Name: דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: למד טכניקת דיסקציה ידנית של מעיים ב־Caenorhabditis elegans לביולוגיה מולקולרית וגנומיקה. שיטה זו מאפשרת בידוד רקמות נקיות לניתוח RNA וחומר גנטי מיקרוביאלי באיכות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו חבים חוב לעבודתם החלוצית של ג'יימס מקגי וברב גושצ'ינסקי, שפיתחו בתחילה את שיטת כריתת המעיים שממנה מותאם פרוטוקול זה. עבודתנו נתמכת על ידי פרס MIRA (R35) בפיקוח המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (המכונים הלאומיים לבריאות, R35GM124877 ל- EON) ופרס NSF-CAREER בפיקוח NSF MCB Div של ביומדע מולקולרי ותאי (פרס #2143849 ל- EON).

<ol><li>Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddel%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+clustering+of+muscle-expressed+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).</li>
<li>Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+clustering+and+GATA+transcriptional+regulation+of+intestine-expressed+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans.</a> Development. 133 (2), 287-295 (2005).</li>
<li>Spencer, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+and+temporal+map+of+C.+elegans+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A spatial and temporal map of C. elegans gene expression.</a> Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).</li>
<li>Spencer, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+specific+neurons+from+C.+elegans+larvae+for+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling.</a> PLoS One. 9 (11), 112102(2014).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+muscle+transcriptome+using+trans-splicing-based+RNA+tagging+%28SRT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT).</a> Nucleic Acids Research. 44 (21), 156(2016).</li>
<li>Blazie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNA-Seq+analysis+reveals+pervasive+tissue-specific+alternative+polyadenylation+in+Caenorhabditis+elegans+intestine+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles.</a> BMC Biology. 13 (1), 4(2015).</li>
<li>Blazie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+directs+tissue-specific+miRNA+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+somatic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues.</a> Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).</li>
<li>Gómez-Saldivar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Tissue-specific+transcription+footprinting+using+RNA+PoI+DamID+%28RAPID%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).</li>
<li>Katsanos, D., Barkoulas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+DamID+in+C.+elegans+reveals+a+direct+role+for+LIN-22+and+NHR-25+in+antagonizing+the+epidermal+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate.</a> Science Advances. 8 (5), 3141(2022).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Mathies, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+profiling+reveals+significant+transcriptional+differences+between+a+multipotent+progenitor+and+its+differentiated+sister%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister.</a> BMC Genomics. 20 (1), 427(2019).</li>
<li>Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+transcriptomes+reveal+complex+neuron-specific+function+and+regulation+of+mec-2%2F+Stomatin+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing.</a> Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).</li>
<li>Glenwinkel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+analysis+of+the+transcriptional+regulatory+logic+of+neuronal+identity+specification+throughout+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system.</a> eLife. 10, 64906(2021).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Charest, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+action+of+temporally+segregated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial action of temporally segregated transcription factors.</a> Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).</li>
<li>Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+lineage+of+the+early+C.+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transcriptional lineage of the early C. embryo.</a> Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-cell+RNA-Seq+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+transcriptomics+reveals+the+evolutionary+history+of+the+endoderm+germ+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer.</a> Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+embryonic+transcriptome+with+tissue%2C+time%2C+and+alternative+splicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution.</a> Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Durham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+tissue-specific+chromatin+accessibility+in+L2+Caenorhabditis+elegans+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes.</a> Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).</li>
