הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

בעידן האימונותרפיה של הסרטן, העניין בהבהרת הדינמיקה של מיקרו-סביבה של הגידול גדל באופן בולט. פרוטוקול זה מפרט טכניקת הדמיה של ספקטרומטריית מסה ביחס לשלבי הצביעה וההדמיה שלה, המאפשרים אנליזה מרחבית מרובבת מאוד.

פרוטוקולים אלה מאפשרים כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים וניתוח מיוחד באמצעות דגימות רקמה קפואה קבועה פורמלין ומשובצת פרפין כדי להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון בסרטן. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר אפיון בו זמנית של סמן 40 על קטע רקמה בודד, באופן נרחב לשמר את מבנה הרקמה בדגימות. השלב הקריטי הוא אופטימיזציה ואימות של נוגדנים.

אי השלמת השלב, עלולה לגרום לתמונות באיכות נמוכה שעלולות לפגוע בשמירה על נתונים ותוצאות הניתנים לשחזור באיכות גבוהה. התחל על ידי סיבוב כל הנוגדנים המכילים צינורות ב 10, 000 x G במשך חמש דקות, להוסיף נוגדנים בודדים למאגר החוסם ומערבבים היטב. אין להפריע לתחתית צינור הנוגדנים בעת ניקופו.

סנן את לוח הנוגדנים על ידי הרטבה מראש של מכשיר מסנן צנטריפוגלי בגודל 0.1 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטרים של מאגר חוסם. סובב את המסנן ב 10, 000 x G במשך שתי דקות ולהסיר את זרימת המאגר החוסם דרך עם פיפטה. לאחר מכן העבר את לוח הנוגדנים לעמודת ספין וסובב את המסנן ב 10, 000 x G למשך שתי דקות.

השליכו את עמודת הסיבוב והשתמשו בזרימה כחלונית הנוגדנים המסוננת. לצביעת הנוגדנים, הסר את המאגר החוסם מהשקופיות על ידי הטיית כל שקופית על צדה והקשה עדינה על הקצוות כנגד מגב משימה. מניחים את השקופיות בתא לחות ומוסיפים 100 עד 200 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר נוגדנים לרקמה.

הוסיפו שקופיות בקרה חיוביות ושליליות לאצווה המכתימה ודגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להגדיר את המכשיר, היכנס לתוכנת הבקרה ולחץ על Wake Up, אם המכשיר נמצא במצב שינה. לחץ על דוגמה של Exchange כדי לטעון שקופית ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לפתוח את הדלת.

הנח את השקופית בחריץ הטעינה כאשר דוגמה פונה כלפי מעלה והתווית בצד ימין, לחץ על המשך כדי לסגור את הדלת. בחר את הפרוייקט ולאחר מכן בחר את שם השקופית עבור הדוגמה שנטענה. דמיין את התמונה הפנורמית בחלונית התמונה האופטית של השקופית עבור שדה הראייה או בחירת FOV, לחץ על תפריט מצב ובחר גלאי אלקטרונים משני, ולאחר מכן לחץ על תפריט מצב הדמיה ובחר QC 300 מיקרומטר.

לחץ על Jog Stage כדי לשלוט במיקום FOV ולאחר מכן לחץ על החצים כדי לנווט ולבחור את המיקום של ה- FOV. לחץ על הוסף FOV, הגדר 400 מיקרומטר על 400 מיקרומטר כגודל השדה ובחר פיין כמצב הדמיה ואלפית השנייה של זמן השהייה, לחץ על אישור. לאחר יצירת רשימת FOV, המשך למיקוד התמונה והתאם את הסטיגמה על ידי הזזת הקרן לאזור רקמה שלא יהיה בתמונה.

התאם את הפרמטרים עד לקבלת תמונה מרכזית ברורה, לחץ על התחל הפעלה. התמונות שנרכשו יועלו ויאוחסנו באופן אוטומטי ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט. המטריצה המוצגת כאן מתארת את אחוז ההצלבה הנגזר מטוהר הבדיקה והתחמוצות.

כאן תיבות כחולות מציינות יותר או שוות ל- 0.5% crosstalk ותיבות שקופות מציינות פחות מ- 0.5% crosstalk. עבור תגי Mass, בדיקות שתרמו לפחות 0.5% crosstalk ללא ערוצים, ערוץ אחד או שניים, או יותר משני ערוצים מוצגים כאן. כמו כן מוצגים ערוצים המוניים המקבלים לפחות 0.5% הצלבה ללא גשושיות, גשושית אחת או שתיים, או יותר משתי גשושיות.

תמונות הכתמים המייצגות ברקמות שונות כמו אדנוקרצינומה של הריאות, כליות לא ניאופלסטיות ושקדים מתוארות כאן. כאן מוצגת תמונה של מקטע רקמת שקדים המוכתם בטכניקה זו וממחישה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי לפני סינון ותיקון. התמונה של אותו מקטע באותם תנאים לאחר שלבי סינון ותיקון מוצגת כאן.

שיטה זו מייצרת תמונות שניתן להעלות לתוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי, ומאפשרת ניתוח מקיף כגון מידור רקמות, סגמנטציה של תאים, ביטוי משותף של סמן, כמו גם ניתוח שכנים וניתוח מרוחק. שיטות הדמיה מולטיפלקס מאוד זמינות באמצעות מחקר. על ידי בניית פאנלים שונים, חוקרים יכולים לחקור דגימות סרטן, נורמליות, פאראנופלסטיות, דלקתיות ומדבקות.