Name: התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: חקור את יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי לאחר פגיעה מקרינת גמא בעכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי תאי גזע ודינמיקה תאית, ומספקת הבנה עמוקה של תהליכי החלמה לאחר טיפול בסרטן המעי הגס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לליבת המחקר ההיסטולוגיה של מרכז סטוני ברוק לסרטן על סיוע מומחה בהכנת דגימות רקמה ולמחלקה למשאבי חיות מעבדה באוניברסיטת סטוני ברוק על סיוע בטיפול וטיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות DK124342 שהוענקו לאגניישקה ב. ביאלקובסקה ו- DK052230 לד"ר וינסנט ו. יאנג.

למחברים אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. זה מאפשר ניתוח מדויק של השינויים אפיתל המעי במהלך 7 ימים לאחר הפציעה. חשוב לציין כי נקודות הזמן שנבחרו משקפות שלבים מכריעים של פציעה ומאופיינות בשינויים מובהקים במעי (שלבי פציעה, אפופטוזיס, התחדשות ונורמליזציה)60. מודל זה של הקרנה נקבע והוערך בקפידה, ומדגים ביטוי מתאים של פגיעה לחיקוי שחווים חולים שעברו הקרנות61. יותר ממחצית החולים בסרטן המעי הגס והחלחולת ובסרטן הגינקולוגי עוברים הקרנות בטן 40,62,63.<...

