהם. לאחר הקרבת החיה, לחטא את העכברים על ידי שפשוף עם 70% אתנול. נתחו את רקמת השומן התת עורית המפשעתית מכל עכבר ואספו אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, המכיל 15 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג אחד על קרח.חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות עם מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים את הדגימות על ידי דגירה עם תמיסת collagenase מסוג אחד ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלול ב 150 סל"ד במשך 30 דקות. בדוק את העיכול כל 10 דקות כדי להבטיח שזה עובד, וכדי למנוע עיכול יתר. מסננים באמצעות מזרק רשת 200 מיקרומטר כדי לחסל את הרקמה שלא מתעכלת עם collagenase, ולהעביר את המסנן על קצה הצינור כדי לנקז תאים רבים ככל האפשר לתוך התמיסה.הוסף 15 מיליליטר של DMEM קר 1% BSA כדי לעצור את העיכול, וצנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את השכבה העליונה המכילה אדיפוציטים בוגרים ואת רוב השכבה הנוזלית. הוסף 20 מיליליטר של PBS קר 2% FBS אליו להשעות מחדש את הכדור.לאחר צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות, להסיר את supernatant על ידי שאיפה השכבה העליונה כדי לחסל את האדיפוציטים והשומן הנותרים. השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ ACK שוכב. דוגרים על קרח במשך חמש דקות.הוסף 10 מיליליטר של PBS 2% FBS וערבב אותו. לאחר צנטריפוגה של חמש דקות ושאיפה של הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של תמיסת אנטי FC. דוגרים על קרח במשך חמש דקות ומעבירים את תרחיף התא לצינור של חמישה מיליליטר שנכנס למתלים המצוננים מראש של מפריד תאים מגנטי.לאחר צנטריפוגה של חמש דקות וסילוק הסופרנטנט, הוסיפו לו 200 מיקרוליטר של תערובת ביוטין נוגדן חד שבטי CD 31 וביוטין נוגדן חד שבטי CD 45. מערבבים היטב ודגרים על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאפו את הסופרנאטנט ודגרו עליו ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין במשך 15 דקות על קרח. הוסף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.כדי להסיר את צברי התא, או חלקיקים גדולים, ממתלי התא הבודד עם מסנן קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר, הפעל את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. מעבירים את מתלה התא דרך המסנן, ואוספים אותו בצינור נקי. לאחר מכן לשטוף את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.כדי לבצע הפרדה מגנטית של תאים באמצעות אסטרטגיית ההפרדה השלילית, מקם את הדגימה במיקום A של המדף המצונן ושתי שפופרות ריקות במיקומים B ו- C כדי לשחזר את התאים שאינם מסומנים ומסומנים. לאחר מכן טען את מאגר הכביסה ואת מאגר ההפעלה לתוך הבקבוקים המתאימים. במקטע ההפרדה, בחר את מספר הדגימות שיש להפריד ובחר בפרוטוקול התרוקנות.לחצו על Run והתחילו את ההפרדה. בסוף התוכנית, לשחזר את התאים ללא תווית. לאחר מכן, צפו צלחת בת 12 בארות במטריצת קרום מרתף על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף של 2.5% כדי לכסות את כל פני השטח של כל באר.הסר את התמיסה העודפת ותן לצלחת להתייבש בתוך מכסה המנוע הזרימה הלמינרית למשך שעה לפחות. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות והשלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מדיום צמיחה. זרעו את התאים המקדימים של האדיפוציט, או APCs, בבאר אחת מתוך צלחת 12 בארות שצופתה בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%.דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני, ומשנים את התווך כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. לאחר הסרת המדיום לחלוטין, לשטוף את התאים עם 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. קצרו את התאים עם 350 מיקרוליטר של 0.05% EDTA במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה.