Name: הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למד הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות כרומטין ומנגנוני תיקון DNA ביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר מריו בורגניה מליבת cryo-EM במכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה ולד"ר ג'ושוע שטראוס מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל על ההדרכה וההכשרה שלהם בהכנת רשת cryo-EM. אנו מודים גם לד"ר Juliana Mello Da Fonseca Rezende על הסיוע הטכני בשלבים הראשונים של פרויקט זה. אנו מעריכים את תרומתם ותמיכתם העיקרית של ד"ר סמואל וילסון המנוח וחברי מעבדתו, במיוחד ד"ר רג'נדרה פראסאד וד"ר ג'ונאס ג'מסן לטיהור קומפלקס APE1-Polβ המאוחה גנטית. המחקר נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [מספרי מענק Z01ES050158, Z01ES050159 ו- K99ES031662-01].

1. הרכבת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים באמצעות דיאליזה מלחית
הערה: הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים באמצעות חלבוני היסטון רקומביננטיים למחקרים מבניים תוארה בפירוט רב על ידי אחרים14,15,16. בצע את הטיהור של היסטונים רקומביננטיים X. laevis והרכבת אוקטמר היסטון המתוארים על ידי אחרים14,15, והרכיב את המצע הנוקלאוזומלי כמתואר להלן.
<ol><li>רכוש שלושה אוליגונוקלאוטידים (המפורטים בטבלה 1) בקנה המידה שצוין: UND-197mer, 161mer, 35mer.<ol><li>PAGE לטהר אולטרמרים (197mer ו-161mer) כמתואר17.<ol><li>כמויות שקולות אנליות של אוליגונוקלאוטידים בחיץ חישול 1x (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). לדוגמה, לערבב 40 μL של 161-mer [166.7 μM]; 8 μL של 35-mer [292.4 μM]; 16.8 μL של גדיל קומפ 197-mer [408.2 מיקרומטר]; 10 μL של 10x חיץ אנאלי ו 10.9 μL של dH2O. הערה: קריטי לשלוט בתגובת החישול באמצעות שיפוע טמפרטורה. ראו טבלה 2 לפרטים על שיפוע הטמפרטורה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>בצעו שינויים בקנה מידה קטן (קנה מידה של 1/57 מהדוגמה המוצגת להלן עבור נפח סופי של 50 μL) כדי לקבוע את היחס בין דנ"א לאוקטמר היסטון (יחסי התחלה אופייניים של DNA:octamer הם כדלקמן: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; מוצג באיור 2A); זה קריטי לקבוע את היחס הזה באופן אמפירי עם קונסטיטוציות מחדש בקנה מידה קטן.<ol><li>לאחר קביעת יחס זה, הכינו קונסטיטוציה מחדש בקנה מידה גדול. לדוגמה, לערבב 32.9 μL של DNA-197 bp [99.4 μM]; 1647.1 מיקרוליטר של TE (1x); 1120 μL של 5 M NaCl, ו-62.3 μL של אוקטמר היסטון WT [2.56 μM].</li>
	</ol></li>
	<li>יצירת מאגרי דיאליזה: RBנמוך ו-RBגבוה כמתואר בטבלה 3 ובטבלה 4, בהתאמה; לקבוע את החוקות מחדש כפי שתואר קודם14.<ol><li>מעבירים את צינור הדיאליזה לתוך הכד המכיל RBגבוה, ומאפשרים לדיאליזה להמשיך, תוך ערבוב עדין, למשך 16 שעות או עד ש-2 ליטר RBנמוך מועבר לכד הפסולת.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו את צינור הדיאליזה לתוך 1 ליטר המכילה חיץ RB50mM (טבלה 5) ואפשרו לדגימה להתנתק למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה.<ol><li>להעריך את יעילות ההרכבה מחדש על ג'ל 6% פוליאקרילאמיד nondenaturing, להבטיח שיש פחות מ 10% DNA חופשי ופס NCP יחיד; יש לאחסן NCPs בטמפרטורה של 4°C. ראו איור 2A (נתיב 5) ואיור 2B לקבלת תוצאות מייצגות של בנייה מחדש אופטימלית.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכן קומפלקס גורם תיקון NCP-DNA (NCP-DRF)
<ol><li>טיהור על ידי אלקטרופורזה ג'ל הכנה הערה: שיטה זו היא עתירת העבודה ביותר (מבין השתיים המתוארות), ובעוד שהיא יעילה בהסרת מינים בעלי משקל מולקולרי גבוה (HMW) (איור 6A) בגלל גורם הדילול הגבוה, זה יכול להוביל לפירוק מסוים כפי שמוצג ב איור 7A (NCP prep cell out lane), שחרור DNA. עם זאת, עד 25% DNA חופשי עדיין תואם למחקרי cryo-EM. בגלל הדילול הגבוה, השתמש בשיטה זו כדי לטהר את NCP בלבד, ולא את כל המכלול.<ol><li>הכן 70 מ"ל של 6% תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה ב- 0.2x TBE, באמצעות תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד 37.5:1, אקרילאמיד:ביסקרילאמיד. יוצקים ג'ל גלילי עם רדיוס חיצוני של 28 מ"מ ומתפלמרים לילה.</li>