אפיתל המעי האנושי יכסה בערך את פני השטח של חצי מגרש בדמינטון אם ימוקם שטוח לחלוטין1. במקום זאת, שכבת התא הבודדת הזו המפרידה בין בני אדם לתכולת המעיים שלהם נדחסת לסדרה של הקרנות דמויות אצבע, וילי ושקעים, קריפטות שממקסמות את שטח הפנים של המעיים. תאי האפיתל מתמיינים לאורך ציר קריפט-וילוס. הווילוס מורכב בעיקר מאנטרוציטים סופגי חומרים מזינים, תאי גביע מפרישי ריר ותאים אנטרואנדוקריניים מייצרי הורמונים, בעוד שהקריפטים מורכבים בעיקר מתאי פאנת מייצרי דפנסין, תאי גזע פעילים ומילואים, ותאי אב 2,3,4,5. יתר על כן, התקשורת הדו-כיוונית שיש לתאים אלה עם תאי הסטרומה ומערכת החיסון של התא המזנכימלי הבסיסי והמיקרוביוטה של הלומן יוצרת רשת מורכבת של אינטראקציות השומרת על הומאוסטזיס המעי והיא קריטית להחלמה לאחר פציעה 6,7,8.
אפיתל המעי הוא הרקמה המתחדשת העצמית המהירה ביותר בגוף האדם, עם קצב תחלופה של 2-6 ימים 9,10,11. במהלך ההומאוסטזיס, תאי גזע פעילים בבסיס קריפטים של המעי (crypt base columnar cells), המסומנים על ידי ביטוי של קולטן מצומד G-protein 5 (LGR5) עשיר בלאוצין, מתחלקים במהירות ומספקים תאי אב המתמיינים לכל שושלות אפיתל המעי האחרות. עם זאת, בשל הקצב המיטוטי הגבוה שלהם, תאי גזע פעילים ואבותיהם המיידיים רגישים במיוחד לפגיעה בקרינת גמא ועוברים אפופטוזיס לאחר הקרנה 5,12,13,14. עם אובדנם, תאי גזע רזרבה ותאים שאינם גזע (תת-אוכלוסייה של אבות וכמה תאים ממוינים סופניים) בתוך קריפטות מעיים עוברים הפעלה ומחדשים את תא הקריפטה הבסיסי, אשר לאחר מכן יכול לשחזר אוכלוסיות תאים של הווילי, ובכך לחדש את אפיתל המעי15. באמצעות טכניקות מעקב אחר שושלת, קבוצות מחקר רבות הוכיחו כי תאי גזע רזרבה (שקטים) מסוגלים לתמוך בהתחדשות עם אובדן תאי גזע פעילים 13,16,17,18,19,20,21,22. תאים אלה מאופיינים בנוכחות של אונקוגן קומפלקס פוליקומב חלבון 1 (Bmi1), גן שעתוק הפוך של עכבר טלומראז (mTert), הופ הומיאובוקס (Hopx), וגן חלבון חוזר עשיר בלאוצין 1 (Lrig1). בנוסף, הוכח כי תאים שאינם גזע מסוגלים לחדש את crypts המעי עם פציעה 23,24,25,26,27,28,29,30,31. בפרט, הוכח כי אבות של תאים מפרישים ו enterocytes לעבור dedifferentiation עם פציעה, לחזור תאים דמויי גזע, ולתמוך התחדשות של אפיתל המעי. מחקרים אחרונים זיהו תאים המבטאים סמנים מרובים בעלי יכולת לרכוש מאפיינים דמויי גזע בעת פציעה (כגון DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. באופן מפתיע, Yu et al. הראו כי אפילו תאי Paneth בוגרים (LYZ+) יכולים לתרום להתחדשות המעי37. יתר על כן, בנוסף לגרימת אפופטוזיס של תאי אפיתל במעי ושיבוש תפקוד מחסום האפיתל, הקרנה גורמת לדיסביוזה של פלורת המעי, הפעלת תאי מערכת החיסון והתחלת תגובה פרו-דלקתית, והפעלת תאים מזנכימליים וסטרומליים38,39.
קרינת גמא היא כלי טיפולי רב ערך בטיפול בסרטן, במיוחד כשמדובר בגידולים במעי הגס40. עם זאת, הקרנה משפיעה באופן משמעותי על הומאוסטזיס המעי על ידי גרימת נזק לתאים, מה שמוביל אפופטוזיס. חשיפה לקרינה גורמת להפרעות מרובות המאטות את החלמתו של המטופל ומאופיינת בפגיעה ברירית ודלקת בשלב החריף ובשלשולים, בריחת שתן, דימום וכאבי בטן לטווח ארוך. מכלול זה של ביטויים מכונה רעילות קרינה במערכת העיכול. בנוסף, התקדמות הנגרמת על ידי קרינה של פיברוזיס טרנסמורלי ו / או טרשת וסקולרית עשויה להתבטא רק שנים לאחר הטיפול38,41. במקביל לפציעה עצמה, הקרינה גורמת לתגובת תיקון בתאי המעי המפעילה מסלולי איתות האחראים על ייזום ותזמור התחדשות42. מחלת מעי דק הנגרמת על ידי קרינה יכולה לנבוע מהקרנות אגן או בטן הניתנות לאיברים אחרים (כגון צוואר הרחם, הערמונית, הלבלב, פי הטבעת)41,43,44,45,46. פגיעה בהקרנת מעיים היא, אם כן, בעיה קלינית משמעותית, והבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה הנובעת מכך עשויה לקדם את הפיתוח של התערבויות להקלת הסיבוכים במערכת העיכול הקשורים להקרנות. ישנן טכניקות אחרות המאפשרות לחקור את המטרה הרגנרטיבית של אפיתל המעי מלבד קרינה. מודלים של מורין מהונדס וכימי לחקר דלקת וההתחדשות לאחר מכן פותחו47. דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) גורם לדלקת במעי ומוביל להתפתחות מאפיינים דומים לאלה של מחלות מעי דלקתיות48. שילוב של טיפול DSS עם התרכובת המסרטנת azoxymethane (AOM) יכול לגרום להתפתחות סרטן הקשור קוליטיס48,49. פגיעה הנגרמת על ידי איסכמיה היא שיטה נוספת המשמשת לחקר הפוטנציאל ההתחדשות של אפיתל המעי. טכניקה זו דורשת ניסיון וידע כירורגי50. יתר על כן, הטכניקות הנ"ל גורמות לסוגים שונים של פגיעה מאשר קרינה ועלולות להוביל למעורבות של מנגנוני התחדשות שונים. בנוסף, מודלים אלה גוזלים זמן, בעוד טכניקת הקרינה קצרה למדי. לאחרונה, שיטות במבחנה המשתמשות באנטרואידים וקולונואידים המופקים מהמעי ומהמעי הגס שימשו בשילוב עם פגיעה בקרינה כדי לחקור את מנגנוני התחדשות המעי51,52. עם זאת, טכניקות אלה אינן משחזרות באופן מלא את האיבר שהן מדגימות53,54.
