Name: טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד פרוטוקול הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים. שיטה זו מאפשרת מחקר של פונקציית גנים ואינטראקציות עם פתוגנים, ותורמת לפיתוח אסטרטגיות לבקרת אוכלוסיות וחיסונים נגד מחלות כמו מחלת ליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחנה אלוביהארה וליונוס גברמיקלה, ITF, UMD, על תובנות ותמיכה בשלב הראשוני של פיתוח הפרוטוקול. מחטי טונגסטן היו מתנה נדיבה מדיוויד או'ברוצ'טה, ITF, UMD. אנו מודים לד"ר לדיסלב סימו על בדיקת פרוטוקול זה ב - I. ricinus ועל דיונים תובנה. פרויקט זה מומן על ידי NIH-NIAID R21AI128393 וקרן פלימות' היל, ניו יורק ל- MG-N, קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת נבאדה ל- AN, מענק הקרן הלאומית למדע מס ' 2019609 ל- MG-N ו- AN, ומענק עמית לעמית מ- IGTRCN ל- AS.

בוגרי Ixodes scapularis נרכשו מאוניברסיטת אוקלהומה סטייט (OSU) או גודלו באוניברסיטת נבאדה, רינו (UNR) (פרוטוקול IACUC #21-001-1118).
1. הכנת קרציות נקבות לאיסוף עוברים
הערה: כדי לאסוף ביצים בגיל המתאים, חשוב לסנכרן את הטלת הביצים. למרות שרמזים להטלת ביצים בקרציות עדיין אינם ברורים, בתנאי החרקים הסטנדרטיים (טמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של >90% (RH)), נקבות I. scapularis מתחילות להטיל ביצים כ-8 ימים לאחר ניתוק הפונדקאי. ניתן להאריך ציר זמן זה על ידי אחסון נקבות גדושות ב -4 מעלות צלזיוס. אחסנו נקבות שניזונו מדם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 8 שבועות ללא כל השפעה שלילית על הטלת הביצים. ייתכן שיהיה צורך לשנות תנאים אלה עבור כל חרק.
<ol><li>יש לאחסן את כל הנקבות הגדושות בטמפרטורה של 4°C עם >90% RH בקופסת פלסטיק של 6 ליטר מרופדת בנייר סינון לח עד לשימוש במיקרו-הזרקות.</li>
	<li>שבוע לפני הזריקות, מעבירים את הנקבות מ-4 מעלות צלזיוס לאינקובטור של 27 מעלות צלזיוס להתחלת הטלת ביצים.</li>
	<li>כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים (3-4 ימים לאחר העברתן ל-27 מעלות צלזיוס), הסירו את כל הביצים באמצעות מכחול דק והכינו את הנקבות לאבלציה של איבריה (בלוטת השעווה) של ג'נה. הערה: האיבר של הג'נה משתרע מהאזור שבין החרטום לקפיטולום (הבסיס הגבי של חלקי הפה), חלקי הפה מתכופפים על פני השטח של הגוף הגחוני (במקביל לפני השטח), והאיבר המורחב של הגן מצפה ביצים ברגע שהביצים מוטלות (איור 1). ביצים שהוטלו לפני הסרת איברים של Gené או ריקון של שעווה יהיה ציפוי שעווה והם אינם מתאימים להזרקות ויש להשליך אותם.</li>
