הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין
June 29th, 2022
בעידן האימונותרפיה של הסרטן, העניין בהבהרת הדינמיקה של מיקרו-סביבה של הגידול גדל באופן בולט. פרוטוקול זה מפרט טכניקת הדמיה של ספקטרומטריית מסה ביחס לשלבי הצביעה וההדמיה שלה, המאפשרים אנליזה מרחבית מרובבת מאוד.
פרוטוקולים אלה מאפשרים כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים וניתוח מיוחד באמצעות דגימות רקמה קפואה קבועה פורמלין ומשובצת פרפין כדי להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון בסרטן. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר אפיון בו זמנית של סמן 40 על קטע רקמה בודד, באופן נרחב לשמר את מבנה הרקמה בדגימות. השלב הקריטי הוא אופטימיזציה ואימות של נוגדנים.
אי השלמת השלב, עלולה לגרום לתמונות באיכות נמוכה שעלולות לפגוע בשמירה על נתונים ותוצאות הניתנים לשחזור באיכות גבוהה. התחל על ידי סיבוב כל הנוגדנים המכילים צינורות ב 10, 000 x G במשך חמש דקות, להוסיף נוגדנים בודדים למאגר החוסם ומערבבים היטב. אין להפריע לתחתית צינור הנוגדנים בעת ניקופו.
סנן את לוח הנוגדנים על ידי הרטבה מראש של מכשיר מסנן צנטריפוגלי בגודל 0.1 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטרים של מאגר חוסם. סובב את המסנן ב 10, 000 x G במשך שתי דקות ולהסיר את זרימת המאגר החוסם דרך עם פיפטה. לאחר מכן העבר את לוח הנוגדנים לעמודת ספין וסובב את המסנן ב 10, 000 x G למשך שתי דקות.
השליכו את עמודת הסיבוב והשתמשו בזרימה כחלונית הנוגדנים המסוננת. לצביעת הנוגדנים, הסר את המאגר החוסם מהשקופיות על ידי הטיית כל שקופית על צדה והקשה עדינה על הקצוות כנגד מגב משימה. מניחים את השקופיות בתא לחות ומוסיפים 100 עד 200 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר נוגדנים לרקמה.
הוסיפו שקופיות בקרה חיוביות ושליליות לאצווה המכתימה ודגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להגדיר את המכשיר, היכנס לתוכנת הבקרה ולחץ על Wake Up, אם המכשיר נמצא במצב שינה. לחץ על דוגמה של Exchange כדי לטעון שקופית ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לפתוח את הדלת.
הנח את השקופית בחריץ הטעינה כאשר דוגמה פונה כלפי מעלה והתווית בצד ימין, לחץ על המשך כדי לסגור את הדלת. בחר את הפרוייקט ולאחר מכן בחר את שם השקופית עבור הדוגמה שנטענה. דמיין את התמונה הפנורמית בחלונית התמונה האופטית של השקופית עבור שדה הראייה או בחירת FOV, לחץ על תפריט מצב ובחר גלאי אלקטרונים משני, ולאחר מכן לחץ על תפריט מצב הדמיה ובחר QC 300 מיקרומטר.
לחץ על Jog Stage כדי לשלוט במיקום FOV ולאחר מכן לחץ על החצים כדי לנווט ולבחור את המיקום של ה- FOV. לחץ על הוסף FOV, הגדר 400 מיקרומטר על 400 מיקרומטר כגודל השדה ובחר פיין כמצב הדמיה ואלפית השנייה של זמן השהייה, לחץ על אישור. לאחר יצירת רשימת FOV, המשך למיקוד התמונה והתאם את הסטיגמה על ידי הזזת הקרן לאזור רקמה שלא יהיה בתמונה.
התאם את הפרמטרים עד לקבלת תמונה מרכזית ברורה, לחץ על התחל הפעלה. התמונות שנרכשו יועלו ויאוחסנו באופן אוטומטי ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט. המטריצה המוצגת כאן מתארת את אחוז ההצלבה הנגזר מטוהר הבדיקה והתחמוצות.
כאן תיבות כחולות מציינות יותר או שוות ל- 0.5% crosstalk ותיבות שקופות מציינות פחות מ- 0.5% crosstalk. עבור תגי Mass, בדיקות שתרמו לפחות 0.5% crosstalk ללא ערוצים, ערוץ אחד או שניים, או יותר משני ערוצים מוצגים כאן. כמו כן מוצגים ערוצים המוניים המקבלים לפחות 0.5% הצלבה ללא גשושיות, גשושית אחת או שתיים, או יותר משתי גשושיות.
תמונות הכתמים המייצגות ברקמות שונות כמו אדנוקרצינומה של הריאות, כליות לא ניאופלסטיות ושקדים מתוארות כאן. כאן מוצגת תמונה של מקטע רקמת שקדים המוכתם בטכניקה זו וממחישה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי לפני סינון ותיקון. התמונה של אותו מקטע באותם תנאים לאחר שלבי סינון ותיקון מוצגת כאן.