הפרוטוקול המוצג כולל תיאור של מודל מורין של פגיעה בקרינת גמא בשילוב עם מודל גנטי המאפשר לאחר טיפול בטמוקסיפן התחקות אחר שושלות שמקורן באוכלוסיית תאי הגזע השמורות (Bmi1-CreER; רוזה26eYFP). מודל זה משתמש בהקרנה של 12 Gy לכל הגוף, אשר גורמת לפגיעה משמעותית מספיק במעיים כדי להפעיל תאי גזע רזרבה ועדיין מאפשרת חקירה עוקבת של יכולת התחדשות המעי תוך 7 ימים מהפציעה55.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G לשימוש חוזר מחטי האכלה לבעלי חיים קטנים: ישר</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2 אינץ' מחט</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2 אינץ' מונוject 1 מ"ל מזרק אינסולין</td><td>Covidien</td><td></td><td></td> 1188128012-5-Ethynyl-2</tr><tr><td>&prime;-deoxyuridine (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO סטרילי: מים (1:4 v/v), יש לאחסן ב-20&deg; סי</td></tr><tr><td>עזר סיינטיפיק&nbsp; 10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-026-213-B6.129X1-GT</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>זן מעבדת ג'קסון</td><td>#:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-BMI1TM1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>זן מעבדת ג'קסון</td><td>#:010531</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין שבר V, הלם חום</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>עוף אנטי-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT בתוספת ערכת הדמיה EdU Alexa Fluor 555, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific C10638-שמן</td><td></td></tr> <tr><td>תירס</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Decloaking</td><td></td></tr> <tr><td>Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-דימתיל</td><td></td></tr> <tr><td>סולפוקסיד (DMSO)</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז ללא DNase</td> רגיש לאור K <td>Invitrogen</td><td></td><td>C10618H מדולל פי 25 ב-DPBS</td></tr><tr><td>חמור נגד עוף AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>פישר מדעי</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon Eclipse 90i אור בהיר וזורם, עם מטרות: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount הרכבה מימית בינונית</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>תא גמא 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0.759 Gy min-1goat</td></tr> <tr><td>נגד ארנב AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המטוקסילין, זימים מס' 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 מיקרוטום סיבובי מבית Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>דילול H3569</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן, ACS, 29-32%, ספקטרום כימי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>18-603-252-ערכת</td><td></td></tr> <tr><td>זיהוי מוות של תאים באתר, פלואורסצאין (Roche)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910 חוסם</td><td></td></tr><tr><td>נוזלים Super PAP PEN, מיני</td><td>פישר מדעי</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום קרבונט (אבקה/ACS מוסמך), פישר כימיקל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>L119-500</td><td>0.5 גרם/1 ליטר dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89215-218-מתנול</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>מוצרי פארמקו&nbsp; אלכוהול אתילי, 200 הוכחה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr> NC1675398-פארמקו-Aaper <tr><td>281000ACSCSLT חומצה אצטית ACS כיתה</td><td>קפיטול מדעי</td><td>AAP-281000ACSCSLT-ארנב</td><td></td></tr> <tr><td>אנטי-Ki67</td><td>BioCare רפואי</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>ריצ'רד-אלן סיינטיפיק ציטוסיל XYL הרכבה בינונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>חממת Scientific Industries-Genie לאפיית שקופיות ב-65 מעלות</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>ערכת חיתוך נירוסטה</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרו שקופיות [גודל: 25 x 75 x 1 מ"מ]</td> <td>VWR</td><td>&nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 מ"ג/מ"ל בשמן תירס סטרילי, רצוי לאחסון טרי או קצר טווח ב-20&deg; C,</td></tr><tr><td>מחזיקי Tissue-Tek 24-Slide רגישים לאור עם ידית ניתנת להסרה</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; אקו-אדג'&nbsp; להבים בפרופיל נמוך</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; סט צביעת שקופיות ידני</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מכתים Tissue-Tek, ירוק עם מכסה</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek צלחת מכתים, לבן עם מכסה</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>קלטות עיבוד Unisette</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>מיקרו כיסוי משקפיים</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