	<li>כדי להסיר או לרוקן את איבר הז'נה, השתמשו בחימר כדי למקם את הנקבה הסגורה על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ המכוון כך שחלקי הפה ייראו הן בצד הגחוני והן בצד הגבי (איור 1B,C).<ol><li>יש לתקוע בזהירות את האזור בדיוק בין החרטום לחלקי הפה באמצעות מלקחיים עדינים ומחטי טונגסטן המיוצרים במעבדה באמצעות חוט טונגסטן בעקבות פרוטוקול16 שפורסם בעבר (ניתן לרכוש מחטים גם באופן מסחרי, ולחבר אותן לבדיקה מיקרו-ניתונית, ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>אם תעבדו את הדרך פנימה עם מחט הטונגסטן, משכו את בלוטת השעווה החוצה (איור 1D,E). זה עשוי לקחת כמה דקות כדי להסיר את הבלוטה. נגבו כל הפרשת שעווה נוזלית באמצעות מגבוני מעבדה. הערה: ניתן להסיר את הבלוטה גם מהצד הגחוני ממש מתחת לחלקי הפה; על ידי הושטת יד מאחור לכיוון scutum עם מחט ומלקחיים. מריחת דבק סיליקון סביב חלקי הפה גם חוסמת את אוורור האיברים של ג'ין וניתן להשתמש בה במקום להסיר או לרוקן את השעווה (תקשורת אישית עם ד"ר לדיסלב סימו, INRAE, צרפת). קרציות דחוסות לא יישארו על קלטת דו צדדית. שימוש בחימר כדי "לחטוף" את הקרצייה עוזר לשמור אותם במקומם במהלך מניפולציה. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את מחט קרצית טונגסטן עבור דיסקציה. החלק הגחוני קל יותר לנקב עם מחט המועדף על ידי המחברים.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לרוקן את הבלוטה, סדרו את קרציית הגרביד כאמור בשלב 1.4. לנקב בזהירות את האזור שמאחורי חלקי הפה בצד הגבי ולהפעיל לחץ על הצד הגחוני באמצעות מלקחיים. הערה: לחלופין, אין צורך להסיר את בלוטת השעווה; ריקון בלוטת השעווה יימשך מספר ימים. לנקבות מטילות ביצים יש אזור לבן סביב חלקי הפה המציין את מיקום בלוטת השעווה וניתן להשתמש בו כהפניה.<ol><li>מניחים את הקצה של מגבון מעבדה ללא מוך ומסירים את השעווה הנוזלית שיוצאת מאתר הניקוב. הקפד למנוע הפרשת המולימפה, שהוא נוזל צלול לעומת שעווה צמיגה צהבהבה מעט. זה עלול לקחת 5-10 דקות עד שרוב השעווה מוסרת.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר מניפולציה, מניחים את הנקבות באינקובטור ב 27 מעלות צלזיוס (>90% לחות יחסית) ומאפשרים להן להתאושש במשך 1-2 ימים. הערה: לנקבות מטופלות לוקח בדרך כלל 1-2 ימים להתאושש ולהתחיל להטיל ביצים שוב.</li>
	<li>כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים שוב, השתמשו במכחול עדין כדי לאסוף ביצים שזה עתה הופקדו (0-18 שעות לאחר הטלת הביצים) והניחו אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הערה: אם משתמשים בביציות מאותה נקבה לאורך זמן, יש לחזור על הליך זה לאחר 4-5 ימים של הטלת ביצים אם הבלוטות לא הוסרו.</li>
</ol>2. טיפול בעובר עבור microinjections
<ol><li>הוסף ~ 200 μL (או נפח מספיק כדי לכסות את הביצים, תלוי במספר הביצים) של 5% (משקל / נפח) benzalkonium כלוריד / מים (ראה טבלת חומרים) בצינור המכיל 0-18 שעות ביצים ישנות. מערבבים בעדינות את הביצים עם המכחול למשך 5 דקות כדי למנוע מהביצים לשקוע בתחתית הצינור (לפרטים ראו שארמה ואחרים 4). הסר את supernatant באמצעות micropipette, משאיר את הביצים מאחור בצינור. אזהרה: בנזלקוניום כלוריד הוא קורוזיבי לעור ולעיניים, לובש כפפות ומגן על העיניים.</li>