שיטה זו מייצרת תמונות שניתן להעלות לתוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי, ומאפשרת ניתוח מקיף כגון מידור רקמות, סגמנטציה של תאים, ביטוי משותף של סמן, כמו גם ניתוח שכנים וניתוח מרוחק. שיטות הדמיה מולטיפלקס מאוד זמינות באמצעות מחקר. על ידי בניית פאנלים שונים, חוקרים יכולים לחקור דגימות סרטן, נורמליות, פאראנופלסטיות, דלקתיות ומדבקות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה באמצעות ספקטרומטריית מסה לניתוח דינמיקה של מיקרו-סביבת הגידול בסרטן, בהקשר של טיפול חיסוני בסרטן. הוא מדגיש את החשיבות של אופטימיזציה של נוגדנים לצורך השגת הדמיה באיכות גבוהה ונתונים ניתנים לשחזור.
רכיבים מרכזיים של המחקר
תחום מדעי
- טיפול חיסוני בסרטן
- מיקרו-סביבת הגידול
- הדמיה באמצעות ספקטרומטריית מסה
רקע
- העניין בדינמיקה של מיקרו-סביבת הגידול גבר עם עליית טיפול חיסוני בסרטן.
- הבנת תפקידי תאי מערכת החיסון בסרטן היא קריטית להתקדמות טיפולית.
- הדמיה באמצעות ספקטרומטריית מסה מאפשרת ניתוח מרחבי מפורט של דגימות רקמה.
- ניתן להשתמש בדגימות רקמה שנשמרו בפורמלין והוכנסו לתוך פרפין, כמו גם בדגימות רקמה קפואות.
מטרת המחקר
- לאפשר כימות ברזולוציה של תא בודד וניתוח שיתוף פעולה של סמנים.
- להקל על האפיון הסימולטני של מספר סמנים על אותו פרוס צלחת רקמה.
- לשמר את מבנה הרקמה תוך מתן הדמיה באיכות גבוהה.
שיטות בשימוש
- אופטימיזציה ואימות של נוגדנים הם שלבים קריטיים.
- נוגדנים מעורבבים עם חיץ חסימה לאחר צנטריפוגה.
- יש להיזהר לא להפריע לתחתית צינור הנוגדנים במהלך הפיפטה.
- טכניקות הדמיה באמצעות ספקטרומטריית מסה מיושמות לניתוח.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת את האפיון של עד 40 סמנים בו-זמנית.
- תמונות באיכות גבוהה חיוניות לנתונים ניתנים לשחזור.
- הכנה נכונה של נוגדנים משפיעה באופן משמעותי על איכות התוצאות.
- ניתוח מרחבי מספק תובנות לגבי מיקרו-סביבת הגידול.
מסקנות
- הדמיה באמצעות ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למחקר סרטני.
- פרוטוקולים מותאמים משפרים את איכות ההדמיה ואת יכולת השחזור של הנתונים.
- הבנת דינמיקת תאי מערכת החיסון יכולה להוביל לטיפולים משופרים בסרטן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Multiplexed mass spectrometry imaging of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues enables high-plex spatial profiling of the tumor microenvironment, addressing a critical need in immuno-oncology discovery. This approach supports single-cell resolution and simultaneous quantification of up to 40 markers, providing predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking. Integrating spatial and phenotypic data at this scale informs early portfolio triage and translational continuity in cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell roles and spatial relationships within tumor tissues.
- Supports functional target validation by quantifying marker co-expression at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking through comprehensive immune landscape mapping.
- Provides predictive confidence for prioritizing immuno-oncology targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, multiplexed antibody panels for robust tissue-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative outputs through standardized antibody optimization and validation.
- Prepares high-content imaging systems for scalable screening of tissue samples.
- Enables reliable evaluation of compound effects on immune cell phenotypes in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker analysis with disease-relevant tissue models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving tissue architecture.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive immune profiling.
- Facilitates translational biomarker discovery for immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling high-plex, spatially resolved immune profiling in preserved tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping immune cell distributions and interactions.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through validated multiplexed antibody panels.
- Analytics: Generates quantitative, spatially resolved data for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models via preserved tissue architecture and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for diverse oncology and immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immuno-oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design, optimization, and validation for high-plex imaging.
- Demands access to secondary ion mass spectrometry imaging instrumentation and gold-coated slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and data processing protocols.
- Adaptation across tissue types and disease models may require panel re-optimization.
- Current limitations include reliance on third-party computational pathology software for advanced image analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Antibody Panel Preparation and Antibody Staining
2:35
Image Acquisition
4:31
Results: Isotopic Purity and Channel Cross-Talk, Staining Images in Different Tissues, and Images of the Staining Before and After Image Preparation
5:59
Conclusion
