הדמיה של לוקליזציה תת-תאית של חלבון בלב באמצעות תיוג חיסוני בתיווך נקודות קוונטיות ואחריו מיקרוסקופיית אלקטרונים

קביעת הלוקליזציה התת-תאית של חלבון היא קריטית להגדרת תפקודו התקין והמנגנונים המעורבים בו. שיטה זו יכולה לעזור לנו לדמיין את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון ברמת המבנה האולטרה. חיסוניות בתיווך נקודות קוונטיות יציבות יותר, עמידות בפני הלבנה, יש להן ספקטרום פליטה משלה, הן מניבות צפיפות אלקטרונים גבוהה ומציגות יעילות ושמירה גבוהות יותר על רקמות עם חדירה טובה יותר ברקמות.

שלבים מרובים בתהליך, כלומר קיבוע, תחריט, חסימה וריכוז נקודות קוונטיות אופטימלי, הם שלבים מאתגרים לאופטימיזציה. מומלץ לנסות מספר נקודות זמן וריכוזים של הריאגנטים המשמשים. אתגר נוסף הוא הטיפול ברשתות שעבורן רק סבלנות וכמובן תרגול עובדים.

המדגימים את הנוהל יהיו צ'אודהורי עבדאללה, עמית דואר, נזנין רמקס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, וברנדון הרטמן, מפקח מיקרוסקופיית אלקטרונים משירותי מיקרוסקופיית האלקטרונים שלנו. לאחר הרדמת העכברים ופתיחת חלל החזה, פזרו את הלב באמצעות קור כקרח 3% גלוטראלדהיד ב-0.1 טוחנת של חיץ נתרן קקודילאט למשך שתי דקות. השתמש במחט 25 מדידה של חמישה על שמונה אינץ 'כדי להכניס את המקבעים ללב באמצעות לחץ הכבידה.

מיד לאחר שהלב מתחיל להתמלא בקיבוע, הרימו את פסגת הלב כדי להקל על הלחץ. חותכים את כלי הדם שמתחת במילימטר אחד עד שניים מהלב ומאפשרים לנוזלים להתנקז. לנתח את הלב.

מוציאים את האטריה ומפילים את החדרים לתוך צלחת פטרי המכילה 3% גלוטראלדהיד קר כקרח ו-0.1 נתרן קקודילאט טוחן. עושים חתך פרפר לאחר 30 עד 60 דקות של קיבוע ומניחים את החדר בחזרה בצלחת פטרי. קוצצים את הלב באמצעות להב כירורגי בקוביות קטנות של מילימטר מעוקב אחד.

לתקן ולטבול את רקמת הלב המנותקת בתמיסת גלוטראלדהיד וקקודילאט למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות של קיבוע, לשטוף את הרקמה ב 0.1 טוחנת נתרן cacodylate חיץ פעמיים במשך 20 דקות. הסר את הרקמה ממאגר נתרן קקודילאט וטבל בתמיסת 2% אוסמיום טטרוקסיד למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר האוסמיקציה, יש לטבול את הרקמה בתמיסת 2% נתרן אצטט למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לטבול את הרקמה בתמיסת 2% אורניל אצטט למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הכתמת אורניל אצטט, לייבש את הרקמה ברצף דרך האלכוהולים המדורגים והאצטון.

הטמעת הרקמה המיובשת בשרף אפוקסי בעל צמיגות נמוכה כמתואר בכתב היד. הכניסו את הרקמה לשרף טרי בתבניות מיקרו של שמונה מילימטרים ורפאו את הרקמה המשובצת בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מציאת אזור העניין, באמצעות סכין אולטרה 45 מעלות, לייצר קטעי זהב חיוור ultrathin.

מקם את החלקים האולטרה-דקים האלה בצד העמום של רשת נחושת של 200 רשת. התחילו את הכתמים על ידי חשיפת האנטיגן על ידי הצבת 20 מיקרוליטרים של תמיסת תחריט על סרט פרפין נקי. מניחים את הרשת המיובשת עם מקטעי רקמות על טיפת תמיסת התחריט.

השאירו את רשת הקטע על התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את מקטעי רקמות חרוט על ידי הנחתם על טיפה של מים מזוקקים במשך 60 שניות. חסום את שאריות האלדהידים על ידי הנחת רשת המקטע על טיפה של תמיסת גליצין טוחנת 0.05 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הכתימו את קצוות הרשת על נייר סינון כדי להסיר את תמיסת הגליצין השיורית. מקם את רשת הקטע ב 10 עד 20 microliters של פתרון חסימה במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. הכתימו את קצוות הרשת על נייר סינון והניחו את חלקי הרשת על דילול נוגדנים לריכוך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לדגום את קטעי הרשת עם נוגדן ראשוני במשך שעה אחת 30 דקות בחדר לחות. כתם לייבש את הרשת ולשטוף את חלקי הרשת עם דילול נוגדנים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. דגירה של חלקי הרשת עם נוגדן משני ביוטינילציה למשך שעה אחת בחדר לחות.

לאחר שהרשת מיובשת, שטפו את חלקי הרשת בנוגדן מדולל פעמיים למשך חמש דקות כל אחד. לדגום את מקטעי הרשת ב- QD מצומד סטרפטווידין זמין מסחרית למשך שעה אחת בתא בטמפרטורת החדר. מנעו חשיפה לאור על ידי כיסוי התא ברדיד אלומיניום.

לאחר ייבוש קצוות הרשת באמצעות נייר סינון, יש לשטוף את חלקי הרשת על ידי הנחתם על טיפות מים למשך שתי דקות ולהכתים את קצוות הרשת לייבוש. הכנס את מחזיק הדגימה לעמודת המיקרוסקופ והפעל את מתג המשאבה כדי להעריך את הגוניומטר, ולאחר מכן הכנסה מלאה של מחזיק הדגימה בעמודת המיקרוסקופ. התמקדו היטב באזור הרצוי.

צלם את התמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה ושמור את הקובץ בפורמט tif. הממברנות המיטוכונדריאליות, הליזוזומים והרטיקולום האנדופלסמי או הממשק המיטוכונדריאלי של קרום הרשתית הסרקופלסמית הראו נוכחות של Sigmar1 המסומנות כנקודות קוונטיות. מקטעי לב הודגמו באמצעות אימונוגלובולין G ארנב ונקודות קוונטיות כבקרת איזוטיפ לנוגדן ראשוני נגד ארנב Sigmar1.

אחד הדברים החשובים שיש לקחת בחשבון בזמן העבודה על פרוטוקול זה הוא חשיפת זמן לאנטיגן. אם מקטעי הרקמה חרוטים במשך זמן רב מדי, תמיסת המטא-פריודיאט תיצור נקבים בחתכי רקמה דקים. תיוג קוונטי בתיווך נקודות צובר תשומת לב בזיהוי גידולים, פרופיל מולקולרי של גידולים ומצב חיסוני, והדמיית רקמות הסוללת דרך חדשה לאבחון רפואי.

נקודות קוונטיות שימושיות גם בטיפול בגידולים באמצעות טיפולים פוטודינמיים ואנומליות עיניים על ידי אספקת תרופות לעיניים.