Name: עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: למד פרוטוקול מותאם לתרבות תאי גזע המטופויאטיים לשימור תכונות שורשיות ושיפור שתילת תאים ערוכי גנים בחולי HIV. השיטה משפרת יעילות טיפול גני באמצעות תוספי ציטוקינים ומולקולות קטנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לצוות של מתקן ציטומטריה זרימה ומתקן בעלי חיים של CSCR. A. C. ממומן על ידי מלגת ICMR-SRF, K. V. K. ממומן על ידי מלגת DST-INSPIRE, ו- P. B. ממומן על ידי מלגת CSIR-JRF. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו (מענק מס' BT/PR26901/MED/31/377/2017 ו-BT/PR31616/MED/31/408/2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
<li>Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+clonal+tracking+reveals+intrinsic+heterogeneity+in+the+human+hematopoietic+stem+cell+compartment+and+culture-induced+stem+cell+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment.</a> Blood. 103 (2), 545-552 (2004).</li>
<li>Piras, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+escape+innate+sensing+but+trigger+p53+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).</li>
<li>Christopher, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+human+CD34%2BCD133%2BCD90%2B+hematopoietic+stem+cells+enhances+gene-modified+cell+frequency+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).</li>
<li>Karuppusamy, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR5+gene+edited+CD34%2B+CD90%2B+hematopoietic+stem+cell+population+serves+as+an+optimal+graft+source+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).</li>
<li>Hopman, R. K., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stem+cell+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in stem cell mobilization.</a> Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Hoffman, T. L. Counting Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+TL+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).</li>
<li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+the+human+b-globin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li>
<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Bagchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+immortalized+erythroid+progenitor+cell+lines+from+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells.</a> Cells. 10 (3), 1-18 (2021).</li>
<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים כלכליים מתחרים.

התוצאה המוצלחת של טיפול גנטי HSPC מסתמכת בעיקר על האיכות והכמות של HSCs הניתנים להשתלה בשתל. עם זאת, התכונות התפקודיות של HSCs מושפעות מאוד במהלך שלב ההכנה של מוצרי ריפוי גנטי, כולל על ידי תרבית חוץ גופית ורעילות הקשורה להליך מניפולציה גנטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה, זיהינו תנאי תרבות HSPCs אידיאליים השומרים על הגבעול של CD34+CD133+CD90+ HSCs בתרבות ex vivo. קבוצות מחקר רבות השתמשו ב-SR1 או ב-UM171 או במולקולות אחרות כמולקולות עצמאיות להרחבת דם טבורי (UCB) HSPCs במב...