		<li>להרכיב את מנגנון הפעלת הג'ל המכין, באמצעות קרום דיאליזה עם חתך 6-8 kDa MW. השתמש ב- 0.25x TBE כמאגר הריצה ובמאגר אלוציה אחד (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5). הפעילו מראש את הג'ל הגלילי בהספק קבוע של 12W למשך שעה אחת, ואספו שברים המפעילים את המשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה של כ-1 מ"ל/דקה. הערה: אם גלאי UV אינו זמין לזיהוי שברים המכילים DNA, ניתן לבצע ניסוי סינון עם 32P-NCP כדי לזהות את שברי העניין. שמירה על כל התנאים זהים, NCPs ללא תווית לאחר מכן ניתן לטהר ללא גלאי UV.</li>
		<li>רכז את 2.8 מ"ל של NCP ל 250 μL באמצעות מסנן צנטריפוגלי (MW לחתוך 30 kDa), ולטעון על ג'ל הכנה אלקטרופורזה במשך 6 שעות בסך הכל. בשעה 2 שעות, כאשר ציאנול xylene נגמר של הג'ל, להתחיל לאסוף 1.5 מ"ל שברים. הערה: בשעה 2.5 שעות, שברים יהיו נקיים מקסילן ציאנול; הדנ"א (197mer) נפלט בערך 3-3.5 שעות, וה-NCP צפוי להיפלט ב-4.5-5 שעות.</li>
		<li>לנתח שברים של עניין על 6% nondenaturing פוליאקרילאמיד ג'ל. שברי בריכה המכילים את NCP, ומיד להתרכז עם מסנן צנטריפוגלי (MW לחתוך 30 kDa) ל 1 מ"ג / מ"ל. למחרת, להעריך את האיכות של NCP על 6% פוליאקרילאמיד nondenaturing ג'ל לפני קומפלקס עם גורם תיקון DNA (DRF) של עניין.</li>
		<li>לדגור את NCP ואת DRF של עניין על קרח במשך 15 דקות באמצעות חיץ אופטימלי עבור קומפלקס ספציפי. לדוגמה, ערבבו 1,000 מיקרוליטר של NCP [1.2 מיקרומטר]; 260 μL של 5x חיץ מחייב (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL של 3 M KCl, ו 18 μL של MBP- Pol β-APE1 [338 μM]. הערה: הטמפרטורה והחוזק היוני שבו מורכב מורכב עשוי להזדקק אופטימיזציה עבור קומפלקסים שונים.</li>
		<li>מוסיפים גלוטראלדהיד (נפתח טרי; ציון EM) לריכוז סופי של 0.005%. לכן, לתגובה זו, להוסיף 26.8 μL של 0.25% גלוטראלדהיד עם 13.2 μL של dH2O. מערבבים היטב, ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 13 דקות.</li>
		<li>להרוות עם 1 M Tris-Cl, pH 7.5, לריכוז סופי של 20 mM Tris-Cl, pH 7.5. רכז ל~50 μL והחלף את החיץ עם מאגר הקפאה 1x: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5 באמצעות עמודת התפלה. אזהרה: גלוטראלדהיד עלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים; זה מזיק אם נבלע, וזה רעיל אם נשאף. יש ללבוש מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ולטפל בגלוטראלדהיד במכסה מנוע מנדף ולעטות מסכה. הערה: קריטי לבצע את תגובת ההצלבה בנפח גדול עם NCP בריכוז נמוך זה. ניסיונות קודמים של crosslinking, אפילו בריכוז זה של גלוטראלדהיד, אך בריכוז גבוה פי 10 של NCP הובילו לצבירה של הדגימה ולהצלבת יתר כפי שמצוין על ידי SDS PAGE וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ברשתות האלה לא היו חלקיקים שניתן להבחין בהם עם גושים בלבד (איור 5D,E).</li>
		<li>קבע את הספיגות ב-OD 280 וב-OD 260 והתרכז עוד יותר במידת הצורך כדי להגיע ל-1.3-3 מ"ג/מ"ל, בהתבסס על OD 280 (יחס אופייני של OD260/ OD 280= 1.7-2 מניב חלקיקים טובים). עבור נפח קטן זה של 50 μL, השיטה הטובה ביותר כדי להפחית את אובדן הדגימה היא לעשות כפתור דיאליזה עם מכסה של צינור 1.7 מ"ל מכוסה על ידי קרום דיאליזה (6-8 kDa MW חתך), לחתוך את החלק התחתון של הצינור ולהשתמש בשפה של הצינור כדי לאטום את הממברנה על גבי המכסה.</li>
		<li>הניחו את כפתור הדיאליזה המכיל את הדגימה על גבי מצע פוליאתילן גליקול, כאשר הממברנה פונה כלפי מטה (בדקו את ההתקדמות כל 2 דקות). שיטה זו מועדפת כאשר הריכוז הדרוש קטן או שווה פי 2.5 כדי למנוע דילול או איבוד הדגימה במרכז. זה קריטי להכין מיד רשתות cryo-EM של המתחם לאחר שלב זה.</li>
