סינתזה מיקרופלואידית של אבני בניין מיקרוג'ל עבור פיגום חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים

ייצור התפוקה הגבוהה של אבני בניין של מיקרוג'ל חד-ג'ל עבור פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים מספק שליטה משופרת בנקבוביות הפיגומים. זה יכול להשפיע על גודל הנקבוביות ועל תוצאות שילוב הרקמות הבאות. פרוטוקול זה משתמש בגישה מיקרופלואידית בתפוקה גבוהה כדי ליצור כמויות גדולות של מיקרו-ג'לים חד-ממדיים שלא ניתן להשיגם בשיטות אחרות כגון מיקרופלואידיקה ממוקדת זרימה, תחליב אצווה ואלקטרו-ריסוס.

המיקרוג'לים הנוצרים יכולים להיווצר לפיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים המהווים יתרון ליישומי רפואה רגנרטיבית בשל נקבוביות קנה המידה של התאים המאפשרת רקמה וצמיחה מהירה. התחל בהכנת שקופית זכוכית אחת לכל התקן מיקרופלואידי PDMS. השתמשו בנייר דבק, באוויר מסונן או בשטיפת אלכוהול איזופרופיל כדי להסיר אבק מהמגלשה.

הנח שקופית זכוכית בשקופית עיצוב של התקן PDMS אחד ליד השני על מכסה צלחת של 96 בארות והנח אותה במנקה פלזמה. סגרו את הדלת ואת שסתום זרימת האוויר והפעילו את משאבת הוואקום. תן לו לפעול במשך 30 שניות לפחות, ולאחר מכן כבה אותו.

חבר את צינור הגז של מיכל החמצן לשסתום זרימת האוויר. תן לתא הפלזמה להתמלא בחמצן למשך 30 שניות, ולאחר מכן כבה את החמצן וסגור את שסתום זרימת האוויר. הפעל את משאבת הוואקום והגדר את רמת תדר הרדיו לגבוהה.

המתן עד שהתא יהפוך לצבע ורוד סגול ותן ל-30 שניות לעבור. כאשר הטיימר כבה, כבה את הפלזמה ואת הוואקום, ולאחר מכן פתח באיטיות את שסתום זרימת האוויר כדי לשחרר את הוואקום. הסר את המגש ממנקה הפלזמה.

הפוך בעדינות את התקן PDMS על שקופית הזכוכית כדי לחבר אותם. כאשר מתרחשת הדבקה, שימו לב להבדל הקל בשקיפות של ה-PDMS. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לאחסן את המכשירים המחוברים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עד מיד לפני השימוש.

הכן את טיפול פני השטח על ידי דילול PFOCTS ושמן Novec והשתמש במיליליטר אחד לשלושה עד ארבעה מכשירים. מעבירים את הנפח למזרק של מיליליטר אחד ומחברים מחט של 25 מד. חתכו חתיכת צינורות טייגון באורך 10 עד 12 ס"מ לכל מכשיר.

חותכים חתיכת צינורות הצצה באורך של כסנטימטר אחד. הכנס כמה מילימטרים של צינורות PEEK לקצה צינורות טייגון כדי למנוע מהמחט לנקב את פתחי צינורות טייגון. הוציאו את המכשירים מהתא המחומם והכניסו את הקצה שאינו מציץ של צינורות טייגון לתוך חור הכניסה המיימי.

הכנס את המחט של מזרק טיפול פני השטח לתוך צינורות PEEK ולכסות את חור מוצא תא השמן. הזריקו את הטיפול באיטיות וודאו שהוא ממלא את המכשיר ללא בועות. המתן עד שהתאים המימיים יתמלאו תחילה, לאחר מכן הערוצים הקטנים יותר ולאחר מכן תא השמן.

הסר את צינורות טייגון מהמכשיר. לאחר מילוי המכשיר, תנו לו לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מלאו מזרק של חמישה מיליליטר בשמן בלבד והצמידו מחט של 25 מדדים.

שאפו את טיפול פני השטח אל מחוץ למכשיר דרך הכניסות והשקעים. הכנס צינורות טייגון לתוך המפרצון המיימי. הכנס את המזרק עם שמן לתוך צינורות PEEK ולשטוף כל מכשיר עם שמן.

שאפו את השמן מתוך המכשיר. חוזרים על שטיפת השמן פעמיים ומסירים את צינורות הטייגון. הכנס את הקצה שאינו PEEK של צינורות Tygon לתוך הכניסות של התקנים microfluidic.

הכנס את החלק הנותר של צינורות טייגון ללא צינורות PEEK בקצה לשקע המכשיר המיקרופלואידי. מוסיפים לפחות שלושה מיליליטר שמן למזרק פלסטיק של חמישה מיליליטר ומחברים אותו למחט של 25 מטר. הכנס בזהירות את המחט לתוך צינורות PEEK על אחד הפתחים Tygon.

שטפו בעדינות את הצינורות והמכשיר בשמן. לאסוף את השמן מן השקע בצינור חרוטי. חזור על שטיפת השמן בכניסת טייגון השנייה.

