RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

צביעת RNA FISH שימושית להדמיה, זיהוי וכימות של מיקרובים המאכלסים או מדביקים C.elegans באופן טבעי, כולל חיידקי מיקרוביום ופתוגנים תוך-תאיים. טכניקה זו היא פשוטה, מהירה וחזקה, ומאפשרת להכתים ולדמיין ביעילות מיקרובים בהקשר של חיה שלמה. אנו יכולים להשתמש ב-RNA FISH כדי לזהות ולדמיין חיידקי מיקרוביום של המעיים ב-C.elegans פראיים.

זה יכול לעזור לנו להבין אינטראקציות דומות במערכות יונקים. לאחר העברת נמטודות עם המיקרוב הרצוי המעניין, מצלחות NGM לצינורות מיקרוצנטריפוגה, שטפו את הנמטודות על ידי הוספת מיליליטר אחד של 1X PBST לצינורות מיקרופוגה. סובבו את הדגימות במיקרוצנטריפוגה או בננופוגה במהירות המתאימה.

באמצעות פיפטה, להסיר את כל למעט 100 microliters של supernatant. יש לחזור על הכביסה עם PBST פעמיים-שלוש. כדי לתקן את הנמטודות עם paraformaldehyde, להתחיל על ידי הוספת 33 microliters של 16% paraformaldehyde לצינור microfuge המכיל 100 microliters של supernatant מעל גלולת נמטודה לריכוז סופי של 4% paraformaldehyde.

דגירה של הדגימות המכילות את הנמטודות התיישבו או נגועות במיקרוב המעניין במשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון paraformaldehyde ולהוסיף 0.5 מיליליטר של PBST לדגימות. סובבו את הדגימות במיקרוצנטריפוגה במהירות המתאימה כפי שצוין בכתב היד של הטקסט.

בעזרת פיפטה, הסר כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוסף 0.5 מיליליטר של PBST לדגימות בצינורות microfuge. יש לחזור על הכביסה עם PBST פעמיים-שלוש.

לאחר השטיפה האחרונה, סובבו את הדגימות והסירו את הסופרנטנט, תוך השארת הכדור ללא הפרעה. לאחר מכן, הכינו מיליליטר אחד של מאגר הכלאה לכל דגימה. הוסף 800 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה לצינורות המיקרופוגה המכילים את גלולת הנמטודה.

גלולה את הדגימות במיקרוצנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הכינו 100 מיקרוליטרים לכל דגימה של חיץ הכלאה עם גשושית FISH הרצויה לריכוז סופי של 5 עד 10 ננוגרם לבדיקת מיקרוליטר ומערבולת לערבוב.

הוסף 100 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה המכיל בדיקה FISH לכל דגימה. מערבבים על ידי הבהוב עדין או היפוך של הצינורות. דגירה של הדגימות למשך הלילה באמבטיה יבשה בטמפרטורה של 46 עד 54 מעלות צלזיוס או במערבל תרמי בטמפרטורה של 46 עד 54 מעלות צלזיוס ב-1, 200 סיבובים לדקה.

הכינו שלושה מיליליטר של מאגר כביסה לכל דגימה. צנטריפוגה את הדגימות במהירות המתאימה. הסר את מאגר ההכלאה באמצעות פיפטה תוך הקפדה להשאיר את כדור הנמטודה ללא הפרעה.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה מוכן לכל דגימה. צנטריפוגה את הדגימות במהירות המתאימה. הסר את חיץ הכביסה באמצעות פיפטה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה מוכן לכל דגימה. לדגום את הדגימות במשך שעה אחת ב 48 עד 56 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה או מערבל תרמי ב 48 עד 56 מעלות צלזיוס ב 1, 200 סיבובים לדקה. אם אתם דוגרים באמבטיה יבשה, הפכו בעדינות את הצינורות כל 15 עד 20 דקות.

צנטריפוגה את הדגימות במהירות המתאימה. בעזרת פיפטה, הסר את מאגר הכביסה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה. הוסף 100 עד 500 מיקרוליטר של PBST לכל אחת מהדגימות.

בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות ב- PBST בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבוע עד שהפרוטוקול מוכן להמשך. גלולה את הדגימות במהירות המתאימה. הסר כמה שיותר PBST מבלי להפריע לכדור הנמטודה.

הוסף 20 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPI לדגימות. טען פיפטר של 20 מיקרוליטרים עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר והשתמש במספריים כדי לחתוך את קצה הפיפטה כדי לאפשר פיפטות של נמטודות גדולות יותר. בעזרת קצה הפיפטה החתוך, מעבירים 5 עד 10 מיקרוליטרים של הכדור על מגלשת מיקרוסקופ.

מכסים בכריכה בגודל 22 על 22. כדי לאחסן את המגלשות, אטמו את שולי הכיסוי עם לק ושמרו אותם בקופסה חשוכה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לשימוש נוסף. תחת מיקרוסקופ ניגודיות ההפרעות הדיפרנציאליות, נמצא כי זן פראי מסוג Caenorhabditis tropicalis מיושב עם חיידק שנראה כי הוא נצמד באופן מכוון לאפיתל המעי.

אות פלואורסצנטי מהגשושית האוניברסלית הירוקה 16S rRNA ומהמין האדום אלפאפרוטאובקטריה חופפים לחלוטין, מה שמרמז על כך שרוב החיידקים המאכלסים את המעיים הם חיידק אלפאפרוטאובקטריה דבק. הגנום הדו-צדדי של נגיף ה-Orsay מורכב ממקטעי RNA1 ו-RNA2, ופותחו בדיקות FISH המכוונות לשני המקטעים. חלבון ZIP1 המתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק נראה מקומי בגרעיני המעיים של תאים המראים כתם חיובי של נגיף Orsay FISH בציטופלסמה.

מספר בעלי חיים המוכתמים ב-ORSAY ספציפי או ב-N.parisii-specific FISH מוצגים כמצביעים על עוצמת האות הזה לכימות קל. זיהום משותף של C.elegans עם שני טפילי מיקרוספורידיה באמצעות בדיקות ספציפיות למין המתחרות על קשירת 18S, השימוש ב- DAPI כדי להכתים גרעינים מאפשר לוקליזציה טובה יותר של הזיהום בהקשר של החיה כולה, במיוחד עבור המעי שיש לו גרעינים גדולים וקלים לזיהוי. זיהומים עם N.parisii לגרום להתפתחות של meronts לתוך נבגים.

צביעת ה-FISH המתקבלת מדגימה מבנים קטנים וגדולים בצורת מוט שככל הנראה תואמים לנבגי N.parisii, המוכתמים בגששים ספציפיים ל-N.parisii באדום. בעת בחירת הסוכן המתקן, זכור כי קיבוע PFA מאפשר שימור טוב יותר של מורפולוגיה ו- GFP מהונדס, אך קיבוע אצטון נחוץ להדמיה של ספורופלסמות. ניתן להשתמש ב-RNA FISH כדי לזהות ולדמיין חיידקים המאכלסים את מעי ה-C.elegans.

לאחר מכן, חוקרים יכולים לבצע יותר בדיקות גנטיות כדי לזהות גורמים המעורבים באינטראקציות האלה בין החיידקים המארחים.