אפיתל המעי מורכב משכבה אחת של תאים אך מכיל סוגים רבים של תאים ממוינים סופניים, אשר נוצרים על ידי התפשטות פעילה של תאי גזע מעיים הממוקמים בתחתית crypts המעי. עם זאת, במהלך אירועים של פגיעה חריפה במעי, תאי גזע פעילים אלה עוברים מוות תאי. הקרנת גמא היא טיפול נפוץ בסרטן המעי הגס, אשר, בעוד יעיל מבחינה טיפולית, יש את תופעת הלוואי של דלדול מאגר תאי הגזע הפעיל. ואכן, חולים חווים לעתים קרובות תסמונת קרינה במערכת העיכול בזמן שהם עוברים הקרנות, בין היתר בשל דלדול תאי גזע פעילים. אובדן תאי גזע פעילים במעיים מפעיל מאגר של תאי גזע במעי שבדרך כלל נמצאים ברזרבה שקטה וגורם להתמיינות של תאים מבשרי הפרשה ואנטרוציט. אלמלא תאים אלה, אפיתל המעי היה חסר את היכולת להתאושש מהקרנות ופגיעות רקמה גדולות אחרות. פיתוחים חדשים בטכנולוגיות למעקב אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך רגנרציה, ושימשו בהצלחה לחקר זה במעיים. מחקר זה נועד לתאר שיטה לניתוח תאים בתוך אפיתל המעי של העכבר לאחר פגיעה בקרינה.

