חקירת מניעים של אנטי-פרסורה בהתנהגות התמכרות באמצעות שיטות ביטוי גנים חד-תאיות ספציפיות אנטומית
4 באוגוסט 2022
השילוב של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר ו-RT-qPCR מיקרופלואידי מספק ספציפיות אנטומית וביוטכנית במדידת השעתוק בתאי עצב בודדים ובגליה. יישום שיטות יצירתיות עם הגישה הביולוגית של המערכת למחלות פסיכיאטריות עשוי להוביל לפריצות דרך בהבנה ובטיפול כגון השערת נוגד התגמול של דלקת עצבית בהתמכרות.
הפרוטוקול רגיש מאוד ומאפשר לכידת תפוקה גבוהה של פרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד. הטכניקה מספקת ספציפיות מרחבית ומולקולרית אנטומית ברזולוציה של תא בודד. לאחר קצירת המוח, בחירת התאים הבודדים והכנת ה-mRNA, מזריקים נוזל קו בקרה לתוך שבב ה-qPCR לצורך הקדמה.
הכנס את שבב ה- qPCR להתקן הערבוב המיקרופלואידי. בחר את סקריפט Prime והפעל את התוכנית. לאחר השלמת התוכנית, הסר את שבב ה- qPCR הראשוני ופיפט שישה מיקרוליטרים של התגובה מצלחת הדגימה של ה- PCR לתוך הדגימה המתאימה היטב בשבב qPCR המוכנה.
כעת, פיפטה שישה מיקרוליטרים של התגובה מצלחת בדיקת ה- PCR לתוך הבדיקה המתאימה היטב בשבב qPCR המוכנה. לאחר מכן הכנס את השבב למכשיר הערבוב המיקרופלואידי. בחר את הסקריפט Load Mix והפעל את התוכנית.
הפעל את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וחמם את הנורה. הסר את שבב ה- qPCR ממכשיר הערבוב המיקרופלואידי וקלף את מדבקת המגן מתחתית השבב. פתח את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וטען את שבב ה- qPCR לפלטפורמה.
הפעל את תוכנת איסוף הנתונים על ידי לחיצה על התחל הפעלה חדשה. אמת את ברקוד השבב ואת סוג השבב. לאחר מכן לחץ על הבא.
בחר את קובץ הפעלת השבב ועיין במיקום הקובץ עבור אחסון איסוף הנתונים. לאחר מכן לחץ על סוג יישום ובחר ביטוי גנים. בחר ROX עבור הפניה פסיבית, בדיקה בודדת, ו- EVAGreen עבור סוג בדיקה.
לחץ כדי לבחור את תוכנית המחזור התרמי ובחר Biomark HD GE: מהיר 96x96 PCR + Melt v2. קובץ PCL. הורד את תוכנת ניתוח הנתונים.
הפעל את התוכנה כדי לנתח את הניסוי המיקרופלואידי RT-qPCR. לחץ על הפעלת שבבים ופתח את ChipRun. קובץ BML שנוצר על ידי הנסיין.
חלון המציג את פרטי הניסוי כולל הפניה פסיבית, בדיקה ותוכנית תרמית PCR יופיע. תחת הכרטיסיה סייר השבבים, לחץ על הגדרת צלחת לדוגמה וצור תבנית לוח לדוגמה חדשה. העתק והדבק את התוויות לדוגמה בגיליון האלקטרוני של התוכנה בהתאם לתכנון הניסוי.
הזן את שם הדגימה ואת ריכוז הרנ"א המשמש לדגימות הסטנדרטיות. כעת, מפה את הדוגמה שהוגדרה על-ידי לחיצה על מפה מתפריט המשימה ובחירה ב- SBS96-Left.dsp. לאחר מכן, בחר תצוגות פירוט כדי לעדכן שינויים אלה בקובץ ולחץ על נתח.
בחר הגדרת לוח גלאי וצור לוח בדיקה חדש. בחר את סוג הגורם המכיל והתבנית המתאימים. הדבק את שמות הבדיקה לפי תכנון הניסוי ולחץ על נתח.
בחלונית הגדרות ניתוח, לחץ על המשתמש והגדר את ההתאמה לאוטומטית. כעת, סקור ידנית כל תגובה בשבב 96x96. דמיינו את עקומות ההגברה וההתכה כדי לקבוע אם כל תגובה תואמת את תבנית ה-qPCR הצפויה.
