זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a
23 בדצמבר 2022
בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.
הואנג בינג ארוך, מקוצר כמו HLB. זו מחלת הדרים הרסנית ברחבי העולם. במדינות המייצרות ביותר הדרים, כמו סין וארה"ב, HLB נגרם על ידי החיידק המוגבל בפלואם Candidatus Liberibacter asiaticus, המכונה בקיצור CLas.
גילוי מוקדם של CLas היה חשוב למגדלים כדי להקל על התערבות מוקדמת ולמנוע התפשטות מחלות. אז כאן פיתחנו שיטה חדשה לאבחון HLB מהיר ונייד, בשילוב עם הגברה של רקומבינאז פולימראז ומערכת CRISPR-Cas12a. קראנו לזה CLas-DETECTR.
הרגישות של הפלטפורמה שלנו גבוהה בהרבה מ- PCR. יתר על כן, הוא מראה תוצאה דומה עם qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות העלים. בהשוואה לגילויי CLas הקונבנציונליים, ניתן לסיים את השיטה שלנו תוך 90 דקות, והיא עובדת במצב איזותרמי.
ניתן גם לדמיין את התוצאה באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח. ה- CLas-DETECTR מכיל ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א ותוצאות הדמיה. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת כאן.
מאגר A, פתרון B ופתרון C מוכנים כמתואר בפרוטוקול. כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול E.coli שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA. עלי הדרים משמשים בכלי.
מנקבים את החתיכות המעטות של דיסקיות העלה מהעלה. שים דיסקיות עלים לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ A לתוך הצינור.
טוחנים את דיסקיות העלים עד לקבלת מרקם חלק בעזרת מוט פלסטיק ידני. השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. הסופר-נטנט מוחל לאחר מכן על הגברה של הדנ"א.
להגברת DNA איזותרמית, הוסיפו מיקרוליטר אחד של סופרנטנט משלב 2.3 ומיקרוליטר אחד של מגנזיום אצטט לתמיסה B וערבבו היטב. במעבדה, לדגור אותם באינקובטור פשוט ב 37 מעלות במשך 15 דקות. כדי להמחיש את התוצאות, הוסיפו 10 מיקרוליטר של התערובת משלב 3.2 לתמיסה C וערבבו היטב.
לדגור אותם בחממה 37 מעלות במשך 60 דקות. הרכיבו משקפי מגן, והתבוננו באות הפלואורסצנטי הירוק באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני. כדי לבחון את הספציפיות של CLas-DETECTR, המושבות הטהורות הראשונות של אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp.
citri שהוא הפתוגן של קנקן ההדרים וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודדו במעבדה שלנו שימשו לחילוץ הדנ"א הגנומי שלהם. לאחר מכן, הדנ"א הגנומי של שלושת החיידקים והדנ"א הגנומי של ניוהול חיובי ל-CLas, היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR. כדי לבחון את הרגישות של CLas-DETECTR, זוהתה סדרה של דילולים של מקטעי דנ"א של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר בפרוטוקול לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות את נוכחות ה- CLas בשדה.
דגימות עלים שנאספו מעץ תפוז מתוק של ניוהול שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. qPCR, שיטת זיהוי CLas משכנעת המשמשת בדרך כלל במעבדה יושמה גם היא. דגימות העלים מעץ ניוהול הנגוע ב-HLB ומעץ ניוהול שאינו נגוע ב-HLB, שבו אושרה נוכחות ה-CLas במעבדה שלנו, היו נתונות לבדיקת CLas-DETECTR.
אות הפלואורסצנציה הירוק נלכד בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בבקרה הלא נגועה והשלילית של HLB. קבענו את הספציפיות של CLas-DETECTR באמצעות חומצות גרעין המופקות מחיידקים אחרים. בבדיקת CLas-DETECTR, רק gDNA שחולץ מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas הדגים אותות פלואורסצנטיים ירוקים.
gDNA המופק מ- Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ו- Burkholderia stabilis זן 1440 לא, מה שאומר ש- CLas-DETECTR יכול לזהות CLas באופן ספציפי. בדקנו גם את הרגישות של CLas-DETECTR באמצעות סדרה של דילולי דנ"א CLas, המפורטים בפרוטוקול.
PCR יכול לזהות 201 עותקים למגה-ליטר. מצד שני, CLas-DETECTR יכול לזהות 2.01 עותקים למגה-ליטר, מה שמרמז על זמינותו כאבחון שדה רגיש. qPCR יכול לזהות 0.201 עותקים למגה-ליטר וערך ה-Ct גבוה מ-36.