השימוש בקרינה הכוללת של 12 Gy (TBI) בשילוב עם מעקב אחר שושלת גנטית של מורין מאפשר ניתוח מעמיק של ההשלכות של פגיעה בקרינה במעיים. כדי להתחיל, Bmi1-CreER; עכברי Rosa26eYFP קיבלו זריקת טמוקסיפן יחידה, הגורמת לביטוי משופר של חלבון פלואורסצנטי צהוב (EYFP) באוכלוסיית תאי גזע מסוג Bmi1+ . יומיים לאחר הזרקת הטמוקסיפן, עברו העכברים הקרנה או הקרנת דמה. שלוש שעות לפני המתת החסד הוזרקו לעכברים EdU. לאחר המתת חסד, דגימות המעי הדק נאספו לניתוח ב 0 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעו...

מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

הקרנת גמא היא טיפול נפוץ לסרטן המעי הגס. ובעוד זה יעיל מבחינה טיפולית, יש לו השפעות שליליות על מערכת העיכול. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך התחדשות לאחר פגיעה בקרינה.פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. חשוב לציין, מודל זה מאפשר לעקוב אחר גורל תאי המעי לאחר פציעה ובכך מספק הבנה טובה יותר של יכולת ההתחדשות של תת-אוכלוסיית תאים ספציפית. טכניקה זו יכולה להשתמש במודלים שונים של בעלי חיים העוקבים אחר שושלת כדי לחקור את ההתנהגות בזמן אמת ואת האינטראקציה של תת-אוכלוסיות שונות של תאים לאחר פציעה.שינויים קלים בפרוטוקול זה אמורים לאפשר לחקור את היחסים בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות שונות של תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בעת פגיעה בקרינה. כדי להתחיל, להשעות אבקת טמוקסיפן בשמן תירס סטרילי בריכוז של 30 מיקרוגרם למיקרוליטר. סוניק במשך שלוש דקות במחזורי כיבוי של 30 שניות עם משרעת של 60%.מערבבים בסיבוב בחושך במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את EdU על ידי הוספת DMSO סטרילי לאבקת EdU. מוסיפים 1/5 מהנפח הכולל, ומוסיפים לאט לאט את הנפח הנותר של מים סטריליים טהורים במיוחד.כאשר מומס לחלוטין, aliquot ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. הכינו ריאגנטים לאיסוף וקיבוע רקמות, כגון אתנול 70% במים, DPBS מקורר לארבע מעלות צלזיוס, חיץ קיבוע של Bouin, ופורמלין חוצץ 10%. לאחר מכן, להכין את הציוד הדרוש, כגון ערכת דיסקציה עכברים, צלחות פטרי, מחט gavage 16 מד מחובר מזרק 10 מיליליטר קלטות היסטולוגיות.יומיים לפני החשיפה לקרינת גמא, הכינו את חיות הניסוי להזרקת טמוקסיפן. לשקול כל חיה, ולחשב את המינון הנדרש. יש לחטא את אזור הבטן באתנול 70%.לאחר מכן, יש לתת מנה אחת של טמוקסיפן תוך צפקי באמצעות מחט של 27 מד המחוברת למזרק של מיליליטר כדי לגרום לרקומבינציה בתיווך Cre. התבוננו בבעלי חיים במשך 48 השעות הבאות כדי למנוע רעילות פוטנציאלית של טמוקסיפן. לאחר 48 שעות, העבירו את בעלי החיים לחדר הקרנה.יש לחטא את תא הדגימה במקרין הגמא בתמיסת אתנול 70%. הניחו את משטח הספיגה ובעלי החיים בתוך תא הדגימה. מניחים את המכסה וסוגרים את החדר.תכנת את מקרין הגמא כך שיחשוף בעלי חיים לקרינת גוף כוללת של 12 אפורים. לאחר מכן, סובב את המקש למיקום ההתחלה ולחץ על התחל כדי להתחיל את החשיפה. השאירו את החדר לזמן חשיפה פעיל.לאחר שחלף הזמן שנקבע מראש, המכונה תפסיק אוטומטית ותתחיל לצפצף. כבה את המכונה על-ידי הפיכת המפתח למצב עצירה. פתח את תא הדגימה והסר את המכסה.מעבירים את בעלי החיים לכלוב, ומחטאים את תא הדגימה באתנול 70%. העבירו את בעלי החיים בחזרה לחדר הדיור הקונבנציונלי, והתבוננו במצבם לאחר הטיפול. עקוב אחר משקל בעלי החיים מדי יום.שלוש שעות לפני המתת החסד המתוכננת, יש לחטא את אזור הבטן ולהזריק לעכברים תוך צפקית 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי EdU באמצעות מזרק אינסולין בעל 28 מד. לאחר המתת החיה, לאסוף את המעיים פרוקסימלי בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה. לנתח את החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, ולהסיר רקמות מחוברות.שטפו את הרקמה ב-DPBS קר באמצעות מחט הזנה ישרה בעלת 16 מד המחוברת למזרק של 10 מיליליטר, וקיבעו את הרקמה באמצעות חיץ הקיבוע של Bouin. חתכו את המעיים לאורך, וגלגלו את המעיים הפרוקסימליים בטכניקת סוויס-רול. הניחו את הרקמות בקלטת היסטולוגית במיכל עם 10% פורמלין חוצץ, ודגרו עליו במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, להעביר את הקלטות היסטולוגיות ל 70% אתנול, ולהטמיע את הרקמה בפרפין. לאחר ההטבעה, הניחו את הקלטות ההיסטולוגיות על קרח למשך שעה לפחות. לאחר מכן, חתכו חלקים אופקיים בעובי חמישה מיקרון באמצעות מיקרוטום.מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם עד 45 מעלות צלזיוס, ומניחים את המקטעים על מגלשות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש. תמונות המטוקסילין ואוזין של דגימות מעי דק הראו אפיתל מעי הומיאוסטטי בשעת אפס, ואחריו אובדן תאים בתוך תאי קריפטה במהלך השלב האפופטוטי.לאחר מכן הגיע השלב הרגנרטיבי שבו תאים מתרבים מאוד אכלסו את הקריפטות, מה שהוביל לשלב הנורמליזציה ביום השביעי. מעקב אחר שושלת על ידי EYFP הראה כי במהלך הומאוסטזיס, התאים שמקורם בתאי גזע עתודות חיוביות Bmi1 הוגבלו לפלוס ארבעה עד פלוס שישה מיקומים בתוך קריפטות. צביעת EdU ו- Ki-67 הראתה הומאוסטזיס מעיים תקין בעכברים מוקרנים דמה, המשתרעת מתאי גזע פעילים דרך אזור הגברת המעבר.במהלך השלב האפופטוטי, מספר התאים החיוביים ל-EYFP ירד, מלווה באובדן תאים מתרבים שנגרם כתוצאה מנזקי קרינה. בשלב הרגנרטיבי נצפתה הפעלה של תאי גזע רזרבה והתפשטות מהירה של תאים חיוביים ל- Bmi1. התפשטות נוספת והגירה החזירו את שלמות אפיתל המעי.צביעת טונל הראתה כי תאים אפופטוטיים נעדרים במהלך הומאוסטזיס. עלייה בצביעת טונל נצפתה בשלב מאוחר בשלב האפופטוטי. במהלך השלב הרגנרטיבי, צביעת טונל פחתה בהתמדה בתוך הקריפטים המתחדשים וכמעט נעדרה כאשר הקריפטים נרמלו.ניתן לשלב טכניקה זו עם ריצוף RNA, ריצוף RNA חד-תאי, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או אנליזה פרוטאומית כדי ללקט ידע מעמיק יותר על תפקידן של שושלות תאים ספציפיות במהלך התחדשות המעי לאחר פציעה. החוקרים יכולים לחקור את יחסי הגומלין בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בהתחדשות המעי כדי להרחיב את ההבנה של יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