	</ol></li>
	<li>טיהור לפי גודל לא כולל כרומטוגרפיה<ol><li>יום לפני ההקפאה, יש לשטוף ולאזן עמוד אי הכללת גודל עם 60 מ"ל של dH2O, ואחריו 80 מ"ל של חיץ הקפאה (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) למשך הלילה בקצב של 0.4 מ"ל/דקה. באמצעות NCPs מיד לאחר הרכבה מחדש, להכין את אותו קומפלקס באמצעות כמויות גדולות פי 2.5 כדלקמן: לערבב 2,500 μL של NCP [1.2 מיקרומטר]; 650 μL של 5x חיץ קשירה; 45 μL של MBP-Pol β-APE1 [338 μM] ו-55 μL של 3M KCl.</li>
		<li>דוגרים על התערובת על קרח ללא קרוסלינקר במשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 0.005% כמתואר בשיטת הג'ל המכין. במקרה זה, לעומת זאת, רכז את הקומפלקס במסנן צנטריפוגלי מאוזן מראש (עם חיץ הקפאה) לכ- 120 μL.</li>
		<li>נתחו מיד את שברי השיא ורכזו את השברים המכילים את ההיסטונים ואת MBP-Pol β-APE1 כפי שצוין קודם לכן. ראו איור 5A,B,C לקבלת תוצאות מוצלחות בשיטת אי-הכללת הגודל ובאיור 7 בשתי השיטות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. להקפיא קומפלקס נוקלאוזומלי
<ol><li>לאחר הפעלת מקפיא צלילה ומילוי מכשיר האדים עם 50 מ"ל של dH2O, להגדיר את טמפרטורת החדר ל 22 ° C ו HR (לחות) ל 98%. הניחו את האתאן ואת החנקן הנוזלי (המכילה קופסת רשת מסומנת) במחזיקי החלל שלהם.</li>
	<li>כסו את האתאן במתקן למכסה אתאן, ושפכו עליה בזהירות חנקן נוזלי (LN2), תוך מילוי LN 2 ב-LN2. כאשר רמת LN2 התייצבה ומגיעה ל -100% וטמפרטורה של -180 מעלות צלזיוס, פתח בזהירות את שסתום האתאן ומלא את האתאן עד שהוא יוצר בועה על המכסה השקוף. הסר את מתקן אתאן.</li>
	<li>הניחו שני ניירות סינון על מכשיר הניקוי והדקו אותם באמצעות טבעת מתכת. עבור אל ההגדרה והשתמש בפרמטרים הבאים עבור blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; בחר A-plunge ולחץ על אישור.</li>
	<li>במסך הראשי, לחצו על Load Crups, וטענו אותם ברשת כאשר צד הפחמן/יישום פונה שמאלה (מוכן כמו קודם). כייל את המלקחיים תוך התאמת ציר Z כדי להבטיח כתם מוצק. לחץ על החדר התחתון ולהחיל 3 μL של המתחם (1.3-3 מ"ג / מ"ל; OD280). לחץ על Blot/A-plunge. פעולה זו תסובב את הרשת לכתם מהחזית ותצלול להקפיא אותה.</li>
	<li>העבר ואחסן את הרשת בתיבת הרשת בתא LN2 . לאחר שכל ארבע הרשתות הוקפאו והונחו בתיבת הרשת, סובבו את המכסה למצב נייטרלי, שבו כל הרשתות מכוסות על ידי המכסה, והדקו את הבורג. ניתן לאחסן רשתות ב- LN2 עד לתחילת ההקרנה.</li>
</ol>4. רשתות מסך
<ol><li>לפני טעינת הדגימות במיקרוסקופ, הניחו את הרשתות המזוגגות על טבעת ואבטחו אותן באמצעות קליפ C. בצע תהליך חיתוך זה תחת LN2 בחדר מבוקר לחות, כדי למנוע זיהום קרח.</li>
	<li>בעת טעינת המיקרוסקופ, הכנס את הרשתות לקלטת של 12 חריצים. העבר את הקלטת לתוך קפסולת ננו-תא וטען אותה לטוען האוטומטי. המנגנון הרובוטי autoloader יוזם את התהליך.</li>
	<li>מעבירים את הרשת מהקלטת לשלב המיקרוסקופ. התאימו את הבמה לגובה אאוצנטרי על ידי נדנוד השלב ב-10° והזזת גובה Z בו-זמנית עד להזזה מישורית מינימלית בתמונות.</li>
	<li>לאחר שמגיעים לגובה האוצנטרי, התחל בהדמיה. ראשית, השג את האטלס על ידי צילום תמונת מונטאז' בגודל 3X3 של הרשת, שבה כל מונטאז' מצולם בהגדלה של פי 62. בחר שלושה ריבועים בגדלים שונים; צלם את הגובה האוצנטרי ולאחר מכן צלם בהגדלה של 210x.</li>
	<li>לאחר יצירת תמונה של ריבוע, בחרו חור אחד מכל אחד מהשוליים, מהמרכז וביניהם בתוך הריבועים. דמיינו כל חור בהגדלה של 2600x.</li>
	<li>לפני צילום תמונה בהגדלה גבוהה זו, המיקוד האוטומטי מתרחש בהסטה של אזור ההדמיה. צלם את תמונת ההגדלה הגבוהה ממרכז החור בהגדלה של 36,000x ובזמן חשיפה של 7.1 שניות, 60 פריימים, גודל של 1.18 פיקסלים וביטול מיקוד של 3 מיקרומטר. ראו תמונות מייצגות של ההקרנה באיור 5, איור 6 ואיור 7.</li>
</ol>

