אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

אפיון מעמיק של כלי רכב חשמליים יכול להיות מאתגר, ולדרוש מספר מכשירים לתיאור פרמטרים בודדים. מדידת הקריטריונים המרכזיים האלה בטכניקה אחת כמו ציטומטריה של ננו-זרימה מתארת תת-אוכלוסיות מרובות של כלי רכב חשמליים בו-זמנית. כך שכל EV נמדד בנפרד בזיהוי חלקיקים בקוטר של יותר מ-14 ננומטר ללא תווית לפני קביעת הפלואורסצנטיות שלהם.

זה יוצר מערך נתונים חזק על ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות. ניתן ליישם ציטומטריה של ננו-זרימה על כלי רכב חשמליים ממגוון מקורות, כולל כאלה המועשרים מפלזמה, CSF ומדיום תרבית. טכניקה זו משמשת גם לניתוח של וירוסים, ננו-חלקיקי שומנים וננו-חומרים.

חשוב למטב את פרוטוקול ההתוויה. זה ממקסם כל פלואורסצנציה הקשורה לחלקיק בהשוואה לכל פלואורסצנציה שיורית שנותרה במאגר. כדי להתחיל, הפעל את המכשיר, טען מקצוע ננו-זרימה ובחר הפעל מהתפריט הנפתח Sheath Flow, טען מים לתא הטעינה ובחר הגברת מהתפריט הנפתח Sheath Flow.

דללו את חרוזי ה-QC אחד עד 100 במים מזוקקים בצינור של 0.6 מיקרוליטר, והניחו אותם בתא הטעינה כדי להכניס את הדגימה למערכת. לאחר מכן הגבירו את הדגימה למשך 45 שניות כפי שהודגם קודם לכן כדי להחליף לחלוטין את הדגימה, המים או תמיסת הניקוי הקודמת. תוך כדי האצה, הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש עבור חרוזי QC ל-250 ננומטר FL QC סטנדרטי.

מאוחר יותר, כדי להפחית את לחץ המערכת, בחר את לחץ הדגימה מאותו תפריט נפתח והגדר את לחץ הדגימה האוטומטית לקילו פסקל אחד כדי לשמור על לחץ קבוע. לאחר מכן התחל את הניתוח של דקה אחת על-ידי בחירה באפשרות זמן להקלטה מתוך פקדי הרכישה. הנתונים יתווצרו על מתווה הנקודות המציג סולם יומן עבור עוצמת פיזור צדדית, ועוצמת פלואורסצנטיות נבחרת.

לפני שמירת הקובץ, הוסף את שם הקובץ ואת דילול הדגימה. לאחר מכן, בחר לפרוק כדי להסיר את הצינור ממפרץ הטעינה. החלף את חרוזי ה- QC ב- 150 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי ונקה במשך יותר מ- 30 שניות על-ידי בחירה באפשרות boosting.

באמצעות צינור המכיל 150 מיקרוליטר של מים, להסיר כל תמיסת ניקוי עודף מן הקצה נימי על ידי טבילת הקצה במים. לאחר מכן דיללו את גודל החרוזים הסטנדרטיים אחד עד 100 במים והעמיסו 100 מיקרוליטרים לתא ההעמסה. כעת, הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש, S16 EXO 68 עד 155 ננומטר.

הגדרה זו מיועדת הן לתקן הגודל והן לדגימות המכילות כלי רכב חשמליים הקטנים מ-200 ננומטר. בחר דגימה והמשך להקליט את הדגימה למשך דקה אחת. בצע את המדידה השלישית עם דגימת מים או PBS כדי ליצור פיחות מדידה ריק, המזהה תוצאות חיוביות כוזבות להסרה על ידי התוכנה.

דלל את דגימות ה-EV ללא תווית ב-PBS לטווח ריכוז חלקיקים מתאים של פי 10 עד השמיני עד חמש פעמים 10 עד החלקיקים השמיניים למיליליטר לצורך ניתוח nFCM. ולטעון 10 עד 100 מיקרוליטר של הדגימה המדוללת לתוך תא הטעינה. אם ריכוז החלקיקים אינו ידוע, התחל בדילול של אחד עד 100 של דגימת EV.

ריכוז הדגימה יכול להיות משוער במהירות על ידי גודל נקודת הלייזר במצלמת CCD במהלך ההאצה, או על ידי תצפית על עקבות התפרצות האירוע במהלך הדגימה. לאחר שהדגימה שנטענה מוגברת למשך 45 שניות, הקלט במשך דקה אחת ושמור את הקובץ כפי שהוכח קודם לכן. לאחר ההקלטה, התחל לנתח נתונים אלה, עבור מהכרטיסייה רכישה לכרטיסייה ניתוח ופתיחת קבצי NFA שנשמרו.

למדידת דגימה מדויקת, השתמש בשתי המדידות הסטנדרטיות שבוצעו לפני מדידת הדגימה כדי להגדיר ערכים להשוואת דגימות וכן את הריק. צור את עקומת הגודל הסטנדרטית להמרה של פיזור צד לקוטר על-ידי בחירת הקובץ Standard Size ושימוש בכלי קבע סף. הסף, הנראה לעין בעקבות התפרצות האירוע, מזהה את עוצמת האות המינימלית הנדרשת כדי שאירוע ייחשב למשמעותי.

