בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית

תאי אנדותל גלומרולריים אימורטליים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית יציבה הם כלי נהדר לבחון את ההשפעה של גירויים שונים על מבנה המיטוכונדריה במבחנה. השיטה המתוארת במאמר הנוכחי מניבה מספר גבוה של תאי אנדותל גלומרולריים. על-ידי בדיקת מולקולות קטנות ב-GEC, אנו יכולים לבדוק מונותרפיה למחלת כליות סוכרתית שבה ה-GECs מושפעים.

השיטה המתוארת קלה לביצוע ואינה דורשת ציוד ספציפי. עם זאת, חשוב לעקוב אחר הצעדים המתוארים לעקר את הציוד כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, מקם את חומרי הפרפוזיה והבידוד הדרושים לבידוד תאי גלומרולריים בכליות בסביבת עבודה.

סנן את תמיסת המלח המאוזנת הטרייה של Hanks's, או HBSS, עם מסנן של 0.2 מיקרון, ושמור אותה מתחת למכסה המנוע כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, מערבבים 200 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים עם 20 מיליליטר של HBSS. הקדימו את ה-RPMI עם 10% FCS ותרבית תאי אנדותל בינונית באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מצפים מראש שתי בארות של צלחת שש בארות עם שני מיליליטר של 10 מיקרוגרם לכל מיליליטר קולגן IV במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS כדי להסיר את החומצה האצטית המשמשת לדילול הקולגן. השתמש בצלחות המצופות מיד, או אחסן אותן בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות.

נקו את כלי הניתוח ואת סביבת העבודה עם 70% אתנול. לאחר מכן, autoclave את כלי הניתוח במשך 30 דקות. לאחר פתיחת הבטן של עכבר מורדם, הכנס מחט פרפר לחדר השמאלי.

כדי להזריק 100 microliters של פתרון חרוז כדי להרחיב את זרימת הדם, בזהירות לשבור את הווריד הנבוב נחות מתחת לכליות עם מחט 19 מד ולהמשיך את הזלוף של תמיסת חרוז. לאחר מכן, בעדינות להסיר את רקמת השומן עם פינצטה, הבלו את שתי הכליות עם מספריים כירורגיים דקים C, ולשים אותם על צלחת עם מיליליטר אחד של HBSS על קרח. טחנו את הכליה באזמל סטרילי לחתיכות קטנות של מילימטר אחד.

דגירה של הכליה הטחונה עם מילימטר אחד של קולגן טרי סוג II במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם הטיה עדינה על שייקר אופקי. לאחר העיכול, להוסיף ארבעה מיליליטר של RPMI עם 10% FBS כדי לנטרל את collagenase. סננו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר.

השתמש בתחתית צינור סטרילי של 1.5 מיליליטר כדי לערבב את הרקמה המעוכלת כנגד המסננת, ומאפשר לגלומרולי לעבור. יש לשטוף את מסננת התאים ב-15 מיליליטר HBSS. לאחר מכן, צנטריפוגה של הזרימה ב-200 XG למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בשלב זה, הצינור מכיל שלוש שכבות. השכבה העליונה מכילה מבנים קטנים יותר כגון צינוריות, השכבה האמצעית היא חרוזים עם גלומרולי, והשכבה התחתונה מכילה פסולת. שאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת השכבה הלבנה העליונה.

לאחר מכן, החזירו את הכדור המכיל חרוזים הנושאים את הגלומרולי והפסולת ב-1.5 מיליליטר של HBSS והעבירו אותו לצינור של שני מיליליטר. מניחים את הצינור ברכז מגנטי ושואפים את הסופר-נטנט לפני שטיפת החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של HBSS. הניחו 20 מיקרוליטרים של תליית תאים על מגלשה.

לאחר מכן, צפו בשקופית מתחת למיקרוסקופ לנוכחותו של גלומרולי. לאחר מכן, לתלות את הכדור במדיום צמיחת תאי אנדותל ולהעביר את ההשעיה לצינור שני מיליליטר. מוסיפים מיקרוליטר אחד של אינטרפרון גמא לכל שלושה מיליליטר של מדיום, ומניחים את התאים בצלחת של שש בארות לדגירה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס.

לאחר שלושה ימים של תרבות, החלף בזהירות את המדיום מיליליטר אחד במדיום טרי. בשלב זה, התאים הטרוגניים עם תערובת של תאים גלומרולריים. לאחר שבעה ימים, החלף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום צמיחת תאי אנדותל טריים, בתוספת אינטרפרון גמא כדי להתחיל את התפשטות התאים.