<ol><li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+dynamics+at+DNA+replication%2C+transcription+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li>
<li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li>
<li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+DNA+damage+in+chromatin%3A+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li>
<li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li>
<li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li>
<li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li>
<li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li>
<li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme%2Fnucleosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li>
<li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurgess%2C+RRD+%22Guide+to+Protein+Purification%22">Guide to Protein Purification</a>. 463, Academic Press. (2009).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909(2016).</li>
<li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+%28Legobodies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationall+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255(2018).</li>
<li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול ספציפי לטיהור גורם תיקון ה- DNA יהיה תלוי באנזים המעניין. עם זאת, ישנן כמה המלצות כלליות, כולל שימוש בשיטות רקומביננטיות לביטוי וטיהור חלבונים18; אם החלבון המעניין קטן מדי (<50 kDa), קביעת המבנה על ידי cryo-EM הייתה כמעט בלתי אפשרית עד לאחרונה באמצעות שימוש במערכות היתוך19, פיגומים קושרי ננו-גוף20, ואופטימיזציה של אסטרטגיות הדמיה21.
זה די נפוץ להשיג רשתות באיכות ירודה בשלבים הראשונים. ניסיו...

דנ"א אאוקריוטי מאורגן ודחוס על ידי חלבוני היסטון, היוצרים כרומטין. חלקיק הליבה הנוקלאוזומי (NCP) מהווה את היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין המווסתת את הנגישות לחלבונים קושרי DNA לצורך תיקון, שעתוק ושכפול DNA1. למרות שהמבנה הגבישי הראשון של קרני רנטגן של NCP נפתר לראשונה לפני יותר משני עשורים2 ומבנים רבים נוספים של NCP פורסמו מאז 3,4,5,6, מנגנוני תיקון DNA במצעים נוקלאוזומליים עדיין לא הוגדרו. חשיפת הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס תיקון הדנ"א בכרומטין תדרוש אפיון מבני של המרכיבים המשתתפים כדי להבין כיצד תכונות מבניות מקומיות של NCP מווסתות את פעילויות תיקון הדנ"א. זה חשוב במיוחד בהקשר של תיקון כריתת בסיס (BER) בהתחשב בכך שמחקרים ביוכימיים עם אנזימי BER מציעים מנגנוני תיקון DNA ייחודיים בנוקלאוזומים התלויים בדרישות מבניות ספציפיות לאנזים לקטליזה ובמיקום המבני של נגע ה- DNA בתוך הנוקלאוזום: 7,8,9,10,11,12,13 . בהתחשב בכך ש-BER הוא תהליך חיוני לתיקון DNA, יש עניין רב למלא פערים אלה תוך יצירת נקודת מוצא שממנה ניתן לבצע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית אחרים הכוללים קומפלקסים נוקלאוזומליים רלוונטיים.
Cryo-EM הופכת במהירות לשיטת הבחירה לפתרון המבנה התלת מימדי (3D) של קומפלקסים שההכנה בקנה מידה גדול של מדגם הומוגני מאתגרת. אמנם, התכנון והטיהור של NCPs מורכבים עם גורם תיקון DNA (NCP-DRF) ככל הנראה ידרוש אופטימיזציה מותאמת, ההליך המוצג כאן כדי ליצור ולהקפיא קומפלקס NCP-DRF יציב מספק פרטים על איך לייעל את הדגימה ואת הכנת רשת cryo-EM. שתי זרימות עבודה (שאינן סותרות זו את זו) המוצגות באיור 1, והפרטים הספציפיים בפרוטוקול מזהים שלבים קריטיים ומספקים אסטרטגיות למיטוב שלבים אלה. עבודה זו תניע את תחום תיקון הכרומטין והדנ"א לכיוון שבו השלמת מחקרים ביוכימיים עם מחקרים מבניים הופכת לאפשרית מבחינה טכנית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של תיקון דנ"א נוקלאוזומי.

