שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

העבודה שלנו מקרבת את מאמצי השחזור של ציטוסקלטון צעד חשוב קרוב יותר לחיקוי התנאים התאיים על ידי הנדסת חומרים מרוכבים של אקטין ומיקרוטובולים, המונעים על ידי מנועי קינזין ומיוזין כדי לכוונן, לבנות מחדש ולנוע באופן פעיל. ניתן לתכנת במדויק את הדינמיקה והמבנה של החומרים המרוכבים שלנו על ידי הוספה, הסרה וכוונון עצמאיים של הרכיבים השונים כדי להציג בסיס פאזה עשיר של התכווצות, זיהום, השחתה, גסות וקרע. הגישה שלנו ישימה באופן נרחב לתכנון, יצירה ואפיון של פלטפורמות חומר פעיל המשלבות רכיבים מחוללי כוח מרובים הפועלים על מצעים שונים במערכת אחת.

מי שידגימו את ההליך יהיו דייזי אצ'ירילואיי ומאיה הנדיה. חוקרים לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הוסף את הריאגנטים לצינור מיקרו-צנטריפוגה שחור סטרילי של 1.5 מיליליטר באמצעות מיקרו פיפטה וקצות פיפטה סטריליים כדי ליצור אשכולות מוטוריים של Kinesin הקושרים ומפעילים כוחות בין זוגות של מיקרוטובולים.

מערבבים בעדינות על ידי ניפוח התמיסה למעלה ולמטה. ואז לדגור את הפתרון במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להגן עליו מפני האור. כדי להכין רשת מורכבת של חוטי אקטון ומיקרוטובולים, הגדר את בלוק החום ל-37 מעלות צלזיוס.

הוסף את הריאגנטים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 0.6 מיליליטר. ודא כי הנפח הכולל הוא 25 microliters. פיפטה עדינה של התמיסה למעלה ולמטה כדי לערבב אותה ולהניח אותה על בלוק החום של 37 מעלות צלזיוס המוגן מפני אור למשך שעה.

לאחר מכן, להסיר את הצינור מן בלוק החום ולהשתמש מיקרו פיפטה לערבב בעדינות 0.84 microliters של 100 micromolar Phalloidin. יש לדגור במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. כדי להכין חומרים מרוכבים פעילים להדמיית conf focal, הוסף את הריאגנטים לתמיסה וערבב בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.

חלקו את התמיסה לשלושה אליקוטים של 10 מיקרוליטרים ותייגו אותם כ-K, K פלוס M ובקרה שלילית. הוסף 2.54 מיקרוליטרים של מיוזין ל- K בתוספת M aliquot ו- 2.54 מיקרוליטרים של PEM ל- K ואליקוטים של בקרה שלילית. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של אשכולות קינסין ל-K ו-K בתוספת אליקוטים M ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.

לאחר מכן, הוסף 2.5 מיקרוליטר של PEM לבקרה השלילית באמצעות אותה טכניקה. השתמש במיקרופיפטה כדי להזרים באיטיות כל תמיסה לתעלה המתאימה של תאי הדגימה באמצעות פעולה נימרית. דחפו למטה לאט מאוד ובעדינות על הפיפטה כדי לא להכניס בועות אוויר לתעלה.

אטמו את שני הקצוות הפתוחים של כל תעלה עם דבק אפוקסי או דבק הניתן לריפוי UV המתייבש במהירות. כאשר הדבק יבש לחלוטין, הניחו את התעלה על המיקרוסקופ כדי לדמות את התרכובת קרוב ככל האפשר למצב הלא פעיל הראשוני. צלם תחילה את ערוץ K וערוצי K פלוס M ואחריהם ערוץ הבקרה.

שים לב לזמן שחלף בין הוספת אשכולות Kinesin ל- K ו- K בתוספת M aliquots ותחילת רכישת הנתונים. כדי להכין אקטין לאקטין או ל-AA crosslinkers, הוסיפו ביוטין-אקטין, NeutrAvidin, ביוטין ו-PEM לצינור מיקרו-צנטריפוגה וערבבו אותם בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. באופן דומה, עבור מיקרוטובולים למיקרוטובולים או ל-MM crosslinkers, הוסיפו ביוטין-טובולין, NeutrAvidin, ביוטין ו-PEM לצינור מיקרו-צנטריפוגה וערבבו אותם בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.

עטפו את הצינור בסרט תקרה תרמופלסטי כדי ליצור אטימה אטומה למים והניחו אותם ברפסודת ציפה באמבט סוניקטר מבוקר טמפרטורה, שנקבע לארבע מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. כדי לשלב קומפלקסים של A-A crosslinker בדגימות להדמיה, הוסף את הריאגנטים לצינור מיקרו-צנטריפוגה. ודא שהנפח הכולל הוא 25 מיקרוליטר.