חוסר הנגישות לתורמים תואמי אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) במסגרות השתלה אלוגניות והפיתוח המהיר של כלי הנדסה גנטית רב-תכליתיים ובטוחים ביותר הופכים את השתלת תאי הגזע ההמטופוייטיים האוטולוגיים (HSCT) לאסטרטגיית טיפול מרפאת בהפרעות הדם התורשתיות 1,2. טיפול גנטי אוטולוגי בגזע המטופויאטי ובתאי אב (HSPC) כולל איסוף של HSPCs של חולים, מניפולציה גנטית, תיקון מוטציות הגורמות למחלות והשתלת HSPCs מתוקנים גנטית לחולה 3,4. עם זאת, התוצאה המוצלחת של הטיפול הגנטי מסתמכת על איכות השתל המהונדס גנטית. שלבי מניפולציית הגנים ותרביית ex vivo של HSPCs משפיעים על איכות השתל על ידי הפחתת התדירות של תאי גזע המטופויאטיים ארוכי טווח (LT-HSCs), מה שמחייב עירוי של מינונים גדולים של HSPCs שעברו מניפולציה גנטית 2,5,6.
מספר מולקולות קטנות, כולל SR1 ו-UM171, משמשות כיום להרחבת HSPCs בדם טבוריבעוצמה של 7,8. עבור HSPCs בוגרים, בשל תפוקת התאים הגבוהה יותר המתקבלת בגיוס, אין צורך בהרחבה חזקה. עם זאת, שמירה על הגבעול של HSPCs מבודדים בתרבית ex vivo היא חיונית עבור יישומי הטיפול הגנטי שלה. לכן, גישה המתמקדת בהעשרת תרבית של תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) מפותחת באמצעות שילוב של מולקולות קטנות: רזברטרול, UM729 ו-SR1 (RUS)7. תנאי התרבית הממוטבים של HSPC מקדמים את העשרת תאי ה-HSCs, וכתוצאה מכך את התדירות המוגברת של תאי HSCs מהונדסים גנטית in vivo, ומפחיתים את הצורך במניפולציה של גנים במינונים גדולים של HSPCs, מה שמקל על גישות חסכוניות לטיפול גנטי8.
כאן מתואר פרוטוקול מקיף לתרבית HSPCs, יחד עם עירוי וניתוח של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg; X יחידה</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&TRADE; ערכת X (16 בארות נוקלאוקובט וסחר; רצועות)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>אנטי אנושי CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>אנטי אנושי CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>אנטי אנושי CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>אנטי עכבר CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Blood Irradator-2000</td><td>&nbsp; BRIT (המחלקה לביוטכנולוגיה, הודו)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים (צלחות 6 בארות שטופלו על פני השטח של דלתא)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>פתרונות CrysoStor CS10</td><td>BioLife</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60 מ"ג/10 מ"ל)-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it רקומביננטי Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צינור צנטריפוגה-15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צינור צנטריפוגה-50 מ"ל</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco &PRIME; s פוספט חוצץ מלח - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; ערכת בחירה חיובית CD34 אנושית II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>מגנט EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורזה</td><td>כתום הודו</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>ציטומטר זרימה &ndash; אריה III</td><td>BD BIOSCIENCE-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פלואו ג'ו&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>מגיב HighPrep DTR</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM מדיה</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>מנורת אינפרא אדום</td><td>מרפי-מזרק</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אינסולין 6 מ"מ 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>קטמין</td><td>קטמין 50</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>טוען צבע</td><td>6X TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רסן</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר ננו טיפה</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת תאים נויבאואר</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &מינוס;/&מינוס; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>צלחת דלתא 6 בארות</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 תמיסת נוקלאופקציה של תא ראשוני</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאי עכבר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור תחתון עגול (12 x 75 מ"מ)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>מכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>חילוץ מהיר וסחר; תמיסת מיצוי DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>כלי ניתוח ICE</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA פתרון חיץ (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>מסופק עם gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>קסילקסין - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

עריכת גנים crispr/cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 הוא כלי רב-תכליתי ויעיל ביותר לעריכת גנים שאומץ באופן נרחב לתיקון מוטציות גנטיות שונות. ההיתכנות של מניפולציה גנטית של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) במבחנה הופכת את HSPCs לתא מטרה אידיאלי לריפוי גנטי. עם זאת, HSPCs מאבדים באופן מתון את פוטנציאל החריטה והריבוי שלהם בתרבות ex vivo . במחקר הנוכחי מתוארים תנאי תרבית אידיאליים המשפרים את השתלת HSPC ומייצרים מספר גדל והולך של תאים מהונדסים גנטית in vivo. הדו"ח הנוכחי מציג תנאים אופטימליים בתרבית מבחנה, כולל סוג המדיה של התרבית, תוספת קוקטיילים ייחודית של מולקולות קטנות, ריכוז ציטוקינים, צלחות תרביות תאים וצפיפות תרבית. בנוסף לכך, הליך עריכת גנים ממוטב של HSPC, יחד עם אימות אירועי עריכת הגנים, מסופקים. לצורך אימות in vivo , מוצגים עירוי HSPCs בעריכה גנטית וניתוח לאחר חריטה במקבלי עכברים. התוצאות הראו כי מערכת התרבית הגבירה את התדירות של HSCs תפקודיים במבחנה, וכתוצאה מכך השתלה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.

המחקר הנוכחי מזהה תנאי תרבית HSPC אידיאליים המאפשרים שמירה של CD34+CD133+CD90+ HSCs בתרבית ex vivo. כדי להדגים את העשרת התרבית של HSCs יחד עם הדור המשופר של תאי HSCs מהונדסים גנטית, מסופקים ההליכים הממוטבים לבידוד PBMNC, טיהור תאי CD34+, תרבית, עריכת גנים, השתלה, אפיון השתלה ותאים מהונדסים גנטית in vivo (איור 1). לאחר הטיהור, בוצעה הערכת ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את סמני HSPC, ו- HSPCs תורבתו במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות של תרבית...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אופטימלי של תרבית גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPC) לחריטה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.

עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

תרבית Ex vivo יכולה לעכב את פוטנציאל ההתפשטות מחדש של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים. הפרוטוקול שלנו משמר את הגבעול במהלך התרבית ובכך משפר את התדירות של תאים מהונדסים גנטית in vivo. טיפול גנטי בתאי גזע המטופויאטיים משמש כיום למחלות מונוגניות ומחלות זיהומיות כמו HIV.פרוטוקול הטיפול הגנטי HSPC מסתמך במידה רבה על תרבית ex vivo. הפרוטוקול שלנו צריך להיות תואם לכל הליך המשתמש בתרבות ex vivo. מי שידגים את הפרוטוקול הזה יהיה ויגנשוואראן ונקאטסאן, דוקטורנט מהמעבדה שלי.לאחר בידוד תאי ה-HSPCs, תרבו אותם בתרבית תאי גזע המכילה ציטוקינים ומולקולות קטנות רזברטרול, UM729 ו-StemRegenin1. לפני עריכת גנים, הגדר את ה- ThermoMixer ב- 37 מעלות צלזיוס כדי לשחזר את הרנ"א המנחה, ולאחר מכן לחמם מראש את חיץ TE ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה של בקבוקון sgRNA סינתטי שעבר שינוי כימי ב 11, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס ולהוסיף 15 microliters של חיץ TE לבקבוקון המכיל 1.5 ננומולר של sgRNA lyophilized ומערבבים על ידי מערבולת עדינה כדי לקבל ריכוז סופי של 100 picomolar לכל מיקרוליטר.יש לדגור על הבקבוקון ב-ThermoMixer עם ניעור מינימלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 40 שניות. הקישו בעדינות על הבקבוקון בצדדים וסובבו את הבקבוקון כדי לאסוף 15 מיקרוליטרים של sgRNA. הפוך 1-microliter aliquots ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד 1 שנה.עבור נוקלאופקציה, גלולה 2 פעמים 10 לתאים 5 על ידי צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופר-נטאנט, יש לתלות את הכדור ב-20 מיקרוליטרים של החיץ. ערבבו בעדינות את מתלה התא עם קומפלקס ה-RNP המוכן תוך הימנעות מבועות אוויר.כעת, העבר את ההשעיה לרצועת הנוקלאופקציה המסחרית וחשמל את התאים באמצעות 4D-Nucleofector על ידי בחירת קוד הדופק DZ-100. לתאים האלקטרופואטים ברצועת הנוקלאופקציה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיית תרבית מודגרת מראש והשאירו את התאים ללא הפרעה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה מעבירים את התכולה לצלחת התרבית בהתאם לדרישות הניסוי.הניחו את עכברי ה-NSG בכלובי הפאי 6 עד 8 שעות לפני השתלת HSPC. הקרן את העכברים בעוצמה של 3.5 אפור באמצעות הקרנה מסחרית. עבור NBSGW, מצב מקדים של עכברים זכרים ונקבות בני 6 עד 8 שבועות על ידי הזרקה תוך-צפקית של בוסולפן במינון של 12.5 מיליגרם לק"ג משקל גוף 48 שעות לפני השתלת HSPC.להשראת עכבר אחד, גלולה 6 פעמים 10 לתאים ה -5 בצינור 1.5 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר. הוציאו בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והחזירו את כדור התא ב-100 מיקרוליטרים של PBS.הנח את עכברי NSG או NBSGW המותנים מראש במרסנת העכבר והחדירו את ה- HSPCs על ידי הזרקת וריד זנב. החזק את זנב העכבר ודחף בעדינות את התקע כדי לרסן את העכבר. נגבו בעדינות את זנב העכבר עם 70% אתנול.באמצעות מזרק אינסולין 31 מד, לשאוף 100 microliters של ההשעיה התא. כעת, כוון את האור ממנורת האינפרא אדום אל הזנב למשך 30 עד 40 שניות, וכיסה את אזור הגוף של העכבר בקפלי נייר טישו. כדי לשמור על הזנב בציר הפלנר עם המזרק, הרם אותו עם האצבע המורה השמאלית.הכנס בעדינות את החלק המשופע של המחט לתוך וריד הזנב השמאלי או הימני בזווית של 20 מעלות. לדחוף את הבוכנה כדי להחדיר את ההשעיה התא לתוך הווריד ולהפעיל לחץ עדין ליד האזור מנוקב עם נייר טישו ולשלוף את המחט. לאחר ההרדמה, מקם את החיה בשכיבה גחונית ושפשף בעדינות את העכברים כדי לפתוח את העין, מה שמאפשר לכדור הארץ של העין לבלוט מעט.