<table><tbody><tr><td>1 מ' HEPES; pH 7.5</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 מ' MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% glutaraldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 תא הכנה</td><td>מסנן צנטריפוגלי Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 (חיתוך MW 30 kDa)</td>מסנן צנטריפוגלי <td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 (MW cutoff 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid פינצטה</td><td>טד פלה</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא צלילה אוטומטי</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 מגע thermocycler</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C-clamps וטבעות</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>תחנת גזירה</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת דיאליזה (MW cufoff 6-8 kDa)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה יהלומים</td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>DNA משולב טכנולוגיות</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>FEI טיטאן קריוס</td><td>תרמו פישר</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC מערכת טיהור</td><td>AKTA</td><td></td> אספן שברים טהור 29018224 <td></td></tr><tr><td>דגם 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>זוהר מערכת ניקוי פריקת</td><td>טד פלה</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>תיבות רשת</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>חבילת אביזרי אחסון רשת</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>אתאן נוזלי</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 משאבה דו-ראשית פריסטלטית</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricine, 1.0 מ"מ, מיני ג'ל חלבון</td><td>Thermo פישר סיינטיפיק</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן</td><td>גילסון</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (VWR) תמיסת</td> ג'ל פוליאקרילאמיד <td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td>(</tr><tr><td>37.5:1)</td><td>פוליאתילן גליקול 1610158</td><td></td><td></td>ביו-ראד</tr><tr><td>(PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>גורם תיקון DNA רקומביננטי מטוהר</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1.2/1.3 Cu 300 רשתות רשת</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>אוקטמר היסטון רקומביננטי</td><td>N/A</td><td>N/</td>A <td></td></tr><tr><td>כלי חיתוך קפיץ</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 עמודה 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>שידור אלקטרונים מיקרוסקופ</td><td>תרמו פישר</td><td>Talos Arctica 200 קילו וולט</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה הרכבה עבור FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV מערכת</td><td></td></tr><tr><td>Whatman נייר סינון (55 mM)</td> <td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה מיקרו ספין Zeba, 7K MWCO, 75 ומיקרו; תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון dna לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