באופן דומה, עבור קומפלקסים של M-M crosslinker, הוסף את הריאגנטים המוצגים על המסך לצינור מיקרו-צנטריפוגה. מערבבים את התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה ומניחים אותה על בלוק החום של 37 מעלות צלזיוס המוגן מפני אור למשך שעה. לאחר מכן, להסיר את הצינור מן בלוק החום ולהשתמש מיקרו פיפטה לערבב 0.84 microliters של 100 micromolar Phalloidin.

יש לדגור במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור ולחזור על ההליך שהוצג קודם לכן כדי להכין חומרים מרוכבים פעילים להדמיה קונפוקלית. מונופייבר אקטין ודימרים של טובולין עוברים פולימריזציה משותפת ליצירת רשתות סבוכות של חוטי אקטין ומיקרוטובולים. מיוזין שני חוטי מיני ואשכולות קינסין דוחפים ומושכים את החוטים כדי להוציא את החומרים המרוכבים ממצב יציב.

קישור צולב פסיבי מושג באמצעות NeutrAvidin כדי לקשר חוטי אקטין ביוטינילציה או מיקרוטובולים. מיוזין שני חוטי מיני, אשכולות קינסין, או שני המנועים משולבים בחומרים מרוכבים ללא קישורים צולבים פסיביים, קישורים צולבים של אקטין-אקטין וקישורים צולבים של מיקרוטובול-מיקרוטובול. מוצגת כאן הדמיה קונפוקלית בשני צבעים של שלדי ציטוסקלטון מונעי מיוזין עם ריכוזי מיוזין משתנים ושברי אקטין טוחנים.

velocimetry תמונת חלקיקים מראה כי פעילות אקטין מיוזין מפעילה דינמיקה התכווצות מתואמת של אקטין ומיקרוטובולים במרוכבים סבוכים. כאן, צבעי חצים שונים מתאימים למהירויות שונות כפי שמצוין בסולם הצבעים מימין לשדות הווקטוריים. מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית שנפתרה בזמן מבוצעת על ערוצי מיקרוטובול ואקטין של סדרות זמן כדי לקבוע מאפיינים של זמני דעיכה לעומת מספר גל הן עבור אקטין והן עבור מיקרוטובולים.

מהירויות הכיווץ נקבעות באמצעות עקומות זמן התאמה לדעיכה, הממוצעות על פני כל זמני ההשהיה לכל משך הזמן של כל סדרת זמן של 45 דקות. מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית שנפתרה בזמן מכמתת את האופן שבו הדינמיקה משתנה לאורך זמן על ידי הערכת זמני דעיכה עבור מרווחים רצופים של שש דקות במהלך זמן ההפעלה של 45 דקות עבור אקטין ומיקרוטובולים. מהירויות כיווץ של זמן עבור חוטי אקטין ומיקרוטובולים נקבעות מהתאמות לעקומות זמן דעיכה תואמות.

ניתוח מתאם אוטומטי של תמונה מרחבית מכמת את הארגון מחדש המונע על ידי מנוע של רכיבים ציטוסקטליים פעילים על ידי השוואת עקומות מתאם אוטומטיות עבור הרשתות השונות בתחילת הניסוי בהשוואה לסוף. אורכי מתאם שנפתרו בזמן שנקבעו באמצעות התאמות מעריכיות של עקומות מתאם אוטומטי מראים מרוכבים שאינם נבנים מחדש בהשוואה לאלה שבונים מחדש באופן משמעותי. שתי תמונות קונפוקליות צבעוניות של חומרים מרוכבים של אקטין מיקרוטובול המונעים על ידי קינסין מראות ארגון מחדש תלוי ניסוח לאורך זמן ללא חומרים מרוכבים צולבים המשלבים מחדש לאשכולות עשירים במיקרוטובולים המחוברים באופן רופף.

קישור צולב של אקטין-אקטין תומך בלוקליזציה של קו-לוקליזציה של מיקרוטובול אקטין, בעוד שקישור צולב של מיקרוטובול-מיקרוטובול משפר את הערבוב של D. מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית וניתוח מתאם אוטומטי של תמונה מרחבית מראים את ההשפעה של מנועים מוצלבים ומתחרים של מיצין וקינסין על הדינמיקה והמבנה המשתנים בזמן של החומרים המרוכבים. כדי לחקות את התנאים התאיים באופן הדוק יותר, חוקרים יכולים לשלב חוטי ביניים, מנועים אחרים וחלבונים קושרים השולטים באורכי החוטים ובקשיחותם.

ניתן לבצע מדידות מטרולוגיות של פינצטה אופטית גם כדי לאפיין מכניקה מרוכבת. באמצעות הגישה שלנו, חוקרים יכולים לכוונן במדויק את הדינמיקה והמבנה של חומר פעיל מרוכב בהשראת ציטוסקלטון על פני מרחב פאזה חסר תקדים כדי לחקות תהליכים תאיים מגוונים ולהנדס חומרים הניתנים לתכנות מחדש.