Name: הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: למד שיטה יעילה להכנת RNA ארוך מחלקי ציטופלזמה וגרעין בתאי תרבית באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מציע חלופה חסכונית לערכות מסחריות ומאפשר חקר אינטראקציות תוך-תאיות בביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן רוברט ווד ג'ונסון, קרן הצדקה דוריס דיוק, קרן אדוארד פ. אוונס והמכון הלאומי לסרטן (1K08CA230319).

תאי K562 משמשים במחקר הנוכחי. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לעבודה עבור 1 x 10 6-5 x 106 מיליון תאים. עם זאת, ניתן להגדיל את ההליך עבור כמויות תאים גדולות יותר על ידי הגדלת הנפחים כראוי.
1. הכנת חיץ ליזיס 0.25x
<ol><li>הכן מאגר ליזיס 0.25x על-ידי ערבוב הרכיבים הבאים המופיעים בטבלה 1A. הערה: הדגימות דורשות כ- 300 μL של מאגר ליזיס 0.25x. נפח מומלץ = מספר הדגימות x 300 μL.</li>
</ol>2. הפרדת שברים גרעיניים וציטופלזמיים
<ol><li>גלולה את התאים באמצעות צינורות 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 x גרם (טמפרטורת החדר). השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה שואפת. הערה: תאי K562 נוצלו במהלך פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לקווי תאים שונים.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 300 μL של חיץ ליזיס קר כקרח 0.25x. הערה: יש לשמור על קרח למשך 2 דקות ולסובב את הצינור כל 45 שניות כדי להבטיח ליזה תקינה של התאים.</li>
	<li>סובב את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (12,000 x גרם) ב- 4 ° C למשך 2 דקות.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור חדש 1.5 מ"ל. זה יהיה החלק הציטופלזמי. כ 300 μL של החלק הציטופלזמי יושג.</li>
	<li>הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני. הוסף 500 μL של PBS קר כקרח לגלולה ולצנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: במהלך שלב זה, דנ"א עודף מוסר.</li>
</ol>3. ניקוי RNA באמצעות ערכת טיהור RNA
הערה: פרוטוקול זה הושג באמצעות ערכת טיהור RNA זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>הפרידו בין דגימות הרנ"א הציטופלזמי לבין הדגימות הציטופלזמיות הגרעיניות (מכיוון ששלבי השבר משתנים ביניהן).<ol><li>כדי להפריד את החלק הציטופלזמי, הוסף 1,050 μL של חיץ ליזה RLT 3.5x (ראה טבלת חומרים) ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף 750 μL של 90% אתנול וטען אותו על העמוד מתוך ערכת ניקוי RNA. הערה: הפתרון חייב להיות מעורבב היטב לפני הטעינה על העמודה.</li>
		<li>כדי להפריד את החלק הגרעיני, הוסף 600 μL של חיץ ליזה 3.5x ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של 70% אתנול.</li>
	</ol></li>
	<li>טען שברים ציטופלזמיים וגרעיניים על עמודות RNA (ראה טבלת חומרים). הערה: במשך שארית שלב 3, הן הדגימה הציטופלזמית והן הדגימה הגרעינית עוקבות אחר אותו הליך. עם זאת, ודא כי דגימות אלה נשארות בלתי תלויות זו בזו.<ol><li>טען הן שברים ציטופלזמיים והן גרעיניים על עמודות RNA והסתובב במשך 30 שניות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את עודפי הזרימה דרכה.</li>
		<li>הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מערכת טיהור מסחרית (מאגר RW1, ראו טבלת חומרים), סובבו שוב והשליכו את הזרימה.</li>
		<li>הוסף תמיסת DNAse (1U/uL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה, סובבו שוב והשליכו את הזרימה.</li>
		<li>הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה עדין (RPE, ראו טבלת חומרים), סחררו שוב והשליכו את הזרימה. מוסיפים 500 μL של חיץ כביסה עדין, מסתובבים שוב, אבל רק למשך 2 דקות.</li>
		<li>העבר את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסף 30 מיקרוליטר מים לעמוד הסחרור. הניחו לטור לשבת דקה אחת לפני הסיבוב כלפי מטה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. אימות ההפרדה הגרעינית-ציטופלזמית
<ol><li>ביצוע סינתזת cDNA<ol><li>לאחר מיצוי וטיהור תאים תת-תאיים של RNA, אשרו את הפרדת התאים באמצעות qPCR. לשם כך, ראשית, המירו את הרנ"א ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>הכן מאסטרמיקס תמלול הפוך. הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler. הערה: עבור הקסמרים אקראיים, פרמטרי הרכיבה המשמשים מופיעים בטבלה 2A. השתמש מיד בתגובת התעתיק ההפוך או אחסן בטמפרטורה של -20°C (טבלה 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את תגובת השרשרת הכמותית של פולימראז (qPCR) וניתוח.<ol><li>לדלל את סינתזת cDNA עם מי DEPC (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ng/mL.</li>