אז CLas-DETECTR הוא שני סדרי גודל רגישים יותר מאשר PCR מסורתי וסדר גודל אחד פחות רגיש מאשר qPCR כאשר נעשה שימוש באמפליקונים ספציפיים של CLas מדולל. לבסוף, בחן מחדש את ההיתכנות של CLas-DETECTR לדגימות שדה, והשווה את רגישותו ל- qPCR. במספרים, אנו רואים.
אנו יכולים לראות כי ערך Ct גבוה מ 36 כאשר ריכוז CLas הוא פחות מ 0.2 עותקים למגה ליטר, שהוא ריכוז נמוך מאוד. מבין 15 הדגימות, ערך ה-Ct של הדגימות 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ו-14 שזוהו על ידי qPCR היה פחות מ-36. נצפתה לכאורה אותות פלואורסצנטיים ירוקים.
מצד שני, כאשר ערך ה- Ct של הדגימות 6, 7, 9, 12 ו- 15 שזוהו על ידי qPCR לא נקבע, לא נצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים. בנוסף, אותות פלואורסצנטיים ירוקים חלשים נצפו כאשר ערך ה- CT של מדגם 5 ו - 11 שזוהה על ידי qPCR היה גבוה מ -36. התוצאות יצביעו על כך שהפלטפורמה שלנו היא כלי מהיר, חזק ורגיש לאבחון HLB בתחום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתייחס לצורך באיתור מהיר ומדויק של Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), הסוכן הגורם ל-Huanglongbing (HLB) בצמחי הדר. שיטה חדשה, המכונה CLas-DETECTR, משלבת הגברה באמצעות רקומבינאז פולימראז עם טכנולוגיית CRISPR-Cas12a, ומאפשרת בדיקה ניידת ורגישה בשטח.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המחקר
- פתולוגיה של צמחים
- דיאגנוסטיקה בחקלאות
- גנטיקה מיקרוביאלית
רקע
- Huanglongbing (HLB) משפיע באופן חמור על ייצור ההדר ברחבי העולם.
- גילוי מוקדם של CLas הוא קריטי למניעת התפשטות המחלה.
- שיטות עכשוויות כמו PCR יש להן מגבלות, ונדרשת שיפור ליישום בשטח.
שיטות ששימשו
- הגברה באמצעות רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a
- דגימות שדה של עלי הדר שימשו לבדיקה.
- טכנולוגיית איתור פלואורסצנטי להמחשת התוצאות.
תוצאות עיקריות
- CLas-DETECTR הראה רגישות גבוהה משמעותית בהשוואה ל-PCR רגיל.
- פלואורסצנציה ספציפית נצפתה אך ורק בדגימות CLas-חיוביות.
- השיטה יכולה להניב תוצאות תוך 90 דקות בתנאים איזותרמיים.
מסקנות
- המחקר מדגים ש-CLas-DETECTR הוא כלי אבחון חזק ורגיש להלב.
- שיטה זו יכולה לאפשר התערבויות מהירות לניהול יעיל של מחלות הדר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid, field-deployable detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) addresses a critical bottleneck in agricultural pathogen surveillance, enabling earlier intervention and containment of Huanglongbing (HLB) outbreaks. The integration of recombinase polymerase amplification with CRISPR-Cas12a delivers high sensitivity and specificity, supporting confident decision-making at the point of need. This diagnostic advancement enhances predictive confidence and operational agility for disease management pipelines in agri-biotech portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in plant systems.
- Supports functional validation of detection targets through CRISPR-based specificity.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing CLas from other citrus pathogens.
- Improves predictive confidence for early-stage intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant DNA extracts for downstream diagnostic workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence readouts.
- Enables scalable, field-ready screening without laboratory PCR infrastructure.
- Supports reliable evaluation of sample status for rapid triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns diagnostic outputs with disease-relevant field conditions for translational continuity.
- Bridges laboratory assay performance with real-world sample variability.
- Reduces risk in advancing detection platforms toward broader agricultural deployment.
- Provides mechanistic de-risking by confirming target specificity in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through field validation, supporting workflows from hypothesis testing to actionable diagnostics in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms pathogen presence and specificity using CRISPR-Cas12a-mediated detection.
- Screening: Offers rapid, reproducible, and quantitative fluorescence outputs for sample triage.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and comparative performance data versus PCR and qPCR.
- Translational Research: Demonstrates continuity from laboratory validation to field deployment in citrus samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, reusable diagnostic platform adaptable to other plant pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Enables standardized, rapid, and field-deployable diagnostics without complex instrumentation.
- Strategic Value: Supports timely go/no-go decisions for disease management and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and isothermal amplification techniques.
- Needs access to handheld fluorescence detection devices for field visualization.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and assay execution.
- Adaptable to various plant matrices with protocol optimization.
- Limited by the need for CRISPR-Cas12a reagents and fluorescence-compatible infrastructure.