כאשר הסף מוגדר, בדוק את הפרמטרים של התוויית הנקודות, SS-H או SS-A בציר X ו- FITC-A בציר Y. פתח את הכלי יצירת עקומה רגילה ובחר S16 EXO 68 עד 155 ננומטר כתבנית הגודל. לחצו על Find Peaks כדי לזהות את עוצמות הפיזור הצדדיות של השיא כחלקיקים בקוטר 68, 91, 113 או 155 ננומטר.

לפני סגירת החלון, בדוק אם עקומת הצד המפוזר לקוטר נוצרה עם ערך R קרוב לאחד. קבע את תקן הריכוז. בחר את הקובץ שנשמר, לחץ על תקן ספירה והזן את ריכוז החלקיקים של התקן.

הגדר את המידע הסטנדרטי. בחר את הקובץ לדוגמה EV והגדר את הסף. בחר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות המוטעות להסרה מספירת הדגימות.

לאחר פתיחת כלי יצירת PDF, בדקו את הגודל, הריכוז והדילולים של הדגימה. לאחר מכן הראה את ריכוז המדגם ואת התפלגות הגודל של החלקיקים. לאחר תיוג דגימות EV כמתואר בכתב היד, קח מיקרוליטר אחד של הדגימה המסומנת ודלל אחד עד 50 ב- PBS בצינור של 0.6 מיליליטר.

טען את הדגימה לתא הטעינה והפעל לחץ מגביר למשך 45 שניות. כמו כן, ודא שהגדרות לייזר נכונות והעדשות המתאימות נטענות. כעת, עבור ללחץ דגימה ובחר את זמן ההקלטה.

לאחר הרכישה בדקה אחת, תן שם לקובץ הנתונים ושמור. פרקו את הדגימה, החליפו אותה בתמיסת ניקוי והגבירו את תמיסת הניקוי למשך יותר מ-30 שניות לפני טעינת הדגימה הבאה המסומנת כפי שהודגם קודם לכן. ליצירת PDF, החל את אותם סטנדרטים שהוכחו בעבר.

רק המדידה הריקה תיקבע אחרת. בחר את הקובץ לדוגמה והגדר את הסף. בחרו בכלי סימון והשתמשו בלחיצה השמאלית כדי לצייר קו המפריד בין האוכלוסייה החיובית הפלואורסצנטית.

הגדר את השמות והצבעים לייצוג. הגדר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות המוטעות להסרה מכל אוכלוסייה שונה. פתחו את כלי יצירת PDF וזהו את התפלגות הגודל, הריכוז והאחוזים של תת-האוכלוסייה החיובית הפלואורסצנטית.

במתווה הנקודה, שנה את ציר ה- Y כדי להציג מדידות פלואורסצנטיות מהערוץ הירוק או האדום. קבעו את הריק וצרו מסמך PDF כפי שהוכח קודם לכן. בהתוויית הנקודה, הגדר את ציר ה- X ל- FITC ואת ציר Y ל- APC.

השתמש בכלי הרביע כדי לזהות אוכלוסיות חיוביות פלואורסצנטיות כפולות. קבעו שמות וצבעים שיהיו מייצגים, ולאחר מכן פתחו את קובץ PDF ובחרו בתת-האוכלוסיות הפלואורסצנטיות. כלי רכב חשמליים שמקורם ב-C2C12 הראו כ-50% CD9, 30% CD63 מצגת ו-70% אוכלוסייה הציגו לפחות אחד משלושת סמני ה-EV.

פרופילי הגודל של תת-אוכלוסיות EV בודדות המסומנות בטטרספנין הראו גודל חציוני גדול יותר של כ-75 עד 85 ננומטר ופחות מ-65 ננומטר EVs בהשוואה לאוכלוסיית החלקיקים הכוללת. כלי רכב חשמליים שמקורם ב-SW620 הראו כ-40% CD9, 7% CD63 מצגת ו-42% מהחלקיקים כבעלי לפחות אחד משלושת הסמנים. כלי הרכב החשמליים בעלי התווית של SW620, המסומנים בטטרספנין, הראו התפלגות נורמלית יותר וקוטר חציוני גדול יותר בין 90 ל-110 ננומטר עם התפלגויות דומות בין תת-אוכלוסיות חיוביות של טטרספאנין בודדות.

תיוג ממברנות הראה שוב ושוב 80% חיוביות של כלי רכב חשמליים המופקים מ-C2C12 ו-SW620. עוצמת הפיזור הצדדי מתואמת עם עוצמת FITC על חלקות הנקודות של C2C12 ו- SW620. האחוזים החיוביים הכפולים דומים מאוד לאחוזים החיוביים של הטטרספנין.

ונראה כי תיוג CD63 מראה את המתאם החלש ביותר לתיוג ממברנות. מדדי החיוביות באחוזים היו דומים בין סימון הנוגדנים עם ובלי תיוג נוסף של ממברנה. עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת עבור אוכלוסיות פלואורסצנטיות של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-C2C12 הציעה הצגה נמוכה יותר של CD63 ו-CD81 בהשוואה ל-CD9 EVs, בעוד ש-SW620 הראה כי שימוש בכל שלושת הנוגדנים מספק אות פלואורסצנטי גדול יותר מכל תווית נוגדנים בודדת בפרוטוקול זה, סמני EV נפוצים סומנו באופן פלואורסצנטי, אך ניתן לבחור רבות ממטרות הנוגדנים כדי להראות את מקור EV, את פונקציית EV, או את מצב המחלה.