אם עקומת ההגברה או ההיתוך אינה תואמת את הצפוי, נכשלו בתגובה זו. לאחר QC, ייצא את הנתונים על-ידי בחירת קובץ, לחיצה על ייצוא ושמירת ערכת הנתונים כקובץ csv. מכיוון שקובץ ה- csv המיוצא כולל גם מטריצת כשל של של מעבר וגם מטריצה עם ערכי CT גולמיים, השתמש במטריצת הכשל של כדי להחליף תאים שנכשלו בערכת הנתונים ב- NA. הורד את הגרסה האחרונה של תוכנת קוד פתוח R ולאחר מכן הורד את היישום R Studio.
עבור מרכוז חציוני, השתמש בתוכנה R כדי לחשב את ערך ה- CT החציוני המחושב מכל ערכי ה- CT עבור מדגם בודד ולאחר מכן הפחת את כל ערכי ה- CT הבודדים מערך חציוני זה כדי לקבל ערך CT דלתא מינוס. לנורמליזציה של גנים ביתיים, חשב את הביטוי הממוצע של הגנים של משק הבית עבור כל דגימה והשתמש בערך זה כדי להפחית את ערכי ה- CT הבודדים. כדי ליצור ערך דלתא CT של מינוס דלתא, הפעל את הקוד בתוכנת R.
העלה את ערכת הנתונים המנורמלת ל- R ונתח את הנתונים באמצעות פונקציית קנה המידה, צור את הנתונים שקנה המידה שלהם השתנה ולאחר מכן השתמש בפונקציית מפת החום R או בתוכנה נפרדת כדי ליצור מפת חום. כדי לארגן את ערכת הנתונים עבור פונקציונליות אחרת, חשב את המתאמים של פירסון בין כל גן ולאחר מכן את פונקציית ההמסה. ייצא והעלה נתונים אלה לתוכנת רשת מתאם גנים.
תאי עצב הראו ביטוי מוגבר של NeuN ודגימות מיקרוגליאליות הראו ביטוי משמעותי של הסמנים המיקרוגליאליים Cd34 ו-Cx3xr1. דגימות Th+neuronal הדגימו ביטוי מוגבר באופן משמעותי של Th בהשוואה לדגימות תאי עצב ומיקרוגליה. תאי העצב של Th-הציגו ביטוי משמעותי של Gcg, מה שמרמז על כך שדגימות תאי עצב מועשרות בתאי עצב המשתמשים ב-Glp1 כמוליך עצבי.
ניתוח הבחנה ליניארית הראה שלשלושת סוגי התאים האלה היו פרופילי ביטוי גנים שונים בכל 65 הגנים. תת-פנוטיפים תאיים של דגימות נוירונים מועשרות Glp1 באמצעות סדרת זמן גמילה מאלכוהול היו מיוצגים באמצעות מפות חום. תת-הפנוטיפ A, המבטא מאוד את אשכול הגנים הדלקתיים 1, עולה ביחס בנקודת הזמן של שמונה שעות הגמילה ומגיע למקסימום של נסיגה של 32 שעות.
תת פנוטיפ דלקתי מנורמל לשלוט על ידי נסיגה של 176 שעות. תת-פנוטיפ B, המבטא מאוד את אשכול הגנים של קולטן GABA 2, מדגים דיכוי כולל בביטוי של אשכול גנים זה על ידי מצב נסיגה של 176 שעות. ביטוי הגנים של דגימות בודדות שולב בממוצעים, כך שניתן היה להמחיש את הביטוי של אשכולות גנים ואת מיקום החלבון של אותו תעתיק גן לאורך כל סדרת הזמן.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת ביולוגית או רקמה כדי להבין את התגובה התאית למחלה או להפרעה. כלומר לפענח את התגובה המולקולרית ברזולוציה של תא בודד המתייחסת לארכיטקטורה המרחבית והאנטומית של הרקמה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה רותם מיקרו-דיסקציה בשביעת לייזר (laser capture microdissection) ו-RT-qPCR מיקרופלואידי כדי לנתח טרנסקריפטומים בנוירונים ובתאי גלייה בודדים. המחקר מדגיש את הרגישות והספציפיות הגבוהות של השיטה, אשר עשויות לקדם את הבנתנו לגבי מחלות פסיכיאטריות הקשורות לדלקת עצבית (neuroinflammation), במיוחד בהקשר של התמכרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח (Neuroscience)
- ניתוח שעתוקי (Transcriptional Analysis)
- הפרעות פסיכיאטריות
רקע
- הבנת דפוסי ביטוי RNA בנוירונים ובתאי גליה היא קריטית להבנת מחלות פסיכיאטריות.
- שיטות קודמות היו חסרות הן ספציפיות מרחבית-אנטומית והן ספציפיות מולקולרית.