	<li>הוסף ~ 200 μL של מים מזוקקים (DI) לצינור המכיל ביצים, מערבל עם מכחול, והסר את המים מצינור microcentrifuge באמצעות micropipette. חזרו על הכביסה עם מי DI פעם נוספת.</li>
	<li>לאחר השטיפה במי DI, יש להוסיף ~200 μL של נתרן כלורי (NaCl) של 5% (w/v) ולסובב בעדינות עם מכחול למשך 5 דקות. הסר את הפתרון מן הצינור לאחר 5 דקות ולשטוף את הביצים פעמיים עם מים DI.</li>
	<li>הוסף ~ 100 μL של 1% (w / v) תמיסת NaCl בצינור microcentrifuge המכיל ביצים. שמור את הביצים בתמיסת NaCl של 1% (w/v) עד שהן משמשות להזרקות.</li>
	<li>התחל מיקרו-הזרקות לאחר כשעה. ציר זמן זה מסייע בייבוש תקין של הביצים ומונע מהן להתפוצץ. הערה: ניתן לשמור ביצים בתמיסת NaCl של 1% (w/v) למשך 7-8 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי על ההישרדות. אם הביציות קשות להזרקה או להתפוצצות, אז הביציות אינן מיובשות מספיק וניתן לטפל בהן עוד יותר עם 5% (w/v) NaCl למשך 5 דקות נוספות.</li>
</ol>3. הכנת מחטי הזרקה
<ol><li>הכנס זכוכית נימי אלומיניום (עם נימה, ראה טבלת חומרים) לתוך מושך המחט בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>התאם את מושך המחט להגדרות הבאות: חום: 575, משיכה: 20, מהירות: 50, זמן: 200, ולחץ : 700.</li>
	<li>הפעל את פונקציית המשיכה של מושך המחט וחזור על התהליך לקבלת מחטים נוספות.</li>
	<li>אחסנו את המחטים המשוכות על ידי הדבקתן לשורות של חימר דוגמן בצלחת פטרי נקייה.</li>
	<li>טען את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה מעמיס מיקרו (ראה טבלת חומרים). הערה: ההשוואה בין מחטים המשמשות להזרקת עוברי קרציות ויתושים מוצגת באיור 2.</li>
</ol>4. הגדרת שקופיות למיקרו-הזרקות
<ol><li>באמצעות סרט דו-צדדי, הדביקו שני מיקרוסקופ זכוכית ששקופיות זו לזו, והשאירו מרווח של כ-0.5 ס"מ כדי לתמוך ביישור ביצים ולמנוע את התהפכותן במהלך הזרקות (איור 3A).</li>
	<li>מרחו חתיכת חבישת סרט שקופה (ראו טבלת חומרים) על הסרט הדו-צדדי ברווח שבין השקופיות. הקפידו ליישר את הלבשת הסרט בצורה מושלמת עם הפער.</li>
</ol>5. מיקרו-הזרקות לעוברים
<ol><li>יישרו 8-10 ביצים בכל פעם במערך ההחלקה (לעיל) באמצעות מברשת צבע בעלת שיער אחד. הערה: ביצים המיושרות עם הציר הארוך יותר הניצב (איור 3B) לקצה המגלשה קלות יותר להזרקה מאשר ביצים שציר האורך שלהן מיושר במקביל לקצה (איור 3C). ביצים בכיוון הניצב (איור 3B) יכולות לעמוד טוב יותר בהזרקה וכתוצאה מכך לשרוד גבוה יותר.</li>
	<li>מניחים את המגלשה עם ביצים מיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב. השתמש בחתיכת מגבון ללא מוך כדי להסיר את תמיסת NaCl 1% שבה הם מאוחסנים.</li>