		<li>באמצעות תערובת מאסטר PCR, הכן את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות כמפורט להלן.</li>
		<li>לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני. השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי (ראה טבלת חומרים). הערה: רצפים עבור MALAT1 ו- TUG1 מוצגים בטבלה 3.</li>
		<li>חשב את הנפח של כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב ב- 3 עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד.</li>
		<li>עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכוש את התערובות הבאות עבור כל אחת מהן: (א) שבר גרעיני עם MALAT1, (ב) מקטע ציטופלזמי עם MALAT1, (ג) שבר גרעיני עם TUG1, ו-(ד) שבר ציטופלזמי עם TUG1 (טבלה 1C).</li>
		<li>מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 μL מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>באמצעות תוכנת תכנון וניתוח (ראה טבלת חומרים), בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור (טבלה 2B).</li>
		<li>באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדר הפעלה (איור משלים 1).</li>
		<li>בדף מאפייני קובץ נתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט מטבלה 2B (איור משלים 2).</li>
		<li>לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר בכרטיסיה צלחת והזן את הדגימות שיש להפעיל (איור משלים 3). בחר התחל הפעלה. הערה: השלבים המתוארים בוצעו במכשיר qPCR באמצעות תערובת אב זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>ביצוע ניתוח נתונים<ol><li>לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות (Cq) (טבלה משלימה 1).</li>
		<li>התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני. החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1 (טבלה 4).</li>
		<li>לאחר מכן, חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 5).</li>
		<li>המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את המקטע הציטופלזמי, החסר את החלק הגרעיני MALAT1 מהמקטע הציטופלזמי MALAT1, ולאחר מכן חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 6). הערה: כאשר מסתכלים על ΔCq, נצפה כי לשבר MALAT1 הגרעיני (הדגשה ירוקה) יש סמן MALAT1 גדול יותר מאשר לציטופלסמה (הדגשה אדומה), אך כעת נדרש אישור כדי להבטיח שהמקטע הציטופלזמי הוא בעיקר ציטופלסמה וכי החלק הגרעיני אינו מכיל זיהום ציטופלזמי.</li>
		<li>עם דגימות TUG1, בצע את אותו חישוב כמו לעיל (שלבים 4.3.2-4.3.4) (טבלה 7). הערה: כשמסתכלים על ΔCq, רואים שלשבר TUG1 הציטופלזמי (הדגשה ירוקה) יש סמן TUG1 גדול יותר מהשבר הגרעיני (הדגשה אדומה), ובכך מאשר הפרדה טובה בין שברים ציטופלזמיים וגרעיניים (טבלה 8, איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li>
<li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+localization+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li>
<li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+separate+nuclear%2C+cytosolic%2C+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li>
<li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+localization%3A+message+on+the+move%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li>
<li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+positioning+system%3A+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li>
<li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((150+years+of+the+mass+action+law%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).</li>
<li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li>
<li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+biogenesis%2C+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhuysen%2C+J-M+%22Bacterial+Cell+Wall%22">Bacterial Cell Wall</a>. , Elsevier. (1994).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Enzyme+Structure+and+Mechanism%22">Enzyme Structure and Mechanism</a>. , (1985).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+win+the+battle+with+RNase%22">How to win the battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li>
<li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selinexor%2C+a+first-in-class+XPO1+inhibitor%2C+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, Supplement 1 233(2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

