בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

פרוטוקול זה מספק דרך אפשרית לבודד ולאסוף את השלפוחיות החוץ-תאיות הנכונות מרוב הדם והרקמות המוצקות, במיוחד לנתח את מקורן ואת תכולת החלבון, מה שמסייע בהמשך ניסויים פונקציונליים. מלבד תפוקה גבוהה וזיהום נמוך, היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא ניתוח של אנטיגנים פני השטח ומטעני חלבון של כלי רכב חשמליים, אשר שימושי עבור מחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים. זה מקל על אבחון של סרטן של מחלות, כגון מחלות דלקתיות אוסטאופורוזיס באמצעות זיהוי של סמנים פני השטח של תאים ההורים של שלפוחיות חוץ תאיות עם ציטומטר זרימה.

כמות השלפוחית החוץ תאית של הרקמה היא קריטית לניסויים הבאים. יש לוודא כי ריכוז השלפוחית החוץ תאית אינו גבוה. היו סבלניים לבצע את הדילול.

כדי להתחיל, להכין את דגימות עצם מקסילרי על ידי בידוד העצם המקסילרית עם פינצטה אופתלמית מספריים ולשטוף אותם עם PBS להיפטר רקמות רכות עם פינצטה. ואז לשים את העצם המקסילרית לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לחתוך את העצם לחתיכות קטנות של קוטר מילימטר אחד עם מספריים. מוסיפים כמות מסוימת של ליבראז כדי לכסות את הרקמה ולדגור במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 800 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להעביר את supernatant עם פיפטה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש ונקי. לאחר צנטריפוגה של דגימות הפלזמה והעצם שהוכנו במשך 15 דקות ב -2, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים גדולים וטסיות שנותרו, העבירו בזהירות את הסופרנאטנטים לצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר חדשים ונקיים וצנטריפוגות ב -16, 800 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם מיליליטר אחד של PBS.

לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנאטנט כפי שהודגם קודם לכן, שוב, יש להשהות מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 50 מיקרוליטר PBS ולאחסן דגימות אלה בארבע מעלות צלזיוס למשך פחות מ-24 שעות או עדיף להשתמש בהן מיד לצורך הניתוחים. השהה מחדש דגימות עם 500 מיקרוליטר PBS והעבר 50 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה חדש ונקי של 1.5 מיליליטר כבקרה ריקה המסומנת כצינור A ועוד 50 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה נקי אחר של 1.5 מיליליטר כצינור צביעה פשוט עבור FITC, המסומן כצינור B.הוסף 0.5 מיקרוליטר של צבע ממברנה לצינור הראשי לצביעת קרום תוך דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה הצינור הראשי במשך 30 דקות ב 16, 800 G והשלכת supernatant, להשעות מחדש את הכדורים עם 200 מיקרוליטר של PBS.

חלק כל דגימה של 50 מיקרוליטר לארבע צינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר עבור צינורות צביעה פשוטים עבור PE המסומנים כצינור C, צביעת סמן פני השטח המסומנת כצינור D, ובקרות נוגדנים משניות בלבד המסומנות כצינור E.הוסף את הנוגדן העיקרי של דגימות קולטן הקשורות לאוסטאוקלסט ושלפוחית חוץ-תאית עצם, כמו גם דגימות נוגדנים CD-18 ושלפוחית פלזמה חוץ-תאיות לצינור B ולצינור D בנפרד, דגירה במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגו את הצינורות והשליכו את הסופרנאטנט כפי שהודגם קודם לכן והשעו מחדש את הכדוריות עם 500 מיקרוליטר PBS. שוב, צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 16, 800 G וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הנוגדנים הראשוניים הנוספים.

לאחר השלכת הסופרנאטנט יש להשהות מחדש את הכדוריות עם 50 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משניים מצומדים של FITC בהתאמה בצינור E.לדגור על כל הצינורות למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך. יש לדלל טיפה אחת של 0.2, 0.5 ותרחיף חרוזים בגודל מיקרומטר אחד בהתאמה למיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן הפעל כל גודל של חרוזים כדי לוודא את השער שנבחר עבור שלפוחיות חוץ-תאיות וקבע את סף ציטומטר הזרימה כדי לחפש את אוכלוסיית החרוזים והשלפוחיות החוץ תאיות באמצעות פיזור פנימי קדמי מתאים.