השיטה יעילה השתלת רקמות בגודל מוגדרת ועקבית בין planaria מתואר. היא כללה גם תיאור של איך להשתמש בטכניקה immobilization להשתלה ניתן להתאים, בשיתוף עם מגן עופרת, הקרנה חלקית של בעלי חיים.

Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

אנו מציגים פרוטוקול לחקור crosstalk בין X-ray-מוקרן קאקו-2 תאי תאי דם היקפיים (PBMC). הפרוטוקול מתחיל עם קאקו-2 הקרנה ולהגדרה של תרבות משותפת עם PBMC; לאחר מכן, ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל נמדד באופן קבוע מעל 48 חשופה h ומערביות הופיעה קאקו-2 ו- PBMC.

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת נקודות קצה חשובות וסמנים מתרבים של נזקי מעיים קטנים ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה. אנו להדגים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות מחזור התא סמן מסוים באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה.

חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.

הטיפול בקרינה של תרבויות אורגנוטימית מתוך הלסת התחתונה ובלוטות הרוק פרודה מודלים מפתח Vivo מאפיינים

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תמונות של המעי על פצע המושרה בלייזר. על ידי חשיפת מעי העכבר ללייזר מולטיפוטון, אובדן של קריפט(ים) בודדים או מרובים מושרה באופן מקומי. על ידי הדמיה חוזרת ונשנית של האזור הפגוע במשך חודשים, נלכדת הדינמיקה בזמן אמת של התאוששות המעי.

אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני לחקר עיצוב מחדש של המעי

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

הדמיה אימונופלואורסצנטית מוגבלת על ידי היכולת לצפות בתהליכים ביולוגיים מורכבים ותלויי זמן בתמונת מצב אחת בלבד בזמן. מחקר זה מתאר גישת הדמיה חיה שנערכה על פרוסות בלוטות תת-לסתיות של עכברים שנחתכו בחיתוך מדויק. גישה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תא-תא במהלך הומאוסטזיס ותהליכי התחדשות ותיקון.

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

חקור את יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי לאחר פגיעה מקרינת גמא בעכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי תאי גזע ודינמיקה תאית, ומספקת הבנה עמוקה של תהליכי החלמה לאחר טיפול בסרטן המעי הגס.

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

גלה סרטונים נוספים