<li>King, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ELT-2+positively+and+negatively+impacts+direct+target+genes+to+modulate+the+Caenorhabditis+elegans+intestinal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+analysis+in+the+C.+elegans+germline+with+the+thymidine+analog+EdU%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58339(2018).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-unsaturated+fatty+acids+link+H3K4me3+modifiers+to+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan.</a> Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).</li>
<li>Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 120 (2), 443-451 (1994).</li>
<li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+manipulation+of+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and manipulation of embryonic cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li>
<li>Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+transcript+discovery+by+RNA-seq+in+C.+elegans+blastomeres+identifies+neg-1%2C+a+gene+important+for+anterior+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (4), 1005117(2015).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+%CE%B2-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants.</a> Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormAtas+Hermaphrodite+Handbook+%E2%80%93+Introduction+to+C.+elegans+Anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy.</a> WormAtlas. , (2006).</li>
<li>Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Sutter+Instrument+Company%22">Sutter Instrument Company</a>. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).</li>
<li>Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+transcription+factor+redundancy%3A+The+relative+roles+of+the+ELT-2+and+ELT-7+GATA+factors+in+the+C.+elegans+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm.</a> Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב לניתוח ידני של מעיים מ - C. elegans בוגרים, מה שיוצר הכנות טהורות לבדיקות במורד הזרם. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים (1) הקפדה שלא לשתק יתר על המידה את התולעים, (2) ביצוע חיתוכי דיסקציה מדויקים, (3) יצירת מיקרו-פיפטות בגודל מתאים לנתיחה, ו-(4) הבטחת התאוששות מהירה של מעיים בריאים במהלך הקציר הסופי. מסיבות אלה, יש לנקוט בזהירות בעת חשיפת תולעים לתמיסת הלבאמיזול, ויש לרענן את המחטים ההיפודרמיות לעתים קרובות כדי להבטיח חדות מקסימלית. טיפול במעי באמצעות פיפטה מיקרו-קפילרית ושואף פה הוא צעד נוסף שידרוש תרגול. מיקרו-פיפטות מזויפות כראוי בגודל המתאים גם עושות הבדל משמעותי בבידוד חלקים גדולים של המעי במהלך דיסקציות, בנוסף להפחתת הסיכון לאבד מעיים בתוך המיקרו-פיפטה. משתמשי פרוטוקול חדש בדרך כלל מאבדים מעיים בקצה הפנימי של פיפטה מיקרו-קפילרית לפני שהם יכולים להיפלט לתוך מגיב הבידוד. בעיה זו יכולה להיות מתוקנת עם תרגול פיפטות microcapillary מזויף כראוי.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לשימוש בתולעים בוגרות. ניסויים ראשוניים תומכים בכך שפרוטוקול זה יעיל לשימוש גם בתולעי L4 ותולעים מבוגרות יותר. עם זאת, היעילות של פרוטוקול זה עדיין לא הוערכה בתולעים בשלב הזחל המוקדם. מגבלה של גישה זו היא כמות החומר הקטנה שהיא מניבה. למרות שהכמויות מספיקות עבור RNA-seq ו- PCR, ייתכן שהן אינן מספיקות למבחנים אחרים. ככזה, משתמשים צריכים לקבוע אם ניתן לאסוף באופן ריאלי את הקלט המינימלי הנדרש לבדיקה באמצעות פרוטוקול זה.
המעבדה שלנו משתמשת באופן שגרתי ב-FACS כדי לטהר תאי מעיים לאחר בידוד 30, שיטות ניתוח פוסט-הוק לזיהוי תאי מעיים, ושיטת נתיחת ידזו 30,42. לנתיחה ידנית יש יתרון בכך שהיא ניתנת לשימוש בתולעים בוגרות כאשר פירוק תולעים ובידוד תאים פחות מוצלחים. יתר על כן, היעילות והאיכות של סך הרנ"א המופק מתכשירי דיסקציה ידניים הן גבוהות, ככל הנראה משום שהרקמות נקטפות במהירות מהתולעים ואז מופקדות במהירות בריאגנט לבידוד חומצות גרעין, מה שמפחית את פירוק הרנ"א. יתרון נוסף של שיטת דיסקציה ידנית הוא שהיא זולה, קלה ללמידה ואינה דורשת ציוד מיוחד. לבסוף, גישה זו מאפשרת קציר ובידוד של חיידקי המעיים ממעי התולעים, מה שמאפשר מחקרים במיקרוביום במורד הזרם.
פרוטוקול כריתת היד המתואר כאן לבידוד מעיים מ- C. elegans בוגרים מייצג כלי רב עוצמה לחקר היבטים שונים של הביולוגיה של C. elegans. לדוגמה, בעזרת הכנה טהורה של מעיים, חוקרים יכולים לחקור את ההצטלבות בין מערכת החיסון, ההזדקנות, חילוף החומרים והמיקרוביום.