הגדר את משאבות המזרק לקצבי הזרימה הרצויים. חברו את המזרק המכיל את החומר פעילי השטח לכניסת השמן באמצעות מחט של 25 מדים ושפכו בעדינות מספיק שמן כדי להכין את הצינורות ואת תעלת השמן של המכשיר המיקרופלואידי. לאחר הגדרת המכשיר וכניסת השמן, הוסיפו 0.5 מיליליטר שמן למזרק חדש של חמישה מיליליטר שיכיל את מבשר הג'ל.

השתמש בכמות קטנה זו של שמן כדי לעזור לשטוף את הפתרון המבשר דרך המכשיר microfluidic. בצינור חרוטי, לשלב 1.5 מיליליטר של תמיסת עמוד השדרה PEG ו 1.5 מיליליטר של תמיסת cross-linker. מערבלים במשך 30 שניות ומעבירים במהירות את תמיסת מבשר הג'ל המשולבת למזרק חמשת המיליליטר.

חבר את המזרק עם תמיסת מבשר הג'ל לכניסה המימית באמצעות מחט 25 מד. פזרו בעדינות מספיק תמיסה כדי להכין את הצינורות ואת הערוץ המיימי. מהדקים את המזרקים על משאבות המזרקים ולוחצים על ההפעלה.

חפשו חלקיקים בגודל אחיד מהערוצים. לאסוף את microgels מן השקע בצינור חרוטי. לאחר השלמת הג'לציה, השתמש בפיפטה כדי להסיר בזהירות את שלב השמן מתחתית הצינור.

הפקידו זאת במיכל פסולת מתאים לפסולת פלואור. הוסיפו עוד שמן לצינור איסוף המיקרוג'ל. מערבבים על ידי היפוך עדין של צינור האיסוף.

תנו לצינור האיסוף להתיישב במשך חמש דקות כדי לאפשר לשלבים להיפרד. חפשו את שלב השמן בתחתית ואת פאזת המיקרוג'ל המימית בחלק העליון. חוזרים על שטיפות השמן לפחות פעמיים נוספות.

הוסיפו עוד שמן עם הג'ל כפי שהודגם קודם לכן, ולאחר מכן הוסיפו PBS לג'ל. הפוך כדי לערבב מספר פעמים. כדי להפריד את השכבות, צנטריפוגה את הצינור ב 2, 000 RCF במשך כ 30 שניות.

חפשו את שלב השמן בתחתית הצינור, ג'ל באמצע ו-PBS למעלה. הסר את שלב השמן עם פיפטה והשלך אותו למיכל פסולת. יש לחזור על השמן ולשטוף PBS פעמיים.

חפשו את הג'ל שיעבור מאטום לשקוף עד הכביסה הסופית. הסר את כל השמן. אין להסיר PBS מהצינור החרוטי.

במכסה אדים כימי, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף הקסנים לצינור בנפח שווה ל- PBS. מערבבים את הצינור החרוטי במשך 30 שניות או עד שהוא מעורבב היטב. צנטריפוגה ב 4, 696 RCF במשך חמש דקות.

לאחר ההפרדה, חפשו הקסנים בשכבה העליונה, PBS באמצע וג'ל בתחתית. מוציאים את שכבת ההקסאן ומשליכים אותה למיכל לפסולת אורגנית. שאפו את ה-PBS.

יש לחזור על השימוש בהקסאן בשטיפת PBS לפחות פעמיים או עד שהג'ל נראה כמעט שקוף. שטפו את הג'ל עם PBS פעם נוספת כדי להסיר את שאריות ההקסאן שנותרו. צנטריפוגה ב 4, 696 RCF במשך חמש דקות ולשאוף את שכבת PBS.

כ-67-75% מ-20 קילו-דלטון PEG מלמיד שונו עם קבוצות פונקציונליות של מתקרילאמיד כדי להבטיח יעילות חישול גבוהה. אחוז השינוי נקבע על ידי ניתוח פסגות ספקטרום NMR 1H. תחילת הג'לציה סיפקה תובנה לגבי משך ייצור המיקרוג'ל המיקרופלואידי.

מומלץ לבחור pH מבשר ג'ל שיכול ליזום gelation בין 30 דקות לשעתיים. לאחר טיהור ונפיחות, למיקרוג'לים היה גודל אחיד ומדד פולי-פיזור בין 1.00 ל-1.02 שהוגדר כאוכלוסייה חד-ממדית. לאחר החישול, המיקרוג'לים יצרו פיגום נקבובי שהודגם באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים.

הצמדה נכונה של התקן ה-PDMS למגלשת הזכוכית וטיפול נכון במשטח המכשיר היא חיונית לביצועי המכשיר המיקרופלואידיים הטובים ביותר. טכניקה זו מאפשרת ייצור מהיר של אבני בניין מיקרוג'ל אחידות ליצירת פיגומי מפה אשר יכולים לשמש למגוון יישומים רגנרטיביים in vivo כולל ריפוי פצעים.