	<li>חברו את מחט ההזרקה המלאה למיקרו-אינז'קטור המחובר למיקרומניפולטור (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>פתח את המחט על ידי שפשוף עדין על משטח הביצה באמצעות הגדרה בלחץ גבוה על המיקרו-אינז'קטור (>5,000 hPa).</li>
	<li>לאחר פתיחת המחט, הפחיתו את הלחץ (1,000-2,500 hPa) של המיקרו-אינז'קטור, בהתאם לפתח המחט. הערה: פתח קטן ידרוש לחץ גבוה יחסית, בעוד שפתח גדול יותר ידרוש לחץ נמוך יותר. זאת כדי לשלוט על עוצמת הקול של המבנה מוזרק. בהתאם לגודל פתח המחט, נפח ההזרקה ישתנה בין 1-5 pL.</li>
	<li>מזריקים את כל הביצים על המגלשה בזווית של 10°-15° מהר ככל האפשר ומיד מעבירים את המגלשה לתנאי לחות גבוהה בצלחת פטרי מרופדת בנייר לח. ברגע שהביצים מוזרקות, הן מתחילות להתייבש. הערה: הזרקת מספר קטן של ביציות בכל פעם מגדילה את הצלחת ההזרקה ואת סיכויי ההישרדות. מחטים אכן נסתמות על ידי רפלוקס עוברי. אם הקצה עדיין חד, כדי לנקות מחטים סתומות, העבירו את המחט לתוך טיפה קטנה של 1% NaCl שנוספה לקצה המגלשה. הפעולה הנימית תנתק את הסתימה הקטנה. אם המחט כבר קהה, שנה אותה.</li>
</ol>6. טיפול בעוברים לאחר הזרקה
<ol><li>הניחו את השקופית המכילה עוברים מוזרקים בצלחת פטרי גדולה מרופדת בנייר סינון לח. הערה: חשוב מאוד לא להפריע לביצים לפחות 5-6 שעות. זה מאפשר לפצע ההזרקה לאטום כראוי. פצע ההזרקה עלול להיפתח כאשר הוא נסער, וציטופלסמה עלולה להתחיל לטפטף החוצה, וכתוצאה מכך תמותת ביצים.</li>
	<li>לאחר 5-6 שעות, הוסיפו טיפה קטנה של מי DI להלבשת הסרט השקוף עם עוברים מוזרקים מחוברים. בעזרת מכחול, מזיזים בעדינות את הביצים. מעבירים את הביצים לצלחת פטרי קטנה (10 ס"מ) וטובלים אותן במי DI. הערה: חבישת הסרט מאפשרת הסרה קלה של ביצים לאחר הזרקות. ברגע שמוסיפים טיפת מים לרוטב הסרט, הביצים יתחילו לנוע יחד עם המים.</li>
	<li>השאירו את הביצים שקועות במים והניחו את צלחת הפטרי בקופסת פלסטיק של 6 ליטר באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו->90% לחות יחסית.</li>
	<li>בדוק את הביצים באופן קבוע, מדי יום במשך הימים הראשונים, ולאחר מכן כל 3-4 ימים עד הזחלים מתחילים לבקוע. הערה: אם מספר גדול של ביצים ניזוקו במהלך מיקרו-הזרקות, ניקוז עדין של מי ה-DI לאחר שבוע ימנע צמיחה פטרייתית על הביצים המתות.</li>
	<li>כאשר הזחלים מתחילים לבקוע מהעוברים המוזרקים (21-25 יום לאחר ההזרקה למערך המעבדה הנוכחי), בדקו אותם מדי יום והעבירו את כל הזחלים שבקעו לבקבוקוני זכוכית עם מסך למעלה. זחלים יכולים לבקוע מתחת למים ולשרוד ~ 1-2 שבועות.</li>
	<li>מסננים את הזחלים4 אם הביצים הוזרקו עם מבנה שעלול לגרום לפנוטיפ נראה לעין.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זהו הפרוטוקול הראשון שפותח כדי להזריק עוברים מוקדמים של קרציות בהצלחה. הושג שיעור הישרדות של ~4%-8%, הדומה להזרקת עוברים במודלים מבוססים אחרים של חרקים5.