תיקון DNA בהקשר של כרומטין אינו מובן היטב. מחקרים ביוכימיים המשתמשים בחלקיקי ליבה נוקלאוזומים, היחידה החוזרת הבסיסית של כרומטין, מראים שרוב אנזימי תיקון הדנ"א מסירים נזק לדנ"א בקצב מופחת בהשוואה לדנ"א חופשי. הפרטים המולקולריים על האופן שבו אנזימים לתיקון כריתת בסיס (BER) מזהים ומסירים נזק לדנ"א בנוקלאוזומים לא הובהרו. עם זאת, נתוני BER ביוכימיים של סובסטרטים נוקלאוזומליים מצביעים על כך שהנוקלאוזומים מציגים מחסומים מבניים שונים התלויים במיקום נגע הדנ"א והאנזים. הדבר מצביע על כך שהמנגנונים שבהם משתמשים אנזימים אלה כדי להסיר נזק לדנ"א בדנ"א חופשי עשויים להיות שונים מאלה המופעלים בנוקלאוזומים. בהתחשב בכך שרוב הדנ"א הגנומי מורכב לנוקלאוזומים, יש צורך במידע מבני של קומפלקסים אלה. נכון להיום, הקהילה המדעית חסרה פרוטוקולים מפורטים לביצוע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית של קומפלקסים אלה. כאן, אנו מספקים שתי שיטות להכנת קומפלקס של שני אנזימי BER מאוחים גנטית (פולימראז β ואנדונוקלאז AP1) הקשורים לפער נוקלאוטיד יחיד ליד הכניסה והיציאה של הנוקלאוזום, לצורך קביעה מבנית של מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryo-EM). שתי שיטות הכנת הדגימה תואמות לזיגוג רשתות איכותיות באמצעות הקפאת צלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת מוצא להכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים אחרים עם גורמי BER שונים, גורמי שעתוק חלוציים ואנזימים משנים כרומטין.

NCPs שהורכבו כראוי (איור 2) שימשו ליצירת קומפלקס עם חלבון היתוך רקומביננטי של MBP-Polβ-APE1 (איור 3). כדי לקבוע את היחס בין NCP ל-MBP-Polβ-APE1 ליצירת קומפלקס יציב, ביצענו מבחני הסטת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) (איור 4), שהראו פס מוזז יחיד של NCP עם עודף מולארי של פי 5 של MBP-Polβ-APE1. במהלך האופטימיזציה של הפיכת קומפלקס זה, crosslinking עם glutaraldehyde היה קריטי כדי למנוע NCP להתפרק. בתחילה, הרכבה של קומפלקס NCP-Polβ-APE1 בוצעה ב...

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים באמצעות שתי שיטות להכנת דגימה להקפאת רשתות TEM.