תולעת הנמטודה Caenorhabditis elegans, עם 959 תאים בלבד ומחזור חיים של 4 ימים מביצה לביצה, היא מערכת מודל אידיאלית למחקרים גנטיים, גנומיים והתפתחותיים רבים 1,2. קלות הסינון הגנטי קדימה ואחורה, השכיחות של סמנים פלואורסצנטיים מהונדסים, היכולת לבצע עריכת גנום ספציפית לנוקלאוטידים והמשאבים הרבים ברחבי הקהילה תרמו כולם לתגליות ולתובנות משמעותיות במערכת C. elegans. עם זאת, חסרון משמעותי הוא הקושי להשיג אוכלוסיות טהורות של תאים, רקמות או איברים, שהם קטנים, שבריריים ויכולים להיות מחוברים זה לזה. מכיוון שאוכלוסיות טהורות של תאים חשובות למבחני גנומיקה כגון RNA-seq, ChIP-seq ו- ATAC-seq, התפתחו מספר גישות להשגת תכשירים טהורים של תאים, רקמות ואיברים של C. elegans. כאן מתוארת שיטה לניתוח ידני של מעיים, בחלקים גדולים, מתוך תולעים בוגרות מסוג C. elegans. התכשירים שהתקבלו מתאימים למבחנים גנומיים במורד הזרם (איור 1).
שיטת כריתת הרקמות בקנה מידה עדין המתוארת כאן (איור 2) היא רק גישה אחת. טכניקות חלופיות אחרות - כגון תיוג מולקולרי, פירוק תולעים וטיהור סוגי תאים בעלי עניין באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ואנליזה לאחר הוק - שימשו גם הן בהצלחה לסקר את התכונות הספציפיות לרקמות של הביולוגיה המולקולרית של C. elegans. עם זאת, יתרון של דיסקציה ידנית על פני גישות אחרות אלה הוא שניתן להשתמש בה כדי לחקור בו-זמנית את התכונות של המעי C. elegans ותכולת החיידקיםשלו 3,4,5. זה מאפשר ריצוף גנים של 16S rRNA ומקל על מחקרי מיקרוביום בתוך מערכת C. elegans. מגבלה חשובה, עם זאת, היא שתאי מעיים אינם מבודדים בנפרד.
תיוג מולקולרי מקנה תג ספציפי לסוג תא למולקולות רק בתוך הרקמה או התאים שצוינו. לאחר מכן ניתן לבודד תגים אלה מסך ההכנות של התולעים. בדרך זו, מקדמים ספציפיים לרקמות המניעים חלבון קושר פוליA מתויג או מנהיג שחבור אפשרו פרופיל תעתיק ספציפי לרקמות 6,7,8,9,10 ומיפוי 3'UTR 11,12. באופן דומה, פרופילי פקטורי שעתוק ספציפיים לרקמות נערכו באמצעות ChIP-seq ו-DamID, שבהם נוספו וריאנטים של פקטורי שעתוק ספציפיים לקידום עם תגים או היתוך אנזים13,14.
FACS מאפשר לבודד סוגי תאים בעלי עניין מתולעים מנותקות בהתבסס על המאפיינים התאיים הפנימיים שלהם ותכונותיהם הפלואורסצנטיות. גישה זו יצרה תעתיקים ספציפיים לרקמות מאיברים מגוונים 8,15,16 וסוגי תאים עצביים בודדים 8,9,15,16,17,18 ושימשה ליצירת מפת ביטוי של כל מערכת העצבים C. elegans 19,20 . FACS, ובן דודו מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS), שימשו גם ליצירת פרופילי כרומטין ספציפיים לתאים21,22.
לבסוף, ניתוח לאחר הוק יכול להתבצע במבחנים ברזולוציה של תא בודד. בשיטה זו, כל התאים הבודדים נסקרים, סוג התא של כל אחד מהם מיוחס בשלב הניתוח, וסוגי התאים המעניינים מסוננים באופן סלקטיבי למחקר נוסף. ניתוח פוסט-הוק שימש בהצלחה להשגת תעתיקים של תאים מתפתחים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברי C. elegans 23,24,25,26,27 ותולעי שלב L1 28. נגישות הכרומטין אופיינה גם בשימוש ב-ATAC-seq במקום ב-RNA-seq באמצעות אסטרטגיה דומה29.
לכל גישה יתרונות ומגבלות. עבור המעי C. elegans, פירוק תולעים ובידוד FACS של תאי מעיים הוא בר השגה בשלבי העובר והזחל30 אך הוא מאתגר במבוגרים. הסברה היא שהסיבה לכך היא שהתאים הגדולים של המעי, בעלי הכפילות האנדו-ריפוליסטית והדבקות החזקה, מקשים עליהם להתנתק ללא פגע. שיטת נתיחת היד המתוארת כאן עוקפת אתגרים אלה, ומאפשרת בידוד של חלקים גדולים במעי התולעת הבוגרת. הנוהג של יד לנתח גונדות מאותו שלב הוא נפוץ ופשוט. דיסקציה של המעי דומה לדיסקציה של גונד אך פחות מבוצעת32. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם מפרוטוקול ארוך יותר, שלא פורסם, שפותח על ידי ד"ר ג'יימס מקגי וברב גושצ'ינסקי. פרוטוקול יעיל זה שואל טכניקות לבידוד בלסטומרים מעוברים בשלב מוקדם 23,33,34,35. למרות שדיסקציה ידנית אינה אפשרית לבידוד רוב סוגי התאים או הרקמות ב- C. elegans, היא אידיאלית לבידוד מעיים מתולעים בוגרות. לכן, דיסקציה ידנית משלימה אמצעים אחרים להשגת תכשירי תאים ספציפיים למעי.