מכיוון שזהו הפרוטוקול הראשוני, צפוי כי פרוטוקול זה ישוכלל עוד יותר ויתמחה במיני קרציות בודדים. בפרט, תזמון ההזרקה ישתנה ממין למין, תלוי בעוברים, במיוחד בתזמון ההתא. הנתונים הראשוניים מצביעים על כך שביצי I. scapularis אינן עוברות חלוקה גרעינית מהירה ב-24 השעות הראשונות לאחר ההטלה וההתא מתרחש כמה ימים לאחר מכן (...

קרציות הן וקטורים בעלי חשיבות רפואית ווטרינרית, המסוגלים להעביר מגוון של פתוגנים ויראליים, חיידקיים, פרוטוזואניים ונמטודות 1,2. במזרח ארצות הברית, הקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis, היא וקטור חשוב של פתוגן מחלת ליים (LD), spirochete Borrelia burgdorferi. מעל 400,000 מקרים של LD מדווחים מדי שנה בארצות הברית, מה שהופך אותה למחלה הזיהומית המובילה המועברת על ידי וקטורים בארה"ב1. בנוסף ל- B. burgdorferi, שישה מיקרואורגניזמים אחרים מועברים על ידי I. scapularis - כולל ארבעה חיידקים (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi, ו- Ehrlichia muris eauclarensis), טפיל פרוטוזואני אחד (Babesia microti) ונגיף אחד (וירוס Powassan), מה שהופך את מין הקרציות הזה לדאגה מרכזית לבריאות הציבור3 . בעוד שמחלות המועברות על ידי קרציות הפכו נפוצות יותר בשנים האחרונות, המחקר על קרציות השתרך מאחורי וקטורים אחרים של פרוקי רגליים, כגון יתושים, בשל הביולוגיה הייחודית של הקרציות והאתגרים הקשורים ליישום כלים גנומיים גנטיים ותפקודיים 4,5.
טכניקות לעריכת גנים, במיוחד CRISPR/Cas9, הפכו כעת מחקרי גנומיקה פונקציונליים לאפשריים באורגניזמים שאינם מודלים. ליצירת מוטציות תורשתיות באורגניזם, הזרקת עוברים נותרה השיטה המועדפת להעברת מבנים לשינוי הנבט 6,7,8,9. עם זאת, עד לאחרונה4, ביצי קרציות נחשבו קשות מדי או אפילו בלתי אפשריות להזרקה מבלי להרוג את העובר10,11. שכבת שעווה עבה על ביציות, כוריון קשה ולחץ תוך-סגלגל גבוה היו חלק מהמכשולים העיקריים שמנעו הזרקת עוברים בקרציות. 1. scapularis בוגרים, הניזונים מדם, מפקידים מצמד יחיד של עד 2,000 ביצים12 במשך 3-4 שבועות (כ-100 ביצים ביום). ביצים מוטלות בנפרד, וכל ביצה מצופה בשעווה המופרשת על ידי בליטות או "קרניים" של איבר ג'נה הבלוטתי13,14,15 של האם. שעווה זו מגנה על הביצים מפני ייבוש ומכילה תרכובות אנטי מיקרוביאליות15. כדי להזריק בהצלחה ביצי קרציות, חשוב להסיר את שכבת השעווה, לרכך את הכוריון, ולייבש את הביצים כדי להקטין את הלחץ התוך-אובלי, כך שההזרקה לא תפגע באופן בלתי הפיך בביצית. מתוך הבנת החשיבות הקריטית של הזרקות עוברים לטרנספורמציה מוצלחת של חיידקים, פותח פרוטוקול עבור I. scapularis, אשר ניתן להשתמש בו כדי לספק מבנה CRISPR/Cas9 וליצור מוטציות נבט יציבות4. בנוסף לתרומתו למחקר I. scapularis, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם למיני קרציות אחרים.