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

מידע מבני על האופן שבו אנזימים לתיקון כריתת הבסיס מסירים נגעי DNA בהקשר של כרומטין היה נדיר. דבר זה מהווה פער משמעותי בהבנתנו את המנגנונים המעורבים באטיולוגיה של מחלות אנושיות. היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שיש לנו הכנת דגימות אופטימלית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.זה יאפשר לביוכימאים אחרים בתחום להשלים את עבודתם הביוכימית עם מחקרי cryo-EM אפשריים מבחינה טכנית. ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו גם כדי לחקור כיצד גורמים אחרים, כולל גורמי שעתוק חלוציים, מפעילים את הנוקלאוזום. זהו תחום שבו גם המידע המבני הוגבל.אופטימיזציה של הכנת הדגימה לפני המעבר לתנאי ההקפאה הייתה המפתח לקידום הפרויקט שלנו, וזה נעשה בצורה הטובה ביותר עם בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות בתנאי תכנון מצע, קשירה והצלבה. כדי להתחיל, לדגור על NCP ועל גורם תיקון הדנ"א של עניין על קרח במשך 15 דקות באמצעות חיץ אופטימלי עבור קומפלקס ספציפי. לאחר מכן, מוסיפים גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 0.005%לאחר ערבוב היטב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 13 דקות.יש להרוות עם Tris-CL טוחנת אחת לריכוז סופי של 20 מילימולרית Tris-CL עם pH 7.5. לאחר מכן, רכזים לכ-50 מיקרוליטר והחליפו את החיץ בחיץ הקפאה באמצעות עמודת התפלה. לאחר מכן, לקבוע את הספיגות בצפיפות אופטית 280 ו 260 ננומטר ולהתרכז עוד יותר במידת הצורך כדי להגיע 1.3 עד 3 מיליגרם למיליליטר מבוסס על צפיפות אופטית 280 ננומטר.לאחר הכנת כפתור הדיאליזה, הניחו את הכפתור המכיל את הדגימה על גבי מצע פוליאתילן גליקול כשהקרום פונה כלפי מטה. כדי לבצע את הטיהור לפי כרומטוגרפיית אי הכללת גודל, יש לשטוף ולאזן עמודת אי הכללת גודל עם 60 מיליליטר מים מזוקקים, ולאחר מכן 80 מיליליטר חיץ הקפאה למשך הלילה בקצב של 0.4 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, נתחו מיד את שברי השיא ורכזו את השברים המכילים את חלבון העירוי MBP-PolBeta-APE1 של ההיסטון.מי שתדגים את ההליכים הבאים תהיה אליזבת ויברט, מתלמדת לאחר הבגרות מליבת cryo-EM כאן ב-NIH. לאחר הפעלת מקפיא המים העמוקים ומילוי מכשיר האדים ב-50 מיליליטר מים מזוקקים, כוונו את טמפרטורת התא ל-22 מעלות צלזיוס ואת הלחות ל-98%, לאחר מכן הניחו את האתאן וכוס החנקן הנוזלי במחזיקי החלל המתאימים. לאחר מכן, כסו את האתאן במתקן מכסה האתאן ושפכו עליה בזהירות חנקן נוזלי תוך מילוי החנקן בחנקן נוזלי.כאשר רמת החנקן הנוזלי מתייצבת ומגיעה ל -100% והטמפרטורה מגיעה למינוס 180 מעלות צלזיוס, פתחו בזהירות את שסתום האתאן ומלאו את האתאן עד ליצירת בועה על המכסה השקוף. לאחר מכן הסר את מתקן האתאן. הניחו שני ניירות סינון על מכשיר הניקוי והדקו אותם באמצעות טבעת מתכת.עבור אל ההתקנה והגדר את פרמטרי הכתמים כמתואר בכתב היד, ולאחר מכן בחר A-Plunge ולחץ על אישור. במסך הראשי, לחץ על טען מלקחיים וטען אותם ברשת כאשר צד יישום הפחמן פונה שמאלה. כייל את המלקחיים, כוונן את ציר Z כדי להבטיח כתם מוצק. לחץ על החדר התחתון ולהחיל שלושה מיקרוליטר של המתחם.לאחר מכן לחץ על Blot A-Plunge, אשר יסובב את הרשת לכתם מהחזית ויצלול להקפיא אותו. לאחר ההעברה, אחסנו את הרשת בתיבת הרשת בתא החנקן הנוזלי. לאחר שכל ארבע הרשתות הוקפאו והונחו בתיבת הרשת, סובבו את המכסה למצב נייטרלי שבו כל הרשתות מכוסות על ידי המכסה והדקו את הבורג.