מכניסים בעדינות את פיפטה המרעה בזווית של 30 עד 45 מעלות לתוך הקנטוס המדיאלי של העין מתחת לקרום הניקטינג. לאחר הצבת פיפטה פסטר במיקום הנכון, הפעל לחץ קל על הצינור והתחל לסובב את הצינור בעדינות. לאחר איסוף 50 עד 80 microliters של דם היקפי, בעדינות למשוך את פיפטה מן canthus המדיאלי של העין.לאחר המתת חסד, לבצע חתך אנכי 1 ס"מ מעל השופכה ולהאריך עד 1 ס"מ מתחת לסרעפת. חותכים אופקית בפינות האזור המשופע כדי לפתוח את אזור הבטן. לאחר כריתת עצם הירך והשוקה, השתמשו במספריים כדי להסיר את הרקמות הרכות המחוברות לעצם הירך ולטיביה ושפשפו בעדינות את העצמות בעזרת נייר טישו.השתמש באזמל כדי ליצור חור קטן בקוטר שאינו עולה על 0.2 ס"מ בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. הסר את הקצוות הפרוקסימליים של העצמות באמצעות אזמל והנח את העצמות כאשר הצד החתך פונה לכיוון החור של צינור הצנטריפוגה המיקרו 0.5 מיליליטר. כעת, הניחו את צינור ה-0.5 מיליליטר עם העצמות בצינור ה-1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי.סוגרים את המכסה, מסובבים את הצינורות ב-200 פעמים גרם למשך 3 דקות בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר ומשליכים את צינורות ה-0.5 מיליליטר המכילים עצמות עם חלל מח ריק. לצינור התגובה של 1.5 מיליליטר המכיל מח עצם, הוסף 1 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן באמצעות פיפטה של 1 מיליליטר, השהה בעדינות את התאים 10 פעמים. העבר 1 מיליליטר של מתלה התא לצינור 15 מיליליטר המכיל 9 מיליליטר של חיץ ליזה RBC.דגירה של התאים בקרח למשך 7 דקות על ידי היפוך עדין של הצינור כל שתי דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולחזור על הכביסה עד כדור לבן בהיר ברור הוא ציין. התדירות של תאים חיים ותאים חיוביים ל-CD34, חיוביים ל-CD90, עלתה בקבוצת ה-RUS לאחר 48 שעות של נוקלאופקציה.לאחר 72 שעות, אחוז ותדירות האינדל עלו בקבוצה שטופלה ב-RUS בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-DMSO, מה שמרמז על עלייה בעריכת גנים. המספר האבסולוטי של תאים חיוביים ל-CD34, תאים חיוביים ל-CD90 ותאים בעלי גרעין כולל גבוה משמעותית 48 שעות לאחר העריכה. ניתוח ציטומטריה של זרימה של תאים חיוביים ל-CD45 אנושיים בעכברי NSG הראה השתלה מוגברת בתנאי התרבית.ניתוח של תדירות עריכת הגנים בתאי ה-BM של העכבר הראה חריטה מוגברת של HSPCs שעברו עריכה גנטית בתנאי תרבית של תוספי RUS. גידול ה-HSPCs במפגש של 200, 000 תאים למ"ל הוא חיוני לשיפור תאי הגזע המתפקדים. הגברת תאי הגזע של הדם הטבורי ותאי הגזע שמקורם ב-iSPC הם התחומים החדשים שבהם פרוטוקול זה נבדק.

crisprcas9-gene-editing-hematopoietic-stem-progenitor-cells-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

ג'ין יישוב עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 הנחתה במידה רבה את ההבנה של פונקציות ביולוגיות של גנים. כאן, אנו מנצלים את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 כדי דגם calreticulin מוטציות בתאים hematopoietic תלויי-ציטוקין לשם פעילותם oncogenic למידה.

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לזהות גנים מועמדים החיוניים ליכולת ההתפשטות החריגה של תאי גזע ואב המטופויאטיים.

הערכה של גנים חריגים הקשורים לגדילה של תאי גזע ואב המטופויאטיים על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם ספירת תאים

למד פרוטוקול מותאם לתרבות תאי גזע המטופויאטיים לשימור תכונות שורשיות ושיפור שתילת תאים ערוכי גנים בחולי HIV. השיטה משפרת יעילות טיפול גני באמצעות תוספי ציטוקינים ומולקולות קטנות.

עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

גלה סרטונים נוספים