<table><tbody><tr><td>נימי אלומיניום סיליקט, עם נימה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>AF100-64-10</td><td>הזרקת עובר</td></tr><tr><td>בנזלקוניום כלוריד 50% במים, 25 גרם</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>טיפול בעובר, 25 גרם הוא כ 25 מ"ל</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>טיפול לאחר הזרקה</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>300-101</td><td>איבר הגן מניפולציה</td></tr><tr><td>מגבוני מעבדה</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס</td><td>אפנדורף</td><td>930001007</td><td>טעינת המחטים המשוכות</td></tr><tr><td>מכשירי מיקרומניפולטור</td><td>סאטר</td><td>ROE-200</td><td>הזרקת עוברים</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופיות- קצוות קרקע רגילים Genesee</td><td>Scientific</td><td>29-100</td><td>יישור עובר, קצוות קרקע עדיפים, קצוות משופעים יכולים לטשטש את הביצים מהתצוגה</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td>טיפול בעוברים</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי קבוע</td><td>סקוטש</td><td>34-8716-3417-5</td><td>יישור עוברים</td></tr><tr><td>לוחות פטרי</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>טיפול לאחר הזרקה</td></tr><tr><td>Tegaderm / שקוף חבישת סרטים</td><td>3M Healthcare</td><td>1628</td><td>יישור עוברים</td></tr><tr><td>מחטי טונגסטן</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>מניפולציה של איברים של גן</td></tr><tr><td>חוט טונגסטן</td><td>מניפולציה של איברים של אמזון</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>ג'ין</td></tr><tr><td>XenoWorks מכשירי מיקרו-מזרק דיגיטליים</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MPC-200</td><td>הזרקת עובר</td></tr></tbody></table>

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

קרציות יכולות להעביר פתוגנים ויראליים, חיידקיים ופרוטוזואניים שונים ולכן נחשבות לווקטורים בעלי חשיבות רפואית ווטרינרית. למרות הנטל הגובר של מחלות המועברות על ידי קרציות, המחקר על קרציות פיגר אחרי וקטורים של מחלות חרקים בשל אתגרים ביישום כלי טרנספורמציה גנטית למחקרים פונקציונליים לביולוגיה הייחודית של הקרציות. התערבויות גנטיות צוברות תשומת לב כדי להפחית מחלות המועברות על ידי יתושים. עם זאת, פיתוח של התערבויות כאלה דורש טרנספורמציה יציבה germline על ידי הזרקת עוברים. טכניקת הזרקת עוברים כזו חסרה לכליצרטים, כולל קרציות. מספר גורמים, כגון שכבת שעווה עבה חיצונית על עוברי קרציות, כוריון קשה ולחץ תוך-סגלגל גבוה, הם כמה מכשולים שמנעו בעבר התפתחות פרוטוקול הזרקת עוברים בקרציות. העבודה הנוכחית התגברה על מכשולים אלה, וטכניקת הזרקת עוברים עבור הקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis, מתוארת כאן. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק רכיבים, כגון CRISPR/Cas9, לטרנספורמציות נבט יציבות.

