דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים

כריתה ידנית של המעי של אלגאן זה היא טכניקה רבת עוצמה אך פשוטה המאפשרת לחקור היבטים שונים של הביולוגיה הפוסט-ביולוגית על ידי בידוד רקמות באוכלוסיות ספציפיות לתאים. טכניקת כריתת רקמות בקנה מידה עדין זו קלה לביצוע ומשתמשת בציוד מעבדה סטנדרטי, מה שהופך אותה לשיטה חזקה ונגישה עבור רבים. התחילו במשיכת נימי הזכוכית הסטנדרטיים באורך 4 אינץ' ובקוטר 1.2 מילימטר לצורת מחט הזרקה באמצעות מושך מחט.

הכן לפחות 5 50 ו 100 מיקרומטר מיקרו נימי פיפטות. השתמש במיקרו לזייף את הפיפטות המיקרו-נימי ל-50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר על ידי סימון 3 או 5 סימני שנתות בהתאמה כפי שמצוין על ידי סרגל העיניים של מיקרו לזייף מתחת לעדשה האובייקטיבית 5X. לאחר מכן הצמידו פיפטה מיקרו נימי לצינור השואף לפה.

הכינו אמבט M9 אחד ואמבט חיץ דיסקציה אחד על ידי הוספת 2 מיליליטר של M9 בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מילימטר ו-2 מיליליטר של חיץ דיסקציה לצלחת פטרי סטרילית אחרת בקוטר 35 מילימטר. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר עובד או תמיסת BSA לכל אמבטיה, וערבבו אותו על ידי מערבולת. כדי להכין את מערך הדיסקציה הוסיפו 150 מיקרוליטרים של תמיסת לבאמיזול עובדת לבאר הראשונה מבין שתי השקופיות הקעורות היטב ו-150 מיקרוליטרים של חיץ דיסקציה לבאר השנייה.

הוסף 20 מיקרוליטרים של פתרון BSA עובד לכל באר. כדי לנתח ידנית את מעי התולעת caenorhabditis elegans CL2122, העבירו 20 תולעים בוגרות ממדיום צמיחת הנמטודה או צלחת NGM לאמבטיית M9 באמצעות פיק תולעים. לאחר מכן העבר את כל 20 התולעים מאמבט M9 לאמבטיית חיץ הנתיחה.

לאחר מכן מעבירים קבוצות של 10 תולעים מאמבט חיץ הדיסקציה לתמיסת הלבאמיזול המכילה היטב. ברגע שתנועת התולעת מאטה במהירות העבירו אותן מבאר הלבאמיזול לבאר המכילה את מאגר הדיסקציה. אפשר לתולעים להתחיל לנוע מעט במאגר הדיסקציה הרבה לפני תחילת הדיסקציה.

תחת היקף ניתוח פלואורסצנטי, בצע חתך אחד ממש מאחורי הלוע או לפני פי הטבעת באמצעות מחט היפודרמית כדי לייצר מספר שווה של חלקים קדמיים באמצע ובאמצע החלק האחורי של המעי. בזמן ההמתנה של כדקה עד שהמעיים יובלטו באופן מקסימלי מהגוף, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ כלציה לבאר כדי לסייע בהפחתת פירוק ה-RNA. כדי להקל על שחול המעי השתמש בפיפטה מיקרו נימי בגודל 100 מיקרומטר המחוברת לשואב את התולעת פנימה והחוצה מהפיפטה.

ברגע שמעי הוא extruded מספיק להשתמש במחט היפודרמית 27 מד כדי לחתוך אותו הרחק משאר הגוף וכל gonad שנותר. שאפו את חתך המעיים באמצעות פיפטה מיקרו נימי והעבירו אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל מגיב לבידוד חומצות גרעין. שמור את המעיים המבודדים על קרח וחזור על ההליך עבור המעיים הנותרים.

שיטה זו הדגימה את הדיסקציה והבידוד המוצלחים של המעיים. השיטה דיווחה גם על בידוד RNA ומעקב מיקרוביאלי ממעיים מבודדים. כאשר תולעי CL2122 נשאו את המתכת הספציפית למעי, שני מקדמים התמזגו עם GFP, המעי נצפה כזוהר ירוק תחת היקף החיתוך הפלואורסצנטי.

כריתת התולעת הבוגרת הציגה מעי מובלט לאחר ביצוע חתך ראשוני ממש מאחורי הלוע. הנתיחה המוצלחת של מקטע מעיים נראתה נקייה ממזהמים גלויים כגון פסולת מהגונד או הפגר. לעומת זאת, דיסקציה לא מוצלחת הציגה את הגונד והפגר המחוברים למקטע המעיים.

תפוקות הרנ"א מדיסקציה ידנית היו יעילות יותר מכיוון שהדגימה הסופית של 60 מקטעי המעי הכוללת הניבה כ-15 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה. פירוק התולעים ובידוד ה-FACS של תאי המעי היו פחות יעילים מכיוון שאלו דרשו מאות אלפי תאי מעיים כדי להשיג כמויות תואמות של רנ"א כולל. ההגברה הגנומית הכוללת של הדנ"א המיקרוביאלי באמצעות בדיקת זיהוי פאן-בקטריאלית הראתה כי הדגימה הסופית של 40 מקטעי המעי הכוללים מהאזורים הקדמיים, האמצעיים והאמצעיים האחוריים הניבה את הכמות הנמוכה אך הניתנת לזיהוי של כ-0.009 פיקוגרמות של סך הדנ"א המיקרוביאלי.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא לא לשתק יתר על המידה את התולעים לפני דיסקציה כמו זה יכול לעכב שחול המעי המקסימלי.