לאורך הפרוטוקול, ננקטו כמה צעדים כדי לייעל את האלמנטים כדי להיות היעילים ביותר עבור קו התא של עניין. בעוד השלבים בתוך הפרוטוקול הם פשוטים יחסית, ניתוח והתאמות קלות במהלך היבטים קריטיים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין בהתבסס על קו העניין של התא והמטרה התאית. מאחר שניצול חיץ הליזה תלוי במידה רבה בהפרעה של קרומי התא, קיימת שונות טבעית ביעילות של חיץ ליזה על קווי תאים שונים, שכן ישנם הבדלים קלים בשבריריות התא ובחדירות הממברנה בין קווי תאים שונים<sup class="...

שבירה תאית לרכיבים תת-תאיים מאפשרת בידוד ולימוד של תחומים ביוכימיים מוגדרים ומסייעת בקביעת לוקליזציה של תהליכים תאיים ספציפיים וכיצד זה עשוי להשפיע על תפקודם1. בידוד הרנ"א ממקומות תוך-תאיים שונים יכול לאפשר דיוק משופר של ניתוח גנטי וביוכימי של אירועים ברמת השעתוק ואינטראקציות אחרות בין הגרעין לציטופלסמה, המשמש כמטרה העיקרית של פרוטוקול2 הנוכחי. פרוטוקול זה פותח כדי להבטיח בידוד של רנ"א ציטופלזמי וגרעיני, לקבוע את תפקידם בהתאמה בייצוא גרעיני, ולהבין כיצד לוקליזציה תת-תאית של רנ"א בגרעין ובציטופלסמה עשויה להשפיע על תפקודם בתהליכים תאיים. באמצעות שימוש בחומרים מסביבת מעבדה טיפוסית, ניתן היה להשיג שבר גרעיני וציטופלזמי בצורה יעילה יותר וזולה יותר מאשר פרוטוקולים שנקבעו בעבר מבלי לסכן את איכות התוצאות3.
בנוסף, חילופי מולקולות בין הציטופלסמה לגרעין יכולים להיחקר ישירות על ידי הפרדת אזורים אלה. באופן ספציפי יותר, הבנת התמליל חיונית להבנת התפתחות ומחלות. עם זאת, רנ"א עשוי להיות ברמות הבשלה שונות בכל זמן נתון ויכול לסבך את הניתוח במורד הזרם. פרוטוקול זה מאפשר את היכולת לבודד RNA משברים תת-תאיים גרעיניים וציטופלזמיים, מה שיכול לסייע במחקרים של RNA ולאפשר הבנה טובה יותר של RNA מסוים מעניין, כגון לוקליזציה של RNA לא מקודד או ניתוח של צמתים splice בתוך הגרעין.
פרוטוקול זה הותאם לבידוד רנ"א ארוך ציטופלזמי וגרעיני, כולל mRNAs, rRNA ורנ"א ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), בשל סלקטיביות הגודל של עמודת טיהור הרנ"א המנוצלת, הניתנת לשינוי כדי לבודד רנ"א אחרים בעלי עניין. בעבר, תפקודם של רנ"א ארוך, כגון mRNA ו-lncRNAs, היה תלוי מאוד בלוקליזציה שלהם בתוך התא 4,5. לכן, חקר הייצוא מהגרעין לתחומים תת-תאיים נעשה ממוקד יותר לקראת הבנת התפקיד שיכול להיות לייצוא רנ"א או רכיבים תאיים אחרים על התא. lncRNA משמשים דוגמה מצוינת לכך, שכן תרגומם והשפעותיהם לאחר מכן מסתמכים במידה רבה על קרבה ואינטראקציות עם צורות אחרות של RNA6. יתר על כן, חילופי יסודות תאיים בין אזורים גרעיניים וציטופלזמיים קשורים למנגנוני עמידות לטיפולים שונים בסרטן7. בידודם של תאים תוך-תאיים איפשר פיתוח מעכבי יצוא גרעיני, אשר הפחית את ההשפעות של מנגנוני התנגדות לטיפולים שונים8.
לאחר הפרדת RNA גרעיני וציטופלזמי, מבוצעים צעדים לטיהור הרנ"א מעניין. מכיוון שערכות טיהור RNA נמצאות בדרך כלל במעבדות ותפקידן לטהר ולבודד רנ"א ארוך, הן משרתות היטב את מטרת פרוטוקול זה. עבור טיהור RNA, יצירת יחסים של 260:280 גדולים מ-1.8 היא קריטית כדי להבטיח את איכות הדגימות לריצוף RNA או הליכים דומים אחרים הדורשים רמות גבוהות של טוהר ובידוד. ערכים לא סדירים של 260:280 מצביעים על זיהום פנול, מה שמדגים בידוד לקוי ומניב תוצאות לא מדויקות9.
לאחר השלמת טיהור הרנ"א ואושר כי ערכי 260:280 גבוהים מטווח מקובל, נעשה שימוש ב-qPCR כדי לאמת את תוצאות הבידוד של שברים גרעיניים וציטופלזמיים. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. בפרוטוקול זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כסמנים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה10. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1, בעוד שבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר משתמשים ב-TUG1, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני.
באמצעות פרוטוקול זה ניתן היה לבודד רנ"א על סמך מיקום פעולתם בתוך התא. בשל גישה נרחבת לחומרים רבים ושימוש רק בחיץ ליזה ובטכניקות צנטריפוגות מבוססות צפיפות במהלך ניסוי זה, היישום על סוגי RNA אחרים ורכיבים תאיים אחרים הוא נרחב. זה יכול לספק מידע חשוב על ידי שפיכת אור על אירועי ביטוי ספציפיים למיקום שאחרת לא ניתן היה להבחין בהם ללא הפרדה.

<table><tbody><tr><td>Agilent Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>מערכת Agilent TapeStation היא פתרון אלקטרופורזה אוטומטי לבקרת איכות הדגימה של דגימות DNA ו-RNA.</td></tr><tr><td>0.5% Nonidet P-40</td><td>Thermo-Fischer</td><td>28324</td><td>משמש לייצור מאגר ליזה</td></tr><tr><td>50 מ"מ Tris-Cl pH 8.0</td><td>תרמו-פישר</td><td>15568025</td><td>משמש בייצור מאגר ליזה</td></tr><tr><td>MALAT1 GE Assay</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00273907_s1</td><td>משמש לאישור שבר גרעיני.</td></tr><tr><td>צלחת תגובה אופטית 96 בארות של MicroAmp עם ברקוד</td><td>תרמו-פישר</td><td>4326659</td><td>צלחת התגובה האופטית של Applied Biosystems MicroAmp 96 בארות עם ברקוד מותאמת כדי לספק דיוק טמפרטורה ואחידות ללא תחרות להגברת PCR מהירה ויעילה. צלחת זו, הבנויה מחתיכה קשיחה אחת של פוליפרופילן בפורמט של 96 בארות, תואמת למערכות PCR בזמן אמת של 96 בארות ומחזורים תרמיים של Applied Biosystems.</td></tr><tr><td>סרט דבק אופטי MicroAmp</td><td>תרמו-פישר</td><td>4311971</td><td>סרט הדבק האופטי MicroAmp של Applied Biosystems מפחית את הסיכוי לזיהום באר לבאר ואידוי דגימה כאשר הוא מוחל על מיקרו-פלטה במהלך qPCR</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-023</td><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) היא תמיסת מלח מאוזנת המשמשת למגוון יישומי תרבית תאים, כגון שטיפת תאים לפני דיסוציאציה, הובלת תאים או דגימות רקמה, דילול תאים לספירה והכנת ריאגנטים.</td></tr><tr><td>ערכת ניקוי RNA Qiagen-Rneasy Mini Kit</td> ערכות ניקוי RNA <td>Qiagen</td><td>74106</td><td>מאפשרות ניקוי RNA יעיל של תגובות אנזימטיות וניקוי RNA מטוהר בשיטות שונות. כולל מאגרי RW1, RLT, RW1 המוזכרים לאורך כל הפרוטוקול.</td></tr><tr>תוכנת <td>QuantStudio 6</td><td>Thermo-Fischer</td><td>A43180</td><td>qPCR המשמשת במהלך הפרוטוקול. כולל תוכנת תכנון וניתוח לניתוח דגימות פיצול</td></tr><tr><td>מאגר RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>מאגר ליזה מערכת ניקוי RNA</td></tr><tr><td>מאגר RPE מאגר</td><td>כביסה Qiagen</td><td>1018013</td> ערכת <td>ניקוי</td></tr><tr><td>RNA מאגר RW1 מאגר</td><td>Qiagen</td><td>1053394</td><td>מאגר כביסה ערכת ניקוי RNA</td></tr><tr><td>מבחני ביטוי גנים של Taqman</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4331182</td><td>מבחני ביטוי גנים של Applied Biosystems TaqMan מייצגים את האוסף הגדול ביותר של בדיקות מתוכננות מראש בתעשייה עם למעלה מ-2.8 מיליון בדיקות על פני 32 מינים אוקריוטיים וחיידקים רבים. מבחני ביטוי גנים של TaqMan מאפשרים לך לקבל תוצאות במהירות ללא בזבוז זמן באופטימיזציה של פריימרים ירוקים של SYBR וללא זמן נוסף המושקע בריצה וניתוח עקומות התכה.</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4305719</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix הוא פתרון הריאגנט האידיאלי כאשר אתה זקוק לתערובת מאסטר עבור יישומי DNA נוקלאז מרובים בגודל 5 אינץ'. ריאגנטים של אפלייד ביוסיסטמס אומתו עם מבחני TaqMan ומערכות בזמן אמת של אפלייד ביוסיסטמס כדי להבטיח ביצועים רגישים, מדויקים ואמינים בכל פעם.</td></tr><tr><td>TUG1 GE Assay</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00215501_m1</td><td>משמש לאישור שבר ציטופלזמי.</td></tr><tr><td>מים שטופלו במים UltraPure DEPC</td><td></td><td>750024</td><td>מים שטופלו ב-UltraPure DEPC מתאימים לשימוש עם RNA. הוא מוכן על ידי דגירה עם 0.1% דיאתילפירוקרבונט (DEPC), ולאחר מכן עובר חיטוי כדי להסיר את ה-DEPC. סטרילי מסונן.</td></tr></tbody></table>

הכנת rna ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

ההפרדה של רכיבים תוך-תאיים היא כלי מרכזי בביולוגיה התאית כבר שנים רבות, והיא מסוגלת לספק תובנה שימושית לגבי האופן שבו מיקומם יכול להשפיע על תפקודם. בפרט, ההפרדה בין RNA גרעיני וציטופלזמי הפכה חשובה בהקשר של תאים סרטניים והחיפוש אחר מטרות חדשות לתרופות. רכישת ערכות למיצוי RNA גרעיני-ציטופלזמי יכולה להיות יקרה כאשר רבים מהחומרים הדרושים נמצאים בסביבת מעבדה טיפוסית. בשיטה הנוכחית, שיכולה להחליף ערכות יקרות יותר או תהליכים אחרים שגוזלים זמן, נדרשים רק חיץ ליזיס תוצרת בית, צנטריפוגה וספסל ועמודות טיהור בידוד RNA כדי לבודד RNA גרעיני וציטופלזמי. חיץ ליזיס משמש לליזה עדינה של הקרום החיצוני של התא מבלי להשפיע על שלמות מעטפת הגרעין, ומאפשר שחרור מרכיביו התוך-תאיים. לאחר מכן, ניתן לבודד את הגרעינים על ידי צעד צנטריפוגה פשוט מכיוון שהם בעלי צפיפות גבוהה יותר מתמיסת הליזיס. צנטריפוגה משמשת להפרדת אזורים אלה בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם כדי לבודד יסודות תת-תאיים בגרעין מאלה שבציטופלסמה. לאחר שהצנטריפוגה בודדה את הרכיבים השונים, נעשה שימוש בערכת ניקוי RNA לטיהור תכולת הרנ"א, ומתבצע qPCR כדי לאמת את איכות ההפרדה, המכומתת על ידי כמות הרנ"א הגרעיני והציטופלזמי בשברים השונים. הושגו רמות מובהקות סטטיסטית של הפרדה, הממחישות את יעילות הפרוטוקול. בנוסף, ניתן להתאים מערכת זו לבידוד סוגים שונים של RNA (סה"כ, רנ"א קטן וכו'), מה שמאפשר מחקר ממוקד של אינטראקציות ציטופלסמה-גרעין, ומסייע בהבנת ההבדלים בתפקוד הרנ"א השוכנים בגרעין ובציטופלסמה.

כדי להבטיח בידוד גרעיני וציטופלזמי, בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. במחקר זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כפריימרים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1 כבקרה חיובית עבור יסודות גרעיניים, בעוד ששבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר TUG1 קיים כבקרה חיובית עבור יסודות ציטופלזמיים, אז רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני. ניתן לראות זאת <strong...

הפרוטוקול הנוכחי מציע שיטה יעילה וגמישה לבודד RNA משברים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות תאים בתרבית, ולאחר מכן לאמת באמצעות qPCR. זה משמש למעשה כתחליף לערכות הכנת RNA אחרות.

הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

פרוטוקול זה נחוץ כדי להעריך את התפקידים השונים של יסודות ביוכימיים מוגדרים בגרעין ובציטופלסמה ולנתח אינטראקציות תוך-תאיות בין תחומים אלה בתוך שורות תאים שונות. טכניקה זו משתמשת בציוד מעבדה שגרתי וריאגנטים כדי להפריד בצורה יעילה יותר את השברים הציטופלזמיים והגרעיניים. פרוטוקול זה יכול לעשות זאת בזול יותר ומהר יותר מפרוטוקולים אחרים.ככל שמחקרים על אינטראקציות ציטופלזמיות וגרעיניות הופכים נפוצים יותר, ההשפעה של לוקליזציה על אירועים תוך תאיים יכולה להיות מובנת טוב יותר. ניתן לנתח את חילופי הדברים בין הציטופלסמה לגרעין, ולציין אם מולקולות מסוימות במהלך חילופי דברים אלה יכולות להוביל להתפתחות סרטן, כפי שציינו מחקרים על חלבונים גרעיניים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין.מכיוון שהשימוש בחיץ ליזיס תלוי במידה רבה בהפרעה של קרום התא ויש גרסאות טבעיות ביעילות של חיץ ליזה על קווי תאים שונים. כדי להתחיל, גלולה את התאים, באמצעות צינורות 1.5 מיליליטר באמצעות צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2000 G.להשליך את supernatant באמצעות פיפטה שאיפה. להשהות את הגלולה ב 300 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח.לאחר מכן, סובב את הצינורות במהירות של כ -12, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש. הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני.לאחר מכן, להוסיף 500 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לגלולה וצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי לאשר את הפרדת התאים באמצעות qPCR, ראשית, להמיר את הרנ"א לדנ"א משלים באמצעות ערכה זמינה מסחרית. הכינו תערובת מאסטר של תעתיק הפוך.הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler. המשך לביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותי וניתוח.התחל עם דילול סינתזת cDNA עם מי DEPC כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר. באמצעות תערובת מאסטר PCR, להכין את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות. לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני.השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי. חשב את נפח כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב בשלושה עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד. עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכשו את החלק הגרעיני המעורבב עם MALAT1, חלק ציטופלזמי עם MALAT1, שבר גרעיני עם TUG1 ושבר ציטופלזמי עם TUG1.מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית. כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 כפול G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות תוכנת תכנון וניתוח, בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור.באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדרת הפעלה. בדף מאפייני קובץ הנתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט. לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר את כרטיסיית הצלחת והזן את הדגימות להפעלה.בחר התחל הפעלה. לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות. התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני.החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1. המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הציטופלזמי. החסרו את השבר הגרעיני MALAT1 מהשבר הציטופלזמי MALAT1 ולאחר מכן חשבו את השניים שהועלו לדלתא CQ שלילי. בצע את החישובים באמצעות דוגמאות TUG1.כאשר TUG1 נוכח כבקרה חיובית עבור יסודות ציטופלזמיים, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני. תוצאה שלילית שבה רמות של שבר ציטופלזמי נצפים במדגם עם MALAT1. הדבר מצביע על זיהום של RNA שבודד מהחלק הגרעיני, אולי בגלל ריכוזי ליזה נמוכים מדי או גבוהים מדי.MALAT1 ו- TUG1 הציגו את המתאם הגבוה ביותר עם הפרדה גרעינית וציטופלזמית כפי שאושר באמצעות אלקטרופורזה של כתם מערבי ו- RNA, שאישרו את טוהר ואיכות הדגימות. בנוסף, ניתן להדגים את טוהר התמציות הגרעיניות והציטופלזמיות על ידי כתם מערבי המשתמש בלמין כסמן לשבר גרעיני ובאלפא-טובולין כסמן חיובי למקטע הציטופלזמי. לא נצפה שיא באלקטרופורזה של הרנ"א הציטופלזמי, מה שמדגים איכות גבוהה וזיהום מועט או ללא זיהום כלל בדגימת הרנ"א הציטופלזמי.השימוש במאגר ליזה הוא קריטי לשבירה נכונה ואופטימיזציה של ריכוז חיץ הליזיס לקו העניין הרצוי של התא היא חיונית. טכניקה זו מאפשרת מחקר ממוקד של אינטראקציה גרעינית וציטופלזמית, אשר ישימה באופן נרחב למגוון נושאי מחקר ומאפשרת הבנה טובה יותר של האופן שבו לוקליזציה של אלמנטים ביולוגיים ספציפיים עשויה להיות קשורה לתפקודם.

preparation-cytoplasmic-nuclear-long-rnas-from-primary-cultured

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

שיטה זו נפתחים RNA מאפשר זיהוי המטרות RNA של RNA לונג ללא קידוד (lncRNA). על סמך הכלאה תוצרת בית, מעוצב תחושה אנטי DNA oligonucleotide הגששים הספציפי הזה lncRNA רקמות כראוי קבוע או שורת התאים, ביעילות מאפשר לכידת כל המטרות RNA של lncRNA.

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

כאן, אנו מציגים גישה ביולוגית ואנליזות כדי לזהות את הביטוי LINE-1 ברמה מסוימת.

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

למד שיטה יעילה להכנת RNA ארוך מחלקי ציטופלזמה וגרעין בתאי תרבית באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מציע חלופה חסכונית לערכות מסחריות ומאפשר חקר אינטראקציות תוך-תאיות בביולוגיה מולקולרית.

הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית

גלה סרטונים נוספים