<table><tbody><tr><td>אלבומין סרום בקר אצטילציה (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-420</td> נטול <td>נוקלאז BSA</td></tr><tr><td>CL2122 זן תולעת</td><td>CGC (המרכז הגנטי של Caenorhabditis)</td><td>CL2122</td><td>dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. בקרת מתח עבור CL2120. פנוטיפ כנראה WT.</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>פישר</td><td>C79</td><td>דרוש להכנת מלחי ביצים</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה,</td><td>פלסטיק אולימפוס בתפזורת</td><td>28-108</td><td>צינור חרוטי ללא נוקלאז הדרוש לייצור תמיסות.</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל,</td><td>פלסטיק אולימפוס בתפזורת</td><td>28-103</td><td>צינור חרוטי ללא נוקלאז הדרוש לייצור פתרונות.</td></tr><tr><td>שקופית קעור (2 בארות)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71878-08</td><td>12-pk של שקופיות קעור 2 בארות</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינו-אתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E3889</td><td>הדרוש להכנת מאגר כלציה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M205 FCA</td><td>זהו ציוד אופציונלי שניתן להשתמש בו עם זני C. elegans פלואורסצנטיים כדי לעזור למשתמשים להנחות במהלך נתיחות ידיים</td></tr><tr><td>N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&prime;-(חומצה 2-אתנסולפונית), 4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (HEPES)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034</td><td>הדרוש לייצור מאגר דיסקציה</td></tr><tr><td>RNA רגישות גבוהה ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>להערכת איכות ה-RNA הכוללת ו כמות</td></tr><tr><td>RNA רגישות גבוהה ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5581</td><td>להערכת איכות וכמות RNA כוללת</td></tr><tr><td>רגישות גבוהה RNA ScreenTape מאגר דגימה</td><td>Agilent</td><td>5067-5580</td><td>להערכת איכות וכמות RNA כוללת</td></tr><tr><td>ערכת DNA מיקרוביאלית Zymo</td><td>Research</td><td>D4310</td><td>בידוד DNA מיקרוביאלי ממעי תולעים/תולעים</td></tr><tr><td>מחט היפודרמית (27 גרם x 1/2 אינץ')</td><td>BD 305109 מדעי</td><td></td><td>הדרוש לדיסקציה ידנית של מעיים</td></tr><tr><td>Levamisole (הידוע גם בשם (-)-Tetramisole hydrochloride)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>L9756</td><td>המשמש לשיתוק זמני של תולעים לפני נתיחת היד של המעיים.</td></tr><tr><td>מזרק חד פעמי לשימוש כללי של Luer-Lok (1 מ"ל)</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>אופציונלי. ניתן להשתמש בו כדי להצמיד את המחט ההיפודרמית, מה שמאפשר מניפולציה קלה יותר של המחט במהלך הדיסקציה. הסר את הבוכנה.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>פישר</td><td>M33</td><td>דרוש להכנת מלחי ביצים</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט Hpetahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-500G</td><td>דרוש לייצור מאגר M9</td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>משמש לזיוף הפיפטות המיקרו-נימיות. זמין דרך Tritech Research.</td></tr><tr><td>1.7 מ"ל מיקרו-צינורות, פלסטיק</td><td>אולימפוס</td> שקוף <td>22-282</td><td>צינור מיקרופוגה ללא נוקלאז הדרוש לייצור פתרונות ואחסון דגימות.</td></tr><tr><td>יש צורך בצינור שואב פה</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5177</td><td>צינור שואב פה בשילוב עם הפיפטה המיקרו-נימית כדי לאפשר שאיבת מעיים מנותחים.</td></tr><tr><td>16S בקרת פאן-בקטריאלית TaqMan Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50137</td><td>מזהה בדיקה: Ba04930791_s1. בדיקה המשמשת לזיהוי חיידקי מעיים באמצעות qPCR.</td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>דגם P-1000</td><td>משמש למשיכת הפיפטות המיקרו-נימיות לפני הפרזול.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (35 x 10 מ"מ)</td><td>Genesee Scientific - Olympus Plastics</td><td>32-103</td><td>משמש לייצור אמבט M9 ואמבט Disseciton Buffer לשטיפת תולעים לפני הדיסקציה.</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9730</td><td>משמש לבידוד של סך ה- RNA</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Millipore Sigma</td><td>הדרוש 529552</td><td>לייצור מלחי ביצים</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0662-500G</td><td>הדרוש לייצור מאגר M9</td></tr><tr><td>קיוביט 3 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>מלווה את ערכת הבדיקה של Qubit RNA HS. ניתן להשתמש בו כדי לכמת RNA לפני הפעלת הדגימה ב-Agilent ScreenTape.</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בערכת בדיקת Qubit RNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32852</td><td>כדי לכמת RNA לפני הפעלת הדגימה ב-Agilent ScreenTape.</td></tr><tr><td>מעכב RNasin Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td>עיכוב ספקטרום רחב של Rnases אוקריוטיים נפוצים</td></tr><tr><td>ללא RNase</td><td>סט Qiagen</td><td>79254</td><td>המשמש לעיכול DNA על העמודה במהלך פרוטוקול בידוד RNA.</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>משמש לבידוד של סך ה-RNA ממעי תולעים/תולעים</td></tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B100F-4</td><td>4 ב-OD 1.2 מ"מ נימי זכוכית בורוסיליקט סטנדרטיים המשמשים לייצור פיפטות מיקרו-נימיות לדיסקציה</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>פישר</td><td>S271</td><td>הדרוש להכנת מלחי ביצים</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראט</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td> דרוש להכנת מסנן מזרק <td>חיץ M9</td></tr><tr><td>(0.2 מיקרומטר SCFA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>72302520</td><td>אופציונלי לשימוש עם צינור שואב הפה בעת פיפטינג בפה.</td></tr><tr><td>4150 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td>מלווה את ריאגנטים של RNA ScreenTape להערכת איכות וכמות RNA</td></tr><tr><td>TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A52699</td><td>Master Mix המשמש ל-qPCR</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>15596026 בידוד ושימור חומצות גרעין. ניתן להחליף את QIAzol (Qiagen; 79306) אם מעדיפים.</td></tr><tr><td>Worm Pick</td><td>NA</td><td>NA</td><td>מיוצר בבית מפיפטה פסטר וחוט פלטינה. ראה ספר תולעת לפרטים.</td></tr></tbody></table>