לפני העמסת הדגימות במיקרוסקופ, הניחו את רשתות הזגוגית על טבעת ואבטחו אותה באמצעות אטב C תחת חנקן נוזלי בחדר מבוקר לחות כדי למנוע זיהום קרח. בעת טעינת המיקרוסקופ, הכנס את הרשתות לקלטת של 12 חריצים. ערבבו את הקלטת לתוך קפסולת ננו-מונית והעמיסו אותה לתוך המעמיס האוטומטי.לאחר מכן, העבירו את הרשת מהקלטת לשלב המיקרוסקופ. התאימו את הבמה לגובה אאוצנטרי על ידי נדנוד השלב ב-10 מעלות והזזת גובה Z בו זמנית עד להזזה מישורית מינימלית בתמונות. ברגע שמגיעים לגובה האוצנטרי, התחילו בהדמיה על ידי צילום תמונת מונטאז' 3 על 3 של הרשת שבה כל מונטאז' מצולם בהגדלה של פי 62 כדי לקבל את האטלס.לאחר בחירת שלושה ריבועים בגדלים שונים ולקיחת הגובה האוצנטרי, התמונה בהגדלה של פי 210. לאחר יצירת תמונה של ריבוע, בחרו חור אחד מכל אחד מהשוליים, מהמרכז וביניהם בתוך הריבועים. לאחר מכן, דמיינו כל חור בהגדלה של 2, 600x.צלם את תמונת ההגדלה הגבוהה ממרכז החור בהגדלה של 36, 000x ובזמן חשיפה של 7.1 שניות, 60 פריימים, גודל של 1.18 פיקסלים ומיקוד של שלושה מיקרומטר. צפו בתמונות מייצגות של ההקרנה. כדי לקבוע את היחס בין NCP ל- MBP-PolBeta-APE1 ליצירת מבחני שינוי ניידות אלקטרופורטיים מורכבים יציבים, שהראו פס מוזז יחיד של NCP עם עודף מולארי פי חמישה של MBP-PolBeta-APE1.בנפח קטן יותר, הרכבה של קומפלקס NCP-PolBeta-APE1 הראתה כי הדגימה הייתה מוצלבת יתר על המידה והביאה לצברים ללא קומפלקסים בודדים שניתן להבחין בהם. עם זאת, דילול של פי עשרה ב-NCPs הביא לירידה משמעותית בצבירה ולשיפור יציבות החלקיקים. ניתן לשלב את הג'ל המכין ואת שיטות אי הכללת הגודל כאשר ג'ל הכנה משפר את איכות NCPs כאשר הם מכילים כמות משמעותית של אגרגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה, ולאחר מכן טיהור של המתחם באמצעות אי הכללת גודל.התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בשתי השיטות באופן עצמאי כדי ליצור קומפלקסים יציבים. יתר על כן, הנתונים שנאספו משתי הרשתות מראים מחלקות דו-ממדיות כמעט זהות ומפות תלת-ממדיות ברזולוציה של כ-3.2 אנגסטרום. יחס אופטימלי של NCP לגורם תיקון DNA צריך להיקבע תחילה, ולאחר מכן cross-linking של המתחם עם glutaraldehyde צריך להתבצע לפחות 10 פעמים יותר מדולל מאשר הריכוז הדרוש להקפאה.לאחר קבלת מפה תלת-ממדית cryo-EM של המתחם, יהיה צורך בחידוד מבני נוסף כדי לקבוע כיצד נמצא גורם תיקון ה- DNA ולזהות אילו אזורים חשובים לאינטראקציות אלה.

preparation-nucleosome-core-particles-complexed-with-dna-repair

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה מוצגת לכינון מחדש של מערכי nucleosomal מודל מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. אנו גם מתארים כיצד ניסויי מהירות שקיעה בultracentrifuge האנליטיות, ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משמשים לניטור לאחר הכינון מחדש את מידת הרוויה מערך nucleosomal.

הרכבה של nucleosomal מערכים מההיסטונים ליבת רקומביננטי והנוקלאוזום המיקום DNA

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להמחיש דחיסת אן ארעי של כחוליות. טיפוח סינכרונית, פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הקפאה מהירה ו גבוה מתח הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה משמשים. פרוטוקול עבור מתודולוגיות אלה מוצג, יישומים עתידיים ופיתוחים הנדונים.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

למד הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות כרומטין ומנגנוני תיקון DNA ביולוגיה מבנית.

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים