אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

ATAC-seq מאפשר לנו לזהות את המצב של אזורי הכרומטין הפתוחים בגנום, אשר משתנה לעתים קרובות במצבי המחלה בהשוואה למצב הרגיל. פחות קלט תאים, פרוטוקול פשוט של עיכול Tn5, ואחריו בידוד של DNA מקוטע והכנת ספרייה על ידי הגברת PCR וזמן ניסוי קצר יותר הופכים אותה לטכניקה מועילה יותר. השוואה של הנוף האפיגנטי שהשתנה על ידי ATAC-seq בין מצב תקין למחלה יכולה לשפוך אור על האלמנטים הרגולטוריים הקשורים לכרומטין הקשורים למחלה ולהיות שימושית לתכנון אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

טכניקה זו קלה לביצוע, שכן היא אינה כוללת צעדים ניסיוניים קריטיים. כדי לקבל תוצאות ATAC-seq מוצלחות, זה דורש רק כמה שלבי סטנדרטיזציה. כדי להתחיל, להעביר 25 מיקרוליטר מתשיל תאים המכיל מיליון תאים למיליליטר ב- PBS לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מיליליטר וצנטריפוגה ב- 500 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בזהירות להשליך את supernatant, ולהוסיף 25 microliters של חיץ תזה. השעו מחדש את התאים על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה, ודגרה על קרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהשליך בזהירות את supernatant.

מיד להשעות מחדש את הכדור ב 25 microliters של תערובת תגובה Tn5, ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבבים את התמיסה כל 10 דקות. הוסף חמישה מיקרוליטרים של נתרן אצטט 3-טוחן ו-125 מיקרוליטרים של PB חיץ לתמיסת הדנ"א המתויגת Tn5.

מערבבים היטב. לאחר מכן, מקם את עמודת הספין בצינור איסוף של 2 מיליליטר, והחל את הדגימה על עמודת הספין. צנטריפוגה ב-17, 900 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשליכו את הזרימה.

הוסף מאגר PE לעמודה וסובב את העמודה. החזירו את עמוד הספין לאותה שפופרת איסוף, וסובבו אותו במשך חמש דקות כדי לייבש את הממברנה לחלוטין. השליכו את הזרימה, והניחו את עמודת הספין בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.7 מיליליטר.

שטו את מקטעי הדנ"א עם 10 מיקרוליטרים של EB חיץ, ותנו לעמוד במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן צנטריפוגה ב 17, 900 G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לרומם את הדנ"א. הגדר את תגובת ה- PCR בצינורות PCR של 200 מיקרוליטר, ובצע תוכנית הגברה של PCR חלק ראשון.

עבור QPCR בזמן אמת, הכינו את תערובת התגובה של PCR על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR, 0.75 מיקרוליטרים של 1, זהב SYBR מדולל פי 000, חמישה מיקרוליטרים של 2X PCR Master Mix ו-3.75 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאזות. קבע את המספר הנדרש של מחזורי PCR נוספים באמצעות פרמטרי ההפעלה. לאחר קביעת מספר המחזור, הגדר PCR עם המחזורים הנוספים שחושבו קודם לכן.

למוצרי ה-PCR המוגברים, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של חרוזים, ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי למשך חמש דקות, ומסירים בזהירות את הסופרנטנט. לשטוף את החרוזים עם 200 microliters של 80% אתנול, ולהסיר את supernatant.

יש להסיר את האתנול לחלוטין, ולייבש את הדגימות באוויר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, להשעות מחדש עם 50 microliters של חיץ elution. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי, ולאחר מכן העבירו את ה-eluate לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.7 מיליליטר.

כאן מוצגת השוואה של יעילות תזה של תאים באמצעות טריפאן כחול. תאי NMuMG טופלו בחיץ היפוטוני ובמאגר CSK והוכתמו בכחול טריפאן. יעילות תזה גבוהה יותר נצפתה בתאים שטופלו ב-CSK.

ספריות ATAC-seq הוכנו מתאי סרטן שד MDA-MB-231. לאחר הגברת PCR, מוצרי PCR נותחו על TBE 0.5X, 1.5% ג'ל אגרוז לפני ואחרי טיהור חרוזים. פריימרים מוסרים בעיקר על ידי טיהור החרוזים הראשוני.

כמו כן מסומנות תבניות פס דנ"א מאלקטרופורזה של ג'ל 1X TAE 1%agarose ואלקטרופורזה אוטומטית. SYBR Gold שימש כדי לדמיין את מקטעי הדנ"א המוצגים כאן. מסלול דפדפן גנום המציג את מוקד ERS1 מוצג כאן.

כיסוי הגנום של נתוני ATAC-seq בתאי T47D מוצג בתמונה זו. נעשה שימוש בפריימרים מפרסום קודם, ואזורי היעד שלהם מודגשים בצהוב. גרף עמודות המתאר העשרת אמפליקון פריימר בספריות ATAC-seq מוצג כאן.

ספריות ATAC-seq הוכנו על ידי חיץ היפוטוני או מאגר CSK. התמונה המייצגת מציגה את הדמיית דפדפן הגנום לאופטימיזציה של ATAC-seq. נתוני ATAC-seq ממצב הקלט של 25, 000 תאים הראו את ההעשרה הגבוהה ביותר של מקטעים נטולי נוקלאוזומים, בעוד שתנאי הקלט של 100, 000 תאים הציג את ה- DNAs המונונוקלאוזומליים הגבוהים ביותר.

מסלולי דפדפן גנום המציגים נתוני ATAC-seq ממספרי תאים שונים מוצגים כאן. ניתוח ביאור שיא HOMER מתואר בתמונה מייצגת זו. HOMER סיווג כל פסגה כפסגה פרוקסימלית או דיסטלית.

מספר בחירת קלט התא של מאגר תזה התא וריכוז האנזים Tn5 התלוי בסוג התא הם הפרמטר הקריטי ביותר שיש לתקנן. Tn5 שהתמזג עם חלבון A בטכניקת החיתוך והתיק נמצא בשימוש נרחב לזיהוי אתר קשירת DNA עבור חלבון מעניין באמצעות נוגדנים ספציפיים לאותו חלבון מעניין.