בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

הליך זה התייחס לצורך באיסוף שלפוחית חוץ-תאית פשוטה ואמינה ממזנכימלית שמקורה בתאי גזע, וביישום בתרגום מחקרים. איסוף שלפוחיות חוץ-תאיות על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית הוא פשוט, ניתן להרחבה בקלות וניתן לשחזור, אשר יהיה שימושי לתחום. Extracellular vesicles indistinct}from indistinct}mesenchymel stem cell is instinct}application in modern disease therapies.

אני לא אפחד מטעויות. פעולה זו פשוטה וקלה ללמידה. ישנם פרטים רבים בתוכנית פשוטה זו שניתן להציג טוב יותר באמצעות וידאו.

בתור התחלה, תרבית את תאי הגזע המזנכימליים ליותר מ-90% מפגש. החליפו את מדיום התרבית בכל מנה ב-8 מ"ל של תוסף אלפא-MEM. לאחר 48 שעות של תרבית, התאים חייבים להיות מגודלים באופן שווה כדי לאסוף באופן מלא את מדיום התרבית לתוך צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל.

לאחר מכן, צנטריפוגו את מדיום התרבית ב 800 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חרוטיים בנפח 1.5 מ"ל כדי להסיר את שברי התא ואת פסולת התא. צנטריפוגה supernatant ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השתמש פיפטה כדי להעביר את המתלה צינורות אולטרה צנטריפוגה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 150, 000 x גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את גלולת microvesicle ב 50 uL של PBS לכל מנה.

השליכו את הסופרנאטנט ואספו את השאריות, שהן אקסוזומות. השהה מחדש את האקסוזומים משבע צלחות של תאים ב- 50 uL של PBS. בצינור 15 מ"ל, לדלל 1 uL של שלפוחיות חוץ-תאיות ב 1, 499 uL של PBS ולערבב.

לאחר מכן, הפעל את התוכנה התואמת עבור מנתח המעקב. מלא את תא הדגימה במים מזוקקים ולאחר מכן אפשר למכשיר להתחיל את בדיקת התא. כייל את המכשיר עם פתרון סטנדרטי מוכן.

ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה הוא בין 50 ל- 400, רצוי בסביבות 200, ולחץ על אישור. לאחר מכן, לשטוף את תא הדגימה עם 5 מ"ל של מים מזוקקים. לפני ניתוח הדגימה, לשטוף את התעלה עם 1 מ"ל של מים מזוקקים.

ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה קטן מ- 10. בצינור חרוטי של 1.5 מ"ל, להשעות מחדש את השלפוחיות החוץ תאיות עם 250 uL של PBS. בצינור חרוטי נוסף של 1.5 מ"ל, הכינו את פתרון העבודה של צבע PKH26.

מערבבים את השלפוחיות החוץ תאיות המושעות מחדש עם פתרון העבודה. אפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ולאחר מכן הוסף 500 uL של FBS מדולדל EV כדי לעצור את התגובה. עבור microvesicles, צנטריפוגה ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי לשטוף את השאריות. צנטריפוגה שוב, ולהשליך את supernatant כדי להסיר את הצבע unbound.

עבור microvesicles, צנטריפוגה ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות מחדש את השאריות עם 200 uL של PBS. שחררו 20 uL של השעיה על המגלשה והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

יש להשהות מחדש שלפוחיות חוץ-תאיות ב-200 uL של PBS, ולאחר מכן לערבב עם תמיסת הפרין ביחס נפח של 10:1. הכנס את העכבר למערכת הדמיית הוורידים הקאודליים. לחץ על המתג כדי להרים את הידית.

בעזרת מאייר ורידים זנב, לבצע הזרקה שיטתית של מתלה שלפוחית תאית דרך וריד הזנב. ניתוח התפלגות גודל החלקיקים באמצעות נת"ע הראה כי גודל האקסוזומים מתאי גזע מזנכימליים אנושיים נע בין 40 ל-335 ננומטר, עם גודל שיא של כ-100 ננומטר. כמו כן, גודל microvesicles נע בין 50 ל 445 ננומטר, עם גודל שיא של 150 ננומטר.

אפיון מורפולוגי של אקסוזומים הראה שהם הציגו צורת טיפוסית. שלפוחיות חוץ-תאיות סומנו ביעילות על ידי PKH26, שנצפה על ידי התצוגה הגסה ככדורים מסומנים, כמו גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המפעיל צריך לשים לב במהלך איסוף supernatant, כי תאים חייבים להיות מנופחים באופן שווה כדי לאסוף באופן מלא את EV שוחרר נשמר instinct} של תאי גזע mesenchymal.

על מנת לאמת את הצלחת ההזרקה, ניתן לבצע הדמיה in vivo של הפצה ביולוגית של כלי רכב חשמליים המסומנים בפלואורסצנטיות או מקטעים קפואים של אתרי רקמה ספציפיים של קליטה.