לאחר 10 ימים, כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, העבירו אותם באמצעות טריפסין והעבירו אותם לתוך בקבוק T-25 המצופה בקולגן IV.לאחר 21 ימים של תרבית, העבירו את התאים לבקבוק T-75. מוסיפים שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין לבקבוק T-75 ומדגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, לנטרל את הטריפסין עם שלושה מיליליטר של מדיום גידול אנדותל ולהעביר את ההשעיה לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה ב 200 XG במשך חמש דקות.

שאפו את הסופרנטנט ושטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS המכיל 1% BSA, EDTA של שני מילימולר, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. שוב, צנטריפוגה ולהשהות את הכדור ב 200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים נוגדן CD31 ו 800 מיקרוליטר של PBS. לדגור על התאים במשך 45 דקות עם רעידות מתמשכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.

לאחר מכן, הניחו את הצינור ברכז המגנטי ושטפו את התאים ארבע פעמים עם PBS המכיל BSA, EDTA ופניצילין/סטרפטומיצין. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחת אנדותל, בתוספת אינטרפרון גמא. צלחת 1.5 מיליליטר של תאים לכל באר בקולגן IV מצופה בארות על צלחת שש בארות ותרבית בתנאים מתירניים ב 33 מעלות צלזיוס.

לאחר ארבעה ימים, להחליף 750 microliters של המדיום עם מדיום צמיחה אנדותל טרי, בתוספת אינטרפרון גמא. לאחר 10 עד 14 ימים של תרבית, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנן של 488 ננומטר, שימו לב לגידול תאי אנדותל גלומרולריים חיוביים CD31, או GECs, מושבות המבטאות מיטוכונדריה פלואורסצנטית. לאחר 21 יום, או כאשר התאים הגיעו למפגש של 80% עד 90%, העבירו אותם לתוך בקבוק T-25.

שמור על התרבות עם מדיום צמיחה RPMI המכיל 10% FCS. לחלופין, תאים יכולים להיות מוקפאים בהקפאה. תאי מעבר באמצעות טריפסין, כפי שהוכח קודם לכן.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ולתלות מחדש את הכדור בשלושה מיליליטר של מדיום הקפאה. Aliquot את התאים בצינורות cryo ולאחסן אותם חנקן נוזלי, טמפרטורת אדים. פרוטוקול זה תיאר שיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים.

מהגלומרולי המבודד, התאים החלו לגדול לאט לאחר שלושה ימים של תרבית. לאחר שבעה ימים, התאים נראו הטרוגניים והראו סוגי תאים גלומרולריים אחרים, כגון פודוציטים, קודקודים, אפיתל ותאים מסנגיאליים. לאחר הגעה למפגש של 70% עד 80%, תאים גלומרולריים אחרים הוסרו באמצעות בחירה חיובית של תאי אנדותל.

ה- GECs של MitoDendra2 ביטאו CD31 והיו שליליים עבור סמן פודוציטים, כפי שמוצג על ידי צביעה שלילית של סינפטופודין. נבדקה השפעת ריכוז הגלוקוז על מבנה המיטוכונדריה. בהשוואה למיטוכונדריה המוארכת הנראית בתאים תחת גלוקוז רגיל, גלוקוז גבוה המושרה פיצול או ביקוע של המיטוכונדריה, כפי שנצפה על ידי מיטוכונדריה בולטת בצורת ספרואידים.

יתר על כן, נעשה שימוש בלייזר בגודל 405 ננומטר כדי לבצע פוטו-המרה של תת-אוכלוסייה נבחרת של מיטוכונדריה ב-MitoDendra2 GEC חי יחיד. מוצג צילום מוצלח של המיטוכונדריה מירוק לאדום באזור שנבחר עבור תאים מטופלים בריכוז גלוקוז תקין וגבוה. מיתוג זה איפשר לחזות באירועי ההיתוך ב- MitoDendra2 GECs.

תחת גלוקוז רגיל, פלואורסצנטיות ירוקה ואדומה ממוזגות צהובות נצפו עקב היתוך מטריצת המיטוכונדריה. לעומת זאת, ב-GECs שטופלו ברמת גלוקוז גבוהה, המיטוכונדריה היו בעיקר מקוטעים. הצבת התאים בבאר אחת של צלחת שש בארות עם נפח קטן של מדיום צמיחה חיונית כדי לאפשר לתאים להתחבר לצלחת.

ניתן להשתמש בתאי האנדותל המבודדים לביצוע תפקוד מיטוכונדריאלי ומחקרים מבניים. השימוש בתאי אנדותל אימורטליים עם תכונות מיטוכונדריה פלואורסצנטיות יסלול את הדרך לגילוי תרופות. המולקולות הקטנות יכולות להיבדק על התאים, ומבוצע הדמיה חיה כדי לבחון את השפעתן על תפקוד המיטוכונדריה.