פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis

זבוב הפירות המזרחי הוא מין מזיק פולש ומסתגל ביותר. שיטות יעילות לחקר גנים פונקציונליים יכולות לעזור לנו לפתח אסטרטגיות הדברה ידידותיות לסביבה. שיטה זו היא יעילות גבוהה ועלות נמוכה.

הפרוטוקול שלנו ישמש כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטיים עבור חוקרי זבוב הפירות המזרחי. כדי להתחיל, לחזות את המבנה של גני המטרה של עניין ולקבוע את הגבולות בין אקסונים ו introns באמצעות ניתוח ביואינפורמטי של הגנום Bactroceras dorsalis. השתמש בערכת הסינתזה של gRNA הזמינה מסחרית כדי ליצור את ה- sgRNA המתוכנן.

יש להשהות את מוצר ה-gRNA במים נטולי נוקלאז. לכמת את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ולאחסן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הכניסו את גלמי B.dorsalis לכלוב פלסטיק, עם תנאי גידול של 55% לחות יחסית, 26.5 מעלות צלזיוס ומחזור אור ליום של 14:10.

כאשר המבוגרים מתרבים, מספקים תערובת של סוכר ושמרים כמזון יחד עם מים. רוב המבוגרים מגיעים לבגרות מינית 10 ימים לאחר הופעתם. השתמש מעמד אור עם אור של 30 עד 50 לוקס כדי לשפר את fecundity של נקבות, ולכן, שיפור היעילות של איסוף העוברים.

לאחר מכן, מקם גזה של 200 רשת בתא ההנעה, במרחק של כ-1 עד 2 מילימטרים ממכסה התא. הכניסו תא אובפוזיציה חדש לכלוב כאשר מערך המיקרו-הזרקה מוכן. אספו את העוברים כל 10 דקות באמצעות מברשת רטובה עדינה והניחו אותם על צלחת הזרקה מתוצרת עצמית.

טבלו את העוברים בשמן הלוקרבון במהלך ההזרקה כדי למנוע ייבוש נוסף. הכן את פתרון העבודה על ידי ערבוב החלבון Cas9 וה- sgRNA המתאים לריכוז של 300 ננוגרם למיקרוליטר של כל אחד מהם. לאחר מכן, להוסיף 1 microliter של פנול אדום לתערובת לשמש כדרך נוחה לסמן עוברים מוזרקים.

מניחים את התערובת המוכנה על קרח כדי למנוע השפלה של sgRNA. הכן את מחט הזרקת הזכוכית באמצעות מושך מיקרופיפטה. מוסיפים 3 מיקרוליטרים של התערובת לתוך מחט ההזרקה מבלי להציג בועות אוויר.

לאחר מכן, פתח את המחט באמצעות Microgrinder וחבר אותה למיקרומניפולטור בהתאם למדריך למשתמש. הגדר את הפרמטרים עבור המזרק כ- Pi ל- 500 הקטופסקלים. Ti ל-0.5 שניות, ו-PC ל-200 הקטופסקלים.

מניחים את הצלחת עם עוברים מרופדים על השולחן האובייקטיבי. לאחר מכן, כוונן את מיקום המיקרופיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי עדין, וקבע את המיקרופיפטה והעובר באותו מישור. הכנס את קצה המחט לתוך הקוטב האחורי, או הצמחי, של העובר.

לאחר מכן, לחץ על הדוושה מהמזרק כדי להעביר את התערובות לתוך העובר. המראה של צבע אדמדם קל נובע תוספת של פנול אדום בתערובת. הכניסו את צלחת ההזרקה עם העוברים המוזרקים לתא אקלים מלאכותי.

לאחר 36 שעות, העבירו את הזחלים שבקעו לתזונת זחלים באמצעות מברשת בעלת קצה דק. אספו את הזחלים שלוש או ארבע פעמים ביום עד שלא יבקעו זחלים נוספים. לאחר מכן, מניחים את הזחלים הבוגרים בחול הרטוב כדי ללבות.

שלב הגורים אורך 10 ימים. לאחר הגור, העבירו את הגלמים לכלוב פלסטיק לפני תחילת ההסתגרות. לאחר בידוד דנ"א גנומי מפופאריום טרי או מרגל אחת של מבוגרים בודדים ותכנון הפריימרים הספציפיים להגברת אזור המטרה, יש לבצע תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, בעקבות תנאי מחזור המתוארים בכתב היד של הטקסט.

לאחר מכן, רצף את מוצרי ה- PCR המטוהרים. זיהוי פסגות חופפות מרובות הסמוכות לאתר היעד מצביע על מוטגנזה מוצלחת. לשיבוט משנה, ערבבו את מוצרי ה-PCR המטוהרים עם וקטור קהה והכניסו אותם ל-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו תאי טרנס-T1 והניחו אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של LB בינוני לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה עם רעידות. צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנטנט.

משחו את הכדור ופזרו אותו על צלחת LB. מניחים את הצלחת לדגירת לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בחר מושבות חיידקים בודדות לריצוף כדי לאמת את הגנוטיפ של המוטנטים.

במחקר זה, הדוגמה של אתר היעד של הגן שנבחר ממוקמת באקסון השלישי. אתר המטרה שמור מאוד, ופס יחיד זוהה על ידי אלקטרופורזה בג'ל עבור תבנית הדנ"א עבור gRNA סינתטי ו- gRNA המתקבל במבחנה. B.dorsalis הישרדות ומוטגנזה לאחר מיקרו-הזרקות מוצגות כאן.

לאחר ריצוף מוצרי ה-PCR, 80% מאנשי ה-G0 הם מוטציות פסיפס. בסינון מוטנטי, המוטנט עם מחיקה של 8 זוגות בסיסים הביא לסיום מוקדם של תרגום חומצות אמינו. החדרת המחט לאזור האחורי או לקוטב הצמחי של העובר היא צעד מרכזי מכיוון שהדבר משפיע ישירות על הישרדות הביציות.

טכנולוגיה זו מספקת התייחסות לחקר תחומים של תפקודי גנים ב- B.Dorsalis הם יכולים ללכוד במהירות את המוטנטים שהם רוצים באמצעות שיטה זו.