פרוטוקול הזרקת עובר מוצלח עבור I. scapularis מתואר במאמר זה. נקבות מטילות ביצים הוחזקו בלחות גבוהה כדי למנוע ייבוש של ביצים שעווה חלקית. שכבת השעווה הוסרה כדי להזריק לעוברי קרציות על-ידי השמטת איבר הגן (בלוטת השעווה) של נקבת הגרביד (איור 1A-E). השתמשנו במחטי זכוכית אלומינוסיליקטיות עם צוואר קצר יותר (איור 2). צורה זו הייתה אידיאלית להזרקת ביצי קרציות מכיוון שהיא יכלה לסבול את הלחץ טוב יותר מהמחט ארוכת הצוואר (מחודדת) המ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוברי קרציות. הזרקת עובר היא הטכניקה המועדפת למניפולציה גנטית ליצירת קווים מהונדסים.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

זהו פרוטוקול הזרקת העובר הראשון עבור זן Chelicerata. היכולת להזריק עוברי קרציות תפתח קווי מחקר רבים, בפרט, מחקרים על תפקוד גנים של קרציות ואינטראקציות עם פתוגנים של קרציות. טכניקה זו מאפשרת עבודה עתידית על מחקרים פונקציונליים של גנים של קרציות ומספקת בסיס לשליטה באוכלוסיית הקרציות באמצעות מערכות הנעה גנטית.שיטה זו תקל על הבנת האינטראקציה בין הקרציות לבין הפתוגנים שהן נושאות ברמה המולקולרית. זה יאפשר לנו לזהות חלבונים שיכולים לשמש לפיתוח חיסונים למחלת ליים ופתוגנים אחרים. בעוד שמספר תחומי מחקר כגון אינטראקציות פתוגנים של קרציות והעברת פתוגנים לפונדקאים על ידי קרציות במהלך ההאכלה ירוויחו מעבודה זו.שאלות בסיסיות יותר, כמו כיצד קרציות מתחמקות מתגובה חיסונית של פונדקאי, וניתן להבין כעת גם הבדלים במנגנוני תיקון הדנ"א. ישנם כמה היבטים של ביולוגיה של קרציות שיש להבין לפני ביצוע הליך זה. הלחץ הפנימי הגבוה של העובר מוביל להתפוצצות כאשר נוגעים במחט.חשוב מאוד להכין עוברים להזרקה. כדי להתחיל, להעביר נקבות מארבע מעלות צלזיוס לחממה של 27 מעלות צלזיוס להתחלת הטלת ביצים שבוע לפני הזריקות. לאחר שלושה עד ארבעה ימים שבהם הנקבות מתחילות להטיל ביצים, הסירו את כל הביצים באמצעות מכחול דק תוך כדי הכנת הנקבות לאבלציה של איבריו של ג'ין.כדי לרוקן את הבלוטה, סדרו את קרציית הגרביד על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ באופן שחלקי הפה ייראו הן בצד הגחוני והן בצד הגבי. לאחר מכן לנקב בזהירות את האזור שמאחורי חלקי הפה בצד הגבי, ולהפעיל לחץ על הצד הגחוני באמצעות מלקחיים. מניחים את הקצה של מגבון ללא מוך ומסירים את השעווה הנוזלית שיוצאת מאתר הניקוב.לחלופין, במקום לרוקן את הבלוטה על ידי דיסקציה, ניתן להשתמש בדבקים כגון דבק רקמות סביב חלקי הפה של הקרציות. כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים שוב, השתמשו במכחול דק כדי לאסוף ביצים שזה עתה הופקדו והניחו אותן בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסיפו כ-200 מיקרוליטרים של מי בנזלקוניום כלוריד 5% בצינור המכיל ביצים בנות אפס עד 18 שעות.מסובבים בעדינות את הביצים עם המכחול במשך חמש דקות כדי למנוע מהביצים לשקוע בתחתית הצינור, ומסירים את הסופרנאטנט באמצעות מיקרו פיפטה, ומשאירים את הביצים מאחור בצינור. מוסיפים כ-200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לצינור המכיל ביצים. מערבלים עם מכחול ומסירים את המים מצינור המיקרו-צנטריפוגה באמצעות מיקרו-פיפטה.לאחר השטיפה במים מזוקקים, יש להוסיף כ-200 מיקרוליטרים של 5% נתרן כלורי ולסובב בעדינות עם מכחול במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את הפתרון מן הצינור לאחר חמש דקות, ולשטוף את הביצים פעמיים עם מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסיפו כ-100 מיקרוליטרים של תמיסת נתרן כלורי 1% בצינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל ביצים.ראשית, הדביקו שני מיקרוסקופים מזכוכית ששקופיות זו לזו, והשאירו מרווח של כ-0.5 ס"מ כדי לתמוך ביישור ביצים באמצעות סרט דו-צדדי, והניחו חתיכת סרט שקוף על הסרט הדו-צדדי במרווח שבין השקופיות. לאחר מכן יישרו שמונה עד 10 ביצים בכל פעם במערך השקופיות באמצעות מברשת צבע. לאחר מכן מניחים את המגלשה עם ביצים מיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב ומסירים את תמיסת 1% נתרן כלורי באמצעות חתיכת מגבון ללא מוך שבו הם מאוחסנים.חבר את מחט ההזרקה המלאה למזרק מיקרו המחובר למיקרו מניפולטור. לאחר מכן, פתח את המחט על ידי שפשוף עדין על משטח הביצה באמצעות הגדרת לחץ גבוה על מזרק המיקרו. לאחר פתיחת המחט, הפחיתו את הלחץ של מזרק המיקרו בהתאם לפתיחת המחט.לאחר מכן הזריקו את כל הביצים על המגלשה בזווית של 10 עד 15 מעלות מהר ככל האפשר, לחצו במהירות על דוושת הרגל, ומיד העבירו את המגלשה לתנאי לחות גבוהים בצלחת פטרי עם מגבת נייר לחה. לאחר חמש עד שש שעות של הנחת המגלשה המכילה עוברים מוזרקים בצלחת פטרי גדולה מרופדת בנייר פילטר לח, הוסיפו טיפה קטנה של מים מזוקקים לתחבושת הסרט השקוף עם עוברים מוזרקים מחוברים. לאחר מכן, מזיזים בעדינות את הביצים באמצעות מכחול.לאחר מכן, מעבירים את הביצים לצלחת פטרי קטנה ומטביעים אותן במים מזוקקים. השאירו את הביצים שקועות במים, הניחו את צלחת הפטרי בקופסת פלסטיק של שישה ליטרים באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של יותר מ-90%. כאשר הזחל מתחיל לבקוע מהעוברים המוזרקים 21 עד 25 יום לאחר ההזרקה, בדקו אותם מדי יום והעבירו את כל הזחלים שבקעו לבקבוקוני זכוכית עם מסך למעלה.התוצאות הראו כי הזרקת הביציות בשלב מוקדם של העובר בנות 12 עד 18 שעות, ויישור הציר הארוך יותר של הביצית בניצב לקצה השקופית מביאים לשיעור הישרדות גבוה יותר של הביציות המוזרקות. מתוך כל הביצים שהוזרקו, עד 8.5% שרדו והזחל בקע. לפני תחילת הליך זה, חשוב לזכור את שלבים 2.4, הסרת השעווה מסמן האם, ושלבים 3.1 עד 3.4, ריכוך כוריון העובר עם בנזלקוניום כלוריד, וייבוש העובר בתמיסות נתרן כלורי כדי לאפשר הזרקה מוצלחת של העובר.שיטה זו פותחה בעיקר לעריכת גנים של קרציות, והיא תאפשר לנו לבצע נוקאאוטים ודפיקות שיעזרו לנו להבין את תפקוד הגן של הקרציות. טכניקה זו תאפשר שימוש בכלי עריכת גנים הזמינים עבור אורגניזמים רבים אחרים כדי ליישם אותם בחקר קרציות. וזה יאיץ את המחקר בביולוגיה מולקולרית של קרציות.

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

ההפקה של קרציות מעבדה-שגדל בריאה חיונית מחקרים על ביולוגית קרציה, וסמן-הפתוגן אינטראקציות. כאן אנו מדגימים פרוטוקול פשוט עבור האכלה לתקתק בשלה כי היא חסכונית ופחות מלחיץ לעכברים.

Rearing<em&gt; Scapularis קרצית,</em&gt; את הטיק השחור רגליים: האכלת שלבי Immature על עכברים

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

למד פרוטוקול הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים. שיטה זו מאפשרת מחקר של פונקציית גנים ואינטראקציות עם פתוגנים, ותורמת לפיתוח אסטרטגיות לבקרת אוכלוסיות וחיסונים נגד מחלות כמו מחלת ליים.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

גלה סרטונים נוספים