הגדר את המצב הסופי כחישוב 100, 000 חלקיקים צבועים בממברנה ונתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה כמתואר בכתב היד. מרחפים מחדש את הכדוריות ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA-ליזה ודגרים במשך 30 דקות על קרח. כדי לכמת את ריכוזי החלבונים של כל הדגימות במיקרו-צלחת של 96 בארות על ידי בדיקת חלבון BCA, דללו את שני המיליגרם למיליליטר של BSA עם 0.9% של מלוחים רגילים ל-0.5 מיליגרם למיליליטר.

ב 0.5 מיליגרם למיליליטר של BSA ו 0.9% של מלוחים רגילים לתוך שלוש בארות משוכפלות עם נפחים מסוימים. לאחר מכן זרוק שני מיקרוליטרים של הדגימות והוסף 18 מיקרוליטר של מלוחים רגילים לשלוש בארות משוכפלות בנפרד. לאחר הכנת פתרון עבודה על ידי ערבוב מגיב BCA A עם מגיב B, להוסיף 200 מיקרוליטר של פתרון העבודה לכל באר ולנער בעדינות במשך 30 שניות.

לאחר מכן דגרו על המיקרו-צלחת של 96 בארות במשך 20 עד 25 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ומדדו את הצפיפות האופטית ב-596 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר. לאחר מכן, לייצא את הנתונים, לצייר עקומה סטנדרטית, ולחשב את ריכוז החלבון של הדגימות. על פי התוצאות, יש לדלל את הדגימות למיקרוגרם אחד למיקרוליטר עם 0.9% מי מלח רגילים וריכוז גבוה פי חמישה ממאגר הטעינה SDS-PAGE ולאטום את הצינורות בסרט בחוזקה ובחום של חמש דקות ב-100 מעלות צלזיוס.

העמיסו את הדגימות בסולם החלבונים לריכוז מדורג של ארבעה עד 20% ג'ל התריס של HEPy. הפעל את הג'ל במאגר הריצה במתח של 80 וולט עד שהחלבונים יוצרים קו. לאחר מכן עברו ל-120 וולט למשך שעה עד שצבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.

מעבירים את הג'ל לקרום הפוליווינילידן פלואוריד המודגר מראש באלכוהול מתיל למשך 20 שניות באמצעות מערכת העברה רטובה להעברה למשך שעה ב-200 מיליאמפר. הכינו חיץ חוסם של 5% BSA על ידי הוספת 2.5 גרם BSA ו-50 מיליליטר TBST לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. חוסמים את הקרומים בחיץ זה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה.

לדגור על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים המדוללים ב-TBST לריכוז תקין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את הממברנות בחיץ הכביסה ארבע פעמים ולדגור את הממברנות עם נוגדנים משניים מתאימים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לאחר שטיפת הממברנות במאגר הכביסה ארבע פעמים, דמיינו את הממברנות באמצעות ערכת כימילומינסנציה במערכת הדמיה בג'ל.

מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים גילו כי המאפיינים המורפולוגיים האופייניים של שלפוחיות חוץ-תאיות היו עגולים ובצורת גביע בקוטר שנע בין 500 ל-300 ננומטר. ניתוח ציטומטריית זרימה מראה את האחוזים של סמני קרום ספציפיים המבוטאים על שלפוחיות חוץ-תאיות המרמזות על מקורם מתאי האב. ניתוח כתמים מערביים מראה את הביטוי של PGD ו- PKM2 בהתאמה כנציג של תכולת חלבונים ובועיות חוץ-תאיות בפלזמה ובועיות חוץ-תאיות עצם, מה שמצביע על המצב המטבולי.

ביטוי שלילי של Golgin-84 בשלפוחיות חוץ-תאיות זוהה עם נוכחות של מיטופילין, אלפא-אקטינין-4, Flotillin-1, Caveolin-1 ובטא-אקטין יחד עם סמן שלפוחיות CD9, בעוד ביטוי CD81 נמוך או נעדר עם חוסר קיום APO-A-1 בשלפוחיות החוץ תאיות פלזמה. חוקרים, אז תוך התחשבות כי שלב 2.2, הכנה ועיכול של דגימות רקמה צריך להיעשות מספיק. אחרת, מספר שלפוחיות חוץ-תאיות המופקות מהרקמות מוגבל.

ניתן להזריק את הסמן המסומן ככתם פלואורסצנטי של השלפוחיות החוץ תאיות לתוך הפה כדי לטפל בשלב הקשור לתפקוד פוטנציאלי.