טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

זהו פרוטוקול הזרקת העובר הראשון עבור זן Chelicerata. היכולת להזריק עוברי קרציות תפתח קווי מחקר רבים, בפרט, מחקרים על תפקוד גנים של קרציות ואינטראקציות עם פתוגנים של קרציות. טכניקה זו מאפשרת עבודה עתידית על מחקרים פונקציונליים של גנים של קרציות ומספקת בסיס לשליטה באוכלוסיית הקרציות באמצעות מערכות הנעה גנטית.

שיטה זו תקל על הבנת האינטראקציה בין הקרציות לבין הפתוגנים שהן נושאות ברמה המולקולרית. זה יאפשר לנו לזהות חלבונים שיכולים לשמש לפיתוח חיסונים למחלת ליים ופתוגנים אחרים. בעוד שמספר תחומי מחקר כגון אינטראקציות פתוגנים של קרציות והעברת פתוגנים לפונדקאים על ידי קרציות במהלך ההאכלה ירוויחו מעבודה זו.

שאלות בסיסיות יותר, כמו כיצד קרציות מתחמקות מתגובה חיסונית של פונדקאי, וניתן להבין כעת גם הבדלים במנגנוני תיקון הדנ"א. ישנם כמה היבטים של ביולוגיה של קרציות שיש להבין לפני ביצוע הליך זה. הלחץ הפנימי הגבוה של העובר מוביל להתפוצצות כאשר נוגעים במחט.

חשוב מאוד להכין עוברים להזרקה. כדי להתחיל, להעביר נקבות מארבע מעלות צלזיוס לחממה של 27 מעלות צלזיוס להתחלת הטלת ביצים שבוע לפני הזריקות. לאחר שלושה עד ארבעה ימים שבהם הנקבות מתחילות להטיל ביצים, הסירו את כל הביצים באמצעות מכחול דק תוך כדי הכנת הנקבות לאבלציה של איבריו של ג'ין.

כדי לרוקן את הבלוטה, סדרו את קרציית הגרביד על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ באופן שחלקי הפה ייראו הן בצד הגחוני והן בצד הגבי. לאחר מכן לנקב בזהירות את האזור שמאחורי חלקי הפה בצד הגבי, ולהפעיל לחץ על הצד הגחוני באמצעות מלקחיים. מניחים את הקצה של מגבון ללא מוך ומסירים את השעווה הנוזלית שיוצאת מאתר הניקוב.

לחלופין, במקום לרוקן את הבלוטה על ידי דיסקציה, ניתן להשתמש בדבקים כגון דבק רקמות סביב חלקי הפה של הקרציות. כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים שוב, השתמשו במכחול דק כדי לאסוף ביצים שזה עתה הופקדו והניחו אותן בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסיפו כ-200 מיקרוליטרים של מי בנזלקוניום כלוריד 5% בצינור המכיל ביצים בנות אפס עד 18 שעות.

מסובבים בעדינות את הביצים עם המכחול במשך חמש דקות כדי למנוע מהביצים לשקוע בתחתית הצינור, ומסירים את הסופרנאטנט באמצעות מיקרו פיפטה, ומשאירים את הביצים מאחור בצינור. מוסיפים כ-200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לצינור המכיל ביצים. מערבלים עם מכחול ומסירים את המים מצינור המיקרו-צנטריפוגה באמצעות מיקרו-פיפטה.

לאחר השטיפה במים מזוקקים, יש להוסיף כ-200 מיקרוליטרים של 5% נתרן כלורי ולסובב בעדינות עם מכחול במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את הפתרון מן הצינור לאחר חמש דקות, ולשטוף את הביצים פעמיים עם מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסיפו כ-100 מיקרוליטרים של תמיסת נתרן כלורי 1% בצינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל ביצים.

ראשית, הדביקו שני מיקרוסקופים מזכוכית ששקופיות זו לזו, והשאירו מרווח של כ-0.5 ס"מ כדי לתמוך ביישור ביצים באמצעות סרט דו-צדדי, והניחו חתיכת סרט שקוף על הסרט הדו-צדדי במרווח שבין השקופיות. לאחר מכן יישרו שמונה עד 10 ביצים בכל פעם במערך השקופיות באמצעות מברשת צבע. לאחר מכן מניחים את המגלשה עם ביצים מיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב ומסירים את תמיסת 1% נתרן כלורי באמצעות חתיכת מגבון ללא מוך שבו הם מאוחסנים.

חבר את מחט ההזרקה המלאה למזרק מיקרו המחובר למיקרו מניפולטור. לאחר מכן, פתח את המחט על ידי שפשוף עדין על משטח הביצה באמצעות הגדרת לחץ גבוה על מזרק המיקרו. לאחר פתיחת המחט, הפחיתו את הלחץ של מזרק המיקרו בהתאם לפתיחת המחט.

לאחר מכן הזריקו את כל הביצים על המגלשה בזווית של 10 עד 15 מעלות מהר ככל האפשר, לחצו במהירות על דוושת הרגל, ומיד העבירו את המגלשה לתנאי לחות גבוהים בצלחת פטרי עם מגבת נייר לחה. לאחר חמש עד שש שעות של הנחת המגלשה המכילה עוברים מוזרקים בצלחת פטרי גדולה מרופדת בנייר פילטר לח, הוסיפו טיפה קטנה של מים מזוקקים לתחבושת הסרט השקוף עם עוברים מוזרקים מחוברים. לאחר מכן, מזיזים בעדינות את הביצים באמצעות מכחול.

לאחר מכן, מעבירים את הביצים לצלחת פטרי קטנה ומטביעים אותן במים מזוקקים. השאירו את הביצים שקועות במים, הניחו את צלחת הפטרי בקופסת פלסטיק של שישה ליטרים באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של יותר מ-90%. כאשר הזחל מתחיל לבקוע מהעוברים המוזרקים 21 עד 25 יום לאחר ההזרקה, בדקו אותם מדי יום והעבירו את כל הזחלים שבקעו לבקבוקוני זכוכית עם מסך למעלה.

התוצאות הראו כי הזרקת הביציות בשלב מוקדם של העובר בנות 12 עד 18 שעות, ויישור הציר הארוך יותר של הביצית בניצב לקצה השקופית מביאים לשיעור הישרדות גבוה יותר של הביציות המוזרקות. מתוך כל הביצים שהוזרקו, עד 8.5% שרדו והזחל בקע. לפני תחילת הליך זה, חשוב לזכור את שלבים 2.4, הסרת השעווה מסמן האם, ושלבים 3.1 עד 3.4, ריכוך כוריון העובר עם בנזלקוניום כלוריד, וייבוש העובר בתמיסות נתרן כלורי כדי לאפשר הזרקה מוצלחת של העובר.

שיטה זו פותחה בעיקר לעריכת גנים של קרציות, והיא תאפשר לנו לבצע נוקאאוטים ודפיקות שיעזרו לנו להבין את תפקוד הגן של הקרציות. טכניקה זו תאפשר שימוש בכלי עריכת גנים הזמינים עבור אורגניזמים רבים אחרים כדי ליישם אותם בחקר קרציות. וזה יאיץ את המחקר בביולוגיה מולקולרית של קרציות.