- נוירו-דלקת קשורה להיפוטזת ה-antireward של התמכרות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה רגישה ללכידת פרופילים של ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד.
- ניתוח האופן שבו שינויים מולקולריים אלו קשורים לתגובות התנהגותיות במצבים פסיכיאטריים.
- הערכת תפקידה של נוירו-דלקת במנגנונים הקשורים להתמכרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש ב-RT-qPCR מיקרופלואידי, אשר אפשר איסוף נתונים בתפוקה גבוהה מתאים בודדים.
- תאים בודדים בודדו מרקמת מוח לאחר הקצירה לצורך הכנת mRNA וניתוחו.
- יושמו פרוטוקולים מפורטים להרצת השבב (priming), איסוף נתונים וניתוחם.
- נתוני ביטוי גנים תוקפו ונותחו באמצעות תוכנה סטטיסטית.
תוצאות עיקריות
- נוירונים הראו ביטוי מוגבר של NeuN, בעוד שמיקרוגליה הראו ביטוי משמעותי של Cd34 ו-Cx3xr1.
- סוגים שונים (subtypes) זוהו על בסיס פרופילי ביטוי גנים, בייחוד בתגובה לגמילה ולנוירו-דלקת.
- מסקנות מרכזיות בנוגע לצבירי גנים והבקרתם במהלך דחק של גמילה הופקו מניתוחי מפות חום (heat map).
מסקנות
- המחקר מדגים כי שילוב של מתודולוגיות אלו מאפשר הבנה מעמיקה יותר של תגובות ספציפיות לסוגי תאים לדלקת נוירוגנית.
- התובנות שהושגו עשויות לסייע בפיתוח גישות טיפוליות ממוקדות להפרעות פסיכיאטריות הכוללות התמכרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיל ביטוי גנים ברמה של תא בודד עם ספציפיות אנטומית מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית בגילוי מטרות נוירופסיכיאטריות, במיוחד עבור מסלולי התמכרות ומסלולי antireward. גישה זו מספקת תובנה ברזולוציה גבוהה לגבי מניעים נוירו-דלקתיים, התומכת באמון חיזוי בנקודת המפגש בין פתולוגיה מולקולרית לפנוטיפים התנהגותיים. שילוב שיטות אלו בצינורות גילוי מוקדמים משפר את תעדוף הפורטפוליו ואת הרציפות התרגומית עבור פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות הנוירו-דלקתיות והאנטי-תגמול ברזולוציית תא בודד.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור ביטוי גנים לספציפיות אנטומית ופנוטיפית.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטית עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) המעורבות בהתמכרות ובגמילה.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות נוירו-פסיכיאטריות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות תאיים שעברו תיקוף לצורך סריקה פנוטיפית וטרנסקריפטומית בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של ביטוי גנים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה של רשתות גנים בסוגי תאים מוגדרים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על מסלולים נוירו-דלקתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם ממצאים מולקולריים עם מערכות נוירו-אנטומיות רלוונטיות למחלה במודלים של התמכרות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של סמנים ביולוגיים לנוירו-דלקת.
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון בנוגע לקידום תוכניות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- משפר את פיתוח הסמנים הביולוגיים התרגומיים על ידי מיפוי ביטוי גנים לפנוטיפים של תסמונת גמילה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח ביטוי גנים בתפוקה גבוהה ובדיוק אנטומי ברקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור מנגנוני נוירו-דלקת ואנטי-גמול (antireward).
- סריקה: מספק נתונים כמותיים הניתנים לשחזור של ביטוי גנים לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מערכי נתונים ניתנים להרחבה לצורך ניתוח רשתות, מיפוי חום (heat mapping) והשוואה סטטיסטית של פנוטיפים תאיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין חתימות מולקולריות למצבי גמילה רלוונטיים למחלה ולתיאום של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה רב-פעמית לטרנסקריפטומיקה של תא בודד במגוון מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור עבור ביטוי גנים ברמת התא הבודד.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול יעיל של הון בתיק הפיתוח של מחקר ופיתוח בתחום הנוירו-פסיכיאטריה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים לטיפולים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (laser capture microdissection) ובפלטפורמות מיקרופלואידיות של RT-qPCR.
- דורש תשתית אנליטית חזקה לעיבוד נתונים בתפוקה גבוהה ולניתוח רשתות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות ונורמליזציה של נתונים.
- ניתן להתאמה לרקמות שונות של ה-CNS ולמודלים של מחלות באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- תלוי בגישה למיכשור ייעודי ולתמיכה בביואינפורמטיקה.