לאסוף את התאים בצינור חרוטי חדש 50 מיליליטר צנטריפוגה ב 400 גרם במשך חמש דקות. מעבירים את הנגמ"שים ללוחות של 12 בארות, שצופו בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%, ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.במפגש של 80%, שאפו מכל מצע גידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות, המכיל 3.3 חלבון מורפוגנטי של עצם ננו-מולרית בכל באר. לאחר 48 שעות, להחליף את המדיום עם 500 מיקרוליטר לכל מדיום בידול באר, ואת קוקטייל בידול. הסר את המדיום 72 שעות מאוחר יותר והוסף 100 ננומולר של אינסולין ב 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות טרי.48 שעות לאחר מכן, גרמו לתנגודת לאינסולין עם ארבעה ננוגרם למיליליטר של גורם נמק הגידול אלפא, או TNF אלפא. שאפו מכל מדיום בידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של 2% FBS בינוני פשוט באלפא TNF. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, יש להוסיף ארבעה ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא ב-FBS בינוני פשוט של 0%.הפעילו את מסלול איתות האינסולין 24 שעות מאוחר יותר על ידי הוספת 100 ננו-מולארי אינסולין ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולשטוף עם 500 מיקרוליטר של PBS, כוללים היטב שליטה ללא טיפול באינסולין. לחלץ חלבון ולמדוד את הזרחן של סמני איתות אינסולין על ידי כתם מערבי.תאים מקדימים של אדיפוציטים תת-עוריים במפגש של 80% לפני השראת התמיינות בלוחות תרבית 12 בארות, ואדיפוציטים ראשוניים לאחר שבעה ימים של השראת התמיינות מוצגים באיור זה. התנגודת לאינסולין המושרה על ידי TNF אלפא באדיפוציטים ראשוניים תת-עוריים הודגמה על ידי ירידה בזרחון המושרה על ידי אינסולין של קולטן אינסולין, מצע קולטן אינסולין אחד, וחלבון קינאז B או AKT. הממברנה נבדקה עם קולטן אינסולין אנטי זרחני, מצע קולטן אינסולין אנטי זרחני אחד, AKT אנטי זרחני, ואנטי בטא טובולין שימש כבקרת העמסה.האות הודגם באמצעות זיהוי כימילומינסנציה. הכתמים המייצגים והכימות משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כאן. כאשר מנסים הליך זה, דבר אחד שצריך לטפל בו הוא שהשראת עמידות לאינסולין עם TNF אלפא היא עם 2% FBS למשך 24 שעות ועם 0% FBS במשך 24 השעות האחרונות.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי סטרומה ממח עצם (BMSCs) לאדיפוציטים. בתהליך הדו-שלבי, בנוכחות גורמי גדילה והורמונים ספציפיים, BMSCs בלתי ממוינים מתמיינים תחילה לפראדיפוציטים. השלב השני הכולל טיפול בגלוקוז ואינסולין מוביל להיווצרות אדיפוציטים בוגרים עם טיפות שומנים מרובות.

בעכבר חוץ גופי עצם עצם התמיינות תאי סטרומה לאדיפוציטים

preadipocytes הלבן העיקרי שבודד מרקמות שומן לבנות בעכברים יכול להיות מובחן לתאים בז'ים / brite. מוצג כאן הוא מודל למערכת סלולרית אמינה ללמוד רגולציה המולקולרית של "השחמה" של שומן לבן.

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז&#39;ים / Brite

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

במודלים של בעלי חיים orthotopic של סרטן השחלות לשכפל טוב יותר מחלות אנושיות, ולכן לשפר את ההבנה שלנו של התקדמות סרטן תגובת הגידול לטיפול. מודל העכבר מקבל זריקה intrabursal של בלוציפראז-להביע תאים סרטניים בשחלות. טיפול מנוהל באמצעות gavage הפה. הגידול מנוטרת על...

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

למדו בידוד וגידול אדיפוציטים ראשוניים מעכברים לחקר התנגודת לאינסולין. השיטה כוללת הפרדת תאים, הבחנה, וניתוח איתות באמצעות Western blot לבדיקת רגישות לאינסולין.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

גלה סרטונים נוספים