דיסקציה ידנית של caenorhabditis elegans מעיים

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

המעי Caenorhabditis elegans , המורכב מ-20 תאים בלבד, הוא הקשר של תפקודים תומכי חיים רבים, כולל עיכול, חילוף חומרים, הזדקנות, חסינות ותגובה סביבתית. אינטראקציות קריטיות בין ה-C. elegans המארח לבין סביבתו מתכנסות בתוך המעי, שם מרוכזת המיקרוביוטה של המעיים. לכן, היכולת לבודד רקמת המעי הרחק משאר התולעת נחוצה כדי להעריך תהליכים ספציפיים למעי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ידני של מעי C. elegans בוגרים. ניתן לבצע את ההליך בזנים המסומנים בפלואורסצנטיות למטרות קלות או אימון. לאחר שהטכניקה מושלמת, ניתן לאסוף מעיים מתולעים ללא תווית של כל גנוטיפ. גישה זו של מיקרו-דיסקציה מאפשרת לכידה בו-זמנית של רקמת המעי המארח ושל מיקרוביוטה של המעיים, יתרון למחקרי מיקרוביום רבים. ככזה, יישומים במורד הזרם עבור תכשירי המעיים שנוצרו על ידי פרוטוקול זה יכולים לכלול, בין היתר, בידוד RNA מתאי מעיים ובידוד DNA ממיקרוביוטה שנלכדה. באופן כללי, ניתוח ידני של מעי C. elegans מאפשר שיטה פשוטה וחזקה לחקור היבטים קריטיים של הביולוגיה של המעי.

הפרוטוקול הנוכחי שימש לבידוד חלקים גדולים של המעי מ-C. elegans בוגרים ביד (איור 2). דגימת המעי הסופית של כל קבוצת ניסוי המוצגת מורכבת מאוסף שווה של מקטעי המעי הקדמי-אמצעי-אחורי. עם זאת, בהתאם לשאלת הניסוי, הוא יכול גם לכלול אוסף של חלקי המעי הקדמי, האמצעי או האחורי בלבד. יחד, מוצגות שלוש תוצאות מייצגות עבור פרוטוקול זה. הראשון מתאר את הדיסקציה והבידוד המוצלחים של המעיים (איור 6). השנייה מדווחת על תוצאות של בידוד RNA ממעיים מבודדים (איור 7). השלישי מראה את התוצאות של מעקב מיקרוביאלי ממעיים מבודדים (איור 8).
עבור התוצאה הראשונה, איור 6A מראה כיצד נראה מעי שהובלט לאחר ביצוע חתך ראשוני באתר "a" באיור 5A בתוך תולעי CL2122 בוגרות. מכיוון שתולעי CL2122 מכילות את מקדם mtl-2 הספציפי למעי שהתמזג עם GFP (mtl-2 p::GFP), מעיים מבודדים יזהרו בירוק תחת היקף החיתוך הפלואורסצנטי. הדיסקציה המוצלחת של מקטע מעיים מוצגת באיור 6B. חלק מעי זה נקי ממזהמים גלויים כגון פסולת מהגונד או הפגר. לעומת זאת, איור 6C מציג מעיים שלא נותחו בהצלחה, שכן גונד ופגר עדיין מחוברים באופן נראה לעין למקטע המעיים.
עבור התוצאה השנייה, המעיים נקטפו לריאגנט לבידוד חומצות גרעין ועובדו למחרת באמצעות פרוטוקול מיצוי RNA כולל עם קלט נמוך (ראו טבלת חומרים). דגימת מעי סופית של 60 מקטעי מעי סה"כ מהחלקים הקדמיים-אמצעיים והאמצעיים-אחוריים מניבה בערך 15 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה (איור 7A). כמות זו של המעיים הכוללים ניתן להשיג בקלות ביום אחד, אך ניתן גם לפרק אותה על פני מספר ימים במידת הצורך. תפוקות רנ"א מדיסקציה ידנית יעילות יותר מפירוק תולעים ובידוד FACS של תאי מעיים, בכך שמאות אלפי תאי מעיים נדרשים כדי להשיג כמויות תואמות של סך הרנ"א (איור 7B). חשוב לציין כי תפוקות ה-RNA הנוצרות על-ידי דיסקציה ידנית הן די והותר כקלט עבור ערכות ספריית RNA-seq מסחריות (כלומר, NEBNext Ultra II ו-NEBNext Single Cell/Low Input), שיכולות לקחת עד 2 pg של RNA.
עבור התוצאה השלישית, המעיים נקטפו לתוך ddH20 סטרילי ועובדו באותו יום באמצעות ערכת בידוד DNA מיקרוביאלית מסחרית (ראו טבלת חומרים). דגימת מעי סופית של 40 מקטעי מעי כוללים מהחלקים הקדמיים-אמצעיים והאמצעיים-אחוריים מניבה כ-0.009 pg של סך הדנ"א המיקרוביאלי באמצעות בדיקת זיהוי פאן-בקטריאלית (ראו טבלת חומרים) (איור 8). כמויות אלה נמוכות מדי עבור שיטות כימות מסורתיות ויש לבצע אקסטרפולציה מעקומות סטנדרטיות qPCR. באופן אידיאלי, משתמשים צריכים להתמקד בכמות כוללת סופית של מעיים &gt;40 מכיוון שהדבר מגדיל את גבול הזיהוי ואת הגבול של אות לרעש לגבי רמות זיהום מגיבים.
כאשר שוקלים תכנון ניסוי, איסוף דגימות בקרה מתאימות הוא תמיד הכרחי. עבור ניסויי תעתיק, בקרה ניסיונית מתאימה יכולה לכלול הכנות של התולעת כולה שנאספה באותו אופן כמו מעיים. במהלך דיסקציה ובידוד של מעיים מ C. elegans, עם זאת, זה נפוץ לראות חתיכות של פגר וגונד נצמד למקטעי המעי. בעוד שבאופן אידיאלי רקמות מזהמות אלה יוסרו מהמעיים לפני האחסון לשימוש במורד הזרם, בקרות ניסיוניות נוספות יכולות לכלול את איסוף פגרי התולעים שנותרו לאחר נתיחת המעי ו/או איסוף גונדות מנותחות. עבור ניסויים במיקרוביום, בקרות יכולות לכלול גם תכשירים של התולעת כולה שנאספה באותו אופן כמו מעיים, בנוסף לבקרות חיוביות קונבנציונליות (תרבית חיידקים) ושליליות (מים).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig01.jpg"> איור 1: כריתת מעיים ידניים מ-C. elegans בוגרים המשמשת ליצירת תכשירים ספציפיים לרקמות לשימוש במגוון רחב של מבחני omics במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig02.jpg"> איור 2: סכימה לפרוטוקול דיסקציה ידנית. פרוטוקול זה שימש לבידוד חלקים גדולים של המעי מ - C. elegans בוגרים ביד. ניתן לבודד את המעיים עבור בדיקות שונות במורד הזרם. מוצג כאן השימוש במעיים לבידוד RNA ובידוד DNA מיקרוביאלי. תמונה שנוצרה באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig03.jpg"> איור 3: ייצור פיפטה מיקרו-קפילרית. (A) פיפטה מיקרו-קפילרית טרייה אך לא מזויפת מוצגת דרך חתיכת העין של מיקרופורג'. סרגל עיניים משמש למדידת פיפטות מיקרו-קפילריות בגודל 50 מיקרומטר לקוטר פנימי משוער של שלושה סימני שנתות (מוצג, מסומן על ידי חץ). (B) פיפטות מיקרו-קפילריות לא מזוהות, 50 מיקרומטר ו-100 מיקרו-מטר מוצגות תחת היקף החיתוך לצד סרגל כיול עם 1 div = 0.1 מ"מ. (C) הפיפטות המיקרו-קפילריות של 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר מ-(B) מוצגות שוב אך מנקודת תצפית אחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig04.jpg"> איור 4: השימוש במאגר כלציה (CB) במהלך דיסקציה ידנית כדי לשפר את תפוקת ה-RNA. פרוטוקול מיצוי RNA כולל עם קלט נמוך יצר תכשירי RNA מרקמות בעלות שם. אלקטרופורזה מייצגת של ג'ל המאפיינת את איכות הרנ"א הכוללת המבודדת (RIN, מספר שלמות RNA) ואת הכמות מוצגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig05.jpg"> איור 5: שלבי נתיחה ידנית . (A) שלבי הדיסקציה המתוארים בפרוטוקול מתוארים כאן. ב-(1), המעי של התולעת הוא הדמיה על ידי פלואורסצנציה GFP. ניתן לחלק את אתר החתך הראשי באופן שווה בין התולעים כדי להבטיח כיסוי אחיד לכל אורך המעי. לחלופין, ניתן לבחור אתרי חתך ראשוניים "a" או "b" כדי לקבל הכנה קדמית-אמצעית או אמצעית-אחורית ספציפית למקטע המעי. ב-(2), המעי התפשט, וקיבל צורה של לולאה. ב-(3), המעי נחתך תחילה מגוף התולעת תוך ניסיון לשחרר אותו מהפגר והגונאדה. לאחר מכן מוציאים את המעי מכל פגר או גונד שנותרו שלא ניתן להסירו. ב-(4), חלק מנוקה של המעי מבודד ומוכן לאחסון. (B) שלב קריטי הוא לעקור כל פסולת נצמדת (כלומר, גונד, פגר) מהמעי על ידי העברתה פנימה והחוצה מהפיפטה המיקרו-קפילרית המעוצבת בקצה שואב הפה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות של שלבי נתיחת ידיים. תמונה מייצגת המציגה (A) את שחול המעי מהתולעת. אלה הן תולעים של הגנוטיפ CL2122, המבטאות GFP תחת מקדם mtl-2 ספציפי לתאי המעי. שתי תמונות מייצגות מראות (B) מקטע נקי ומבודד לחלוטין של המעי ו-(C) מעי מבודד עם רקמות גונד ופגר מזהמות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig07.jpg"> איור 7: תוצאות מייצגות של מיצוי RNA כולל ממעיים מבודדים . (A) מוצגת תמונה מייצגת של תכשירי RNA שנפתרו על-ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, המאפיינת את האיכות (RINs, מספר שלמות ה-RNA) ואת הכמות של סך הרנ"א המבודד. (B) לשם השוואה מוצג ג'ל מייצג של סך הרנ"א שבודד מתאי מעיים שנקטפו מתולעי שלב L1 באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). ב-20 תאים למעי, ניתן להסיק ששיטת כריתת היד מניבה יותר RNA כולל לכל מעי מאשר תאי מעי מטוהרים ב-FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig08.jpg"> איור 8: תוצאות מייצגות עבור מיצוי דנ"א מיקרוביאלי כולל ממעיים מבודדים. ערכה מסחרית לבידוד דנ"א מיקרוביאלי יצרה תכשירי דנ"א ממעיים, מתולעים שלמות ומבקרות. בדיקת גנים פאן-בקטריאליים שימשה לכימות מספר החיידקים בדגימות. תמונה מייצגת של (A) עקומות ההגברה qPCR שנוצרו, (B) העקומה הסטנדרטית E. coli OP50 המשמשת לכימות הדגימות, ו-(C) הדגימות מוצגות. ב-(B), הריכוזים ההתחלתיים של תקני E. coli מוצגים כנגד ערכיC T שלהם. ב-(C), שני שכפולים (חזרות) של 40 תולעים שלמות נחתכו באופן מדיאלי, ו-40 מקטעי מעיים מבודדים עובדו לבידוד gDNA מיקרוביאלי. בקרת ללא תבנית (NTC) מהפעלת qPCR מוצגת גם היא. ציר Y מייצג את ערכיC T לדוגמה. כמות הדנ"א המאומתת מ-PCR מוצגת כערכי פיקוגרמות (pg) מעל פסי הדגימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: הרכבי המאגרים והתמיסות ששימשו במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד מעיים מתולעי נמטודת Caenorhabditis elegans בוגרות ביד לצורך קלט בגנומיקה, פרוטאומיקה, מיקרוביום או מבחנים אחרים.

דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

כריתה ידנית של המעי של אלגאן זה היא טכניקה רבת עוצמה אך פשוטה המאפשרת לחקור היבטים שונים של הביולוגיה הפוסט-ביולוגית על ידי בידוד רקמות באוכלוסיות ספציפיות לתאים. טכניקת כריתת רקמות בקנה מידה עדין זו קלה לביצוע ומשתמשת בציוד מעבדה סטנדרטי, מה שהופך אותה לשיטה חזקה ונגישה עבור רבים. התחילו במשיכת נימי הזכוכית הסטנדרטיים באורך 4 אינץ' ובקוטר 1.2 מילימטר לצורת מחט הזרקה באמצעות מושך מחט.הכן לפחות 5 50 ו 100 מיקרומטר מיקרו נימי פיפטות. השתמש במיקרו לזייף את הפיפטות המיקרו-נימי ל-50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר על ידי סימון 3 או 5 סימני שנתות בהתאמה כפי שמצוין על ידי סרגל העיניים של מיקרו לזייף מתחת לעדשה האובייקטיבית 5X. לאחר מכן הצמידו פיפטה מיקרו נימי לצינור השואף לפה.הכינו אמבט M9 אחד ואמבט חיץ דיסקציה אחד על ידי הוספת 2 מיליליטר של M9 בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מילימטר ו-2 מיליליטר של חיץ דיסקציה לצלחת פטרי סטרילית אחרת בקוטר 35 מילימטר. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר עובד או תמיסת BSA לכל אמבטיה, וערבבו אותו על ידי מערבולת. כדי להכין את מערך הדיסקציה הוסיפו 150 מיקרוליטרים של תמיסת לבאמיזול עובדת לבאר הראשונה מבין שתי השקופיות הקעורות היטב ו-150 מיקרוליטרים של חיץ דיסקציה לבאר השנייה.הוסף 20 מיקרוליטרים של פתרון BSA עובד לכל באר. כדי לנתח ידנית את מעי התולעת caenorhabditis elegans CL2122, העבירו 20 תולעים בוגרות ממדיום צמיחת הנמטודה או צלחת NGM לאמבטיית M9 באמצעות פיק תולעים. לאחר מכן העבר את כל 20 התולעים מאמבט M9 לאמבטיית חיץ הנתיחה.לאחר מכן מעבירים קבוצות של 10 תולעים מאמבט חיץ הדיסקציה לתמיסת הלבאמיזול המכילה היטב. ברגע שתנועת התולעת מאטה במהירות העבירו אותן מבאר הלבאמיזול לבאר המכילה את מאגר הדיסקציה. אפשר לתולעים להתחיל לנוע מעט במאגר הדיסקציה הרבה לפני תחילת הדיסקציה.תחת היקף ניתוח פלואורסצנטי, בצע חתך אחד ממש מאחורי הלוע או לפני פי הטבעת באמצעות מחט היפודרמית כדי לייצר מספר שווה של חלקים קדמיים באמצע ובאמצע החלק האחורי של המעי. בזמן ההמתנה של כדקה עד שהמעיים יובלטו באופן מקסימלי מהגוף, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ כלציה לבאר כדי לסייע בהפחתת פירוק ה-RNA. כדי להקל על שחול המעי השתמש בפיפטה מיקרו נימי בגודל 100 מיקרומטר המחוברת לשואב את התולעת פנימה והחוצה מהפיפטה.ברגע שמעי הוא extruded מספיק להשתמש במחט היפודרמית 27 מד כדי לחתוך אותו הרחק משאר הגוף וכל gonad שנותר. שאפו את חתך המעיים באמצעות פיפטה מיקרו נימי והעבירו אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל מגיב לבידוד חומצות גרעין. שמור את המעיים המבודדים על קרח וחזור על ההליך עבור המעיים הנותרים.שיטה זו הדגימה את הדיסקציה והבידוד המוצלחים של המעיים. השיטה דיווחה גם על בידוד RNA ומעקב מיקרוביאלי ממעיים מבודדים. כאשר תולעי CL2122 נשאו את המתכת הספציפית למעי, שני מקדמים התמזגו עם GFP, המעי נצפה כזוהר ירוק תחת היקף החיתוך הפלואורסצנטי.כריתת התולעת הבוגרת הציגה מעי מובלט לאחר ביצוע חתך ראשוני ממש מאחורי הלוע. הנתיחה המוצלחת של מקטע מעיים נראתה נקייה ממזהמים גלויים כגון פסולת מהגונד או הפגר. לעומת זאת, דיסקציה לא מוצלחת הציגה את הגונד והפגר המחוברים למקטע המעיים.תפוקות הרנ"א מדיסקציה ידנית היו יעילות יותר מכיוון שהדגימה הסופית של 60 מקטעי המעי הכוללת הניבה כ-15 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה. פירוק התולעים ובידוד ה-FACS של תאי המעי היו פחות יעילים מכיוון שאלו דרשו מאות אלפי תאי מעיים כדי להשיג כמויות תואמות של רנ"א כולל. ההגברה הגנומית הכוללת של הדנ"א המיקרוביאלי באמצעות בדיקת זיהוי פאן-בקטריאלית הראתה כי הדגימה הסופית של 40 מקטעי המעי הכוללים מהאזורים הקדמיים, האמצעיים והאמצעיים האחוריים הניבה את הכמות הנמוכה אך הניתנת לזיהוי של כ-0.009 פיקוגרמות של סך הדנ"א המיקרוביאלי.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא לא לשתק יתר על המידה את התולעים לפני דיסקציה כמו זה יכול לעכב שחול המעי המקסימלי.

hand-dissection-of-caenorhabditis-elegans-intestines

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב...

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

סרטון זה מתאר שיטה לניתוח גונדות מהרמפרודיטים בוגרים של C. elegans, וכתוצאה מכך רקמות המתאימות להדבקה חיסונית והדמיה פלואורסצנטית.

ג. אלגנס שחול גונאד: טכניקת דיסקציה מהירה

מקור: מורגן, א. ואחרים. ניקוי סלקטיבי של נמטודות Caenorhabditis בטבע להעשרת חיידקי מיקרוביום במעי. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד חיידקי מעיים מעניינים מתולעי Caenorhabditis פראיות. התולעים מורעבות ושוטפות תחילה כדי לחסל חיידקים שאריות מזינים מפני השטח ומהמעי שלהן, תוך שמירה על המיקרובים המטרה. לאחר ניקוי פני השטח ומספר שלבים בזחילה, התולעים מנותחות כדי להוציא מעיים המכילים את החיידקים הרלוונטיים, אשר נאספים ומוקפאים לאחסון.

ניקוי סלקטיבי של תולעי Caenorhabditis להעשרת מיקרוביום המעי

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

למד טכניקת דיסקציה ידנית של מעיים ב־Caenorhabditis elegans לביולוגיה מולקולרית וגנומיקה. שיטה זו מאפשרת בידוד רקמות נקיות לניתוח RNA וחומר גנטי מיקרוביאלי באיכות גבוהה.

דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים

גלה סרטונים נוספים