מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

אז למה הפרוטוקול הזה משמעותי? ובכן, גרורות במוח מאתגרות מאוד לטיפול והפרוטוקול הזה מייצר מודל עכבר רלוונטי מבחינה קלינית עם גידולים חוץ-גולגולתיים מינימליים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח אובייקטיבי של הפצת תרופות ותגובה מגידולים תוך גולגולתיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמודל ניתן לשחזור רב והגרורות במוח מתפתחות תוך זמן קצר יחסית לאחר ההזרקה. התקדמות המחלה דומה בקרב בעלי חיים, מה שמקל על החוקרים לתקנן את הניסויים, את לוחות הזמנים של הטיפול ואת נקודות הקצה. העצה שלי למתחילים היא לתרגל שימוש במלקחיים ובמזרק תוך כדי התבוננות במיקרוסקופ הדיסקציה, היכרות עם ציוני הדרך האנטומיים סביב הצוואר ותרגול הפרוטוקול בנוכחות וטרינר.

התחל על ידי זריעת תאי סרטן BT-474 בצפיפות זריעה של פעמיים 10 לששת התאים לתוך בקבוק T-75 באמצעות 10 מיליליטר של מדיית גדילה מלאה ותרבית עד שהתאים מגיעים למפגש של 70 עד 80% לפני ההזרקה. ביום ההזרקה, יש להשליך את מדיית הגדילה ולשטוף את המונולייר של התא עם PBS פעמיים ולהוסיף חמישה מיליליטר של מגיב דיסוציאציה של תרבית תאים שחוממה מראש. לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות או עד שהתאים מתנתקים.

לאחר חמש דקות, הסר את הבקבוקון מהאינקובטור והקש עליו בעדינות כדי לסייע בניתוק התא. הוסף חמישה מיליליטר של מדיית צמיחה מלאה המכילה 10% FBS כדי להרוות את פעילות מגיב הדיסוציאציה. השהה בעדינות את התאים בתמיסה על-ידי צנרת כדי להפחית את גושי התאים.

מעבירים את מתלה התא לצינור של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-180 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. דקנט את הסופר-נטנט והושיע מחדש את כדור התא ב-10 מיליליטר של HBSSS ללא סידן ומגנזיום כדי למזער את התגבשות התאים. צנטריפוגה של תרחיף התא ב 180 G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר Decant את supernatant כדי להסיר סרום שיורי או מגיב דיסוציאציה ולתלות מחדש את גלולת התא בשלושה מיליליטר של HBSS.

מניחים מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר על צינור חרוטי טרי בקוטר 50 מיליליטר ומעבירים את תרחיף התאים דרך כדי להסיר גושים של תאים. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות כחול טריפאן ודלל את תרחיף התאים עם HBSS לריכוז תאים של 2.5 כפול 10 לשישה תאים למיליליטר. השאירו את הצינור אופקי על קרח ונדנדו בעדינות את הצינור מעת לעת כדי למזער גושים.

ניתן לאחסן את תרחיף התא על קרח למשך שש שעות לכל היותר. עכבר אגרוף אוזניים לזיהוי ושימוש בקוצץ חשמלי כדי לגלח את הפרווה מאזור הצוואר. נקו את עודפי השיער מהעור החשוף באמצעות סרט הדבקה.

יש למרוח חומר סיכה עיני על העיניים כדי למנוע התייבשות. אבטח את העכבר בעדינות על ידי חיבור השיניים החותכות העליונות באמצעות חוט המודבק ללוח הניתוח, ולאחר מכן הקשה על הרגליים הקדמיות והאחוריות. צעד זה מאריך את הגוף ושומר על הצוואר ישר במהלך ההליך.

להכנת העור לפני הניתוח, נגבו את הצוואר בחומר חיטוי מקומי כגון יוד פובידון כדי להפחית את עומס המיקרופלורה של העור ולהסיר שיער רפוי. נקי ממרכז העור, עובד כלפי חוץ כדי למנוע זיהום מחדש של אתר החתך. חזור על התהליך באמצעות 70% אתנול ובצע שלושה סבבים מתחלפים של יוד ואתנול לחיטוי.

בדוק רפלקס באמצעות בדיקת צביטה כדי להבטיח את מוות בהרדמה לפני המשך ההליך. הניחו וילון כירורגי סטרילי מעל החיה. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, בצע חתך אנכי של 15 מילימטר לאורך קו האמצע באזור הצוואר של העכבר באמצעות מספריים, החל מחמישה מילימטרים מתחת ללסת ועד למפרצון בית החזה.

באמצעות שני זוגות של מלקחיים זוויתיים, יש להפריד את העור ואת בלוטות הרוק שמתחתיו ולמרוח retractors כדי לשמור על קנה הנשימה חשוף. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בזווית עדינה, יש לנתח בבוטות את רקמת השריר והשומן הסמוכה לקנה הנשימה ולחשוף את נדן הצוואר הימני. נדן הצוואר הוא השכבה הסיבית המכסה את עורק הצוואר המשותף, הווריד והעצב התועה, וניתן לדמיין צרור זה על ידי עורק הצוואר המשותף האדום הבוהק.

יש לנקות מקטע של עורק הצוואר המשותף לביפורקציה הקרוטידית של החיתולית שמסביב ולהפריד אותה מהעצב התועה והוורידים. לבודד ולנקות את bifurcation carotid מן העצבים שמסביב fascia. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר החיצוני והעבירו תפר משי 5-0 מתחת לעורק.

קשרו והדקו את התפר וחתכו את הקו העודף. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר המשותף והעבירו תפר משי 5-0 מתחת לעורק. קושרים קשר ומהדקים את התפר במיקום פרוקסימלי לאתר ההזרקה המוצע.

חותכים את התפר העודף, ומשאירים כ -10 מילימטר של הקו. חותכים ומרטיבים רצועה של מגבים חד פעמיים בעלי מוך נמוך בגודל של כ-10 על 5 מילימטרים. מקפלים את הרצועה ומניחים אותה מתחת לעורק הצוואר באתר ההזרקה המוצע.

זה יתמוך בכלי במהלך ההזרקה. על עורק הצוואר המשותף rostral לאתר ההזרקה המוצע, למקם קשירה שלישית עם קשר רופף. זה מתהדק רק לאחר ההזרקה.

התסיס בעדינות את תרחיף התאים ושאב 200 מיקרוליטרים של תרחיף תאים לתוך מזרק אינסולין עם מחט 31 מד. טען את המזרק לתוך דרייבר המזרק המחובר לדוושת הרגל המפעילה. חברו צינורית עדינה עם מחט בעלת 31 מדים למזרק והגדילו את הקו.

בדוק אם עורק הצוואר ממוקם היטב בלחץ. באמצעות שני מלקחיים בעלי זווית עדינה, האחד מותח בעדינות על קצה הליגטורה הראשונה והשני אוחז במחט בעלת 31 המדים, מחדירים באיטיות את המחט עם השיקוע למעלה לתוך לומן של כלי הדם, תוך הקפדה שלא לנקב אותה. הזריקו באיטיות 100 מיקרוליטרים של תרחיף תאים שהוכנו מוקדם יותר לעורק הצוואר המשותף במהירות של 10 מיקרוליטר לשנייה.

זה יספק 2.5 פעמים 10 לתאים החמישי לתוך כלי הדם. הזרקה מוצלחת ניתן לדמיין באמצעות ניקוי של דם מכלי הדם carotid. הרימו והדקו בעדינות את הליגטורה הרופפת מיד לאחר משיכת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת ודימום.

חותכים עודפי תפרים ומסירים את חתיכת המגבים החד-פעמיים הלחים בעלי מוך נמוך. באמצעות פיפטה P-200, לשטוף את חלל הניתוח פעמיים עם 150 עד 200 microliters של מים סטריליים או מלוחים. לאחר בדיקת דימומים, מקם מחדש את הרקמה הרכה, בלוטות הרוק והעור מעל עורק הצוואר וקנה הנשימה.

יש לסגור את שכבת העור של החתך באמצעות מחזיק מחט תפר, מלקחיים ותפר מונופילמנט 6-0 נספג או לא נספג בתבנית רציפה. להזריק 50 מיקרוגרם לקילוגרם של בופרנורפין ומיליגרם אחד לקילוגרם של מלוקסיקם באמצעות הזרקה תת עורית כהקלה על כאבים לאחר ניתוח. העבירו את החיה לכלוב חם ונקי כדי להתאושש מההרדמה.

לקטין הוזרק לעורק הצוואר המשותף של העכברים עם או בלי קשירת עורק הצוואר החיצוני. ירידה בלקטין נצפתה ברקמות הלחי כאשר עורק הצוואר החיצוני היה קשור. התוצאות הראו כי הקשירה לא השפיעה על העברת המוח.

התקדמות הגידול הייתה במעקב באמצעות קו תאי סרטן השד המבטא לוציפראז, HER2. מודל הגרורות במוח BT474 הראה עלייה באותות הביולומינסנטיים מהשבוע החמישי לאחר הזרקת הצוואר הפנימית וגדל בהדרגה לאחר מכן. משבועות חמש עד שמונה, עוצמת האות ההטרוגנית הצביעה על גידול תוך גולגולתי עם זליגת נוזלים מורכבת.

ריכוז גדוליניום באזור הגידול עלה ככל שהוא דלף ממחזור הדם לרקמת הגידול. הצטברות של ננו-רפואה וגרורות במוח אושרה בעכברי BT-474 על ידי רמות ננו-רפואה גבוהות יותר שזוהו באזור הגידול בהשוואה לאזורי המוח הלא מעורבים. ככל שמודל הגרורות במוח BT-474 התקדם, בעלי חיים החלו לאבד עד 20% ממשקל הגוף, מה שהפך את זמן ההישרדות החציוני תשעה שבועות לאחר ההזרקה.

תוצאות ההיסטולוגיה תיארו כי הגידולים היו ממוקמים באופן חד צדדי, והתאימו לאתר הזרקת הצוואר שבו הגידולים הופיעו בעיקר כמסות מוצקות ובודדות. כיסים של חללים ריקים נצפו לעתים קרובות והורכבו מתאים נמקיים, בעוד שגידולים קטנים יותר היו נוכחים גם אצל חלק מבעלי החיים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים את הפרוטוקול הוא להכין ולמקם את עורק הצוואר בצורה נכונה לפני החדרת המחט, ולאחר מכן להפעיל מתח מתאים במהלך החדרת המחט.

מודל זה שימושי לחוקרים החוקרים אספקת תרופות למוח ואת היעילות של הטיפולים החדשים